電泳圖譜的圖像分析PPT精品文檔

1、1電泳圖譜的圖像分析電泳圖譜的圖像分析2回顧Functional analysisState 1State 22DEPMFMS/MSLC-MS/MSDatabase searchDifferential analysis?3電泳圖譜的圖像分析簡(jiǎn)介what can we get from image analysis?雙向凝膠電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究的主要技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究的主要技術(shù)之一之一, , 雙向電泳根據(jù)等電點(diǎn)和分子量可一次性分離雙向電泳根據(jù)等電點(diǎn)和分子量可一次性分離數(shù)千種蛋白質(zhì)，經(jīng)染色后蛋白質(zhì)再數(shù)千種蛋白質(zhì)，經(jīng)染色后蛋白質(zhì)再PAGEPAGE上可形成密上可形成密度不同

2、、分布不均的復(fù)雜點(diǎn)圖譜。度不同、分布不均的復(fù)雜點(diǎn)圖譜。如何有效的對(duì)雙向凝膠電泳圖像分析，如何對(duì)圖譜如何有效的對(duì)雙向凝膠電泳圖像分析，如何對(duì)圖譜上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)、定量、比較、分析和歸類(lèi)，上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)、定量、比較、分析和歸類(lèi)，挖掘有價(jià)值的蛋白質(zhì)點(diǎn)的信息是雙向電泳分析軟件挖掘有價(jià)值的蛋白質(zhì)點(diǎn)的信息是雙向電泳分析軟件所要解決的問(wèn)題。所要解決的問(wèn)題。4PDQuest 軟件簡(jiǎn)介軟件簡(jiǎn)介PDQuestPDQuest軟件是顯示（軟件是顯示（imagingimaging）、分析）、分析（analyzinganalyzing）雙向電泳圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)的一個(gè)）雙向電泳圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)的一個(gè)軟件包軟件包硬件：

3、硬件：一定的電腦配置,Pentirm 166處理器，64M內(nèi)存，3G硬盤(pán)，1024*768分辨率 ，256色，SCI接口，windows操作系統(tǒng)軟件：軟件： PDQuest雙向凝膠圖像分析軟件，Bio-Rad Laboratory,Hercules,CA5PDQuest 軟件的使用軟件的使用以以PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析軟件為例將雙向電泳分分析軟件為例將雙向電泳分析的基本實(shí)驗(yàn)過(guò)程做一簡(jiǎn)單介紹。析的基本實(shí)驗(yàn)過(guò)程做一簡(jiǎn)單介紹。6凝膠的圖像處理分析及細(xì)胞蛋白譜的建立 典型流程典型流程l凝膠圖像的掃描：凝膠圖像的掃描：l圖像加工：圖像加工：l斑點(diǎn)檢測(cè)和定量：斑點(diǎn)檢測(cè)和定量：l凝膠

4、配比：凝膠配比：l數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析：l數(shù)據(jù)呈遞（數(shù)據(jù)呈遞（report）l2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：7PDQuest 軟件軟件PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析軟件系統(tǒng)和其他分析軟件系統(tǒng)和其他2-D2-D分析軟分析軟件系統(tǒng)一樣，包括：件系統(tǒng)一樣，包括：一一 圖象采集與加工：圖象采集與加工：二二 斑點(diǎn)檢測(cè)斑點(diǎn)檢測(cè)三三 斑點(diǎn)匹配斑點(diǎn)匹配四四 數(shù)據(jù)分析及輸出數(shù)據(jù)分析及輸出8PDQuest 軟件的使用http:/ 圖象采集與加工(editing images)10111、掃描：凝膠染色后用清華紫光掃描儀掃描，透射模式，凝膠染色后用清華紫光掃描儀掃描，透射模式，全彩全彩RGB,R

5、GB,分辨率為分辨率為400dpi-800dpi400dpi-800dpi，盡量排除氣泡，文件以，盡量排除氣泡，文件以tifftiff格式格式保存。保存。2、圖片加工：l在在PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析軟件中打開(kāi)以分析軟件中打開(kāi)以tifftiff格式保存的文件可以格式保存的文件可以。（單擊“打開(kāi)文件”圖標(biāo)和“File”菜單并選擇“OpenOpen”命令，選擇保存2-D圖象文件的磁盤(pán)、路徑和文件名，雙擊文件名或單擊“Open”以打開(kāi)2-D圖象文件，此時(shí)tiff格式保存的文件會(huì)自動(dòng)另外創(chuàng)建一個(gè)為PDQUEST 2-D分析軟件自定義的文件格式2D 2D ScanScan。）l單擊

6、工具欄上的單擊工具欄上的control thecontrol the image displayimage display 圖標(biāo)，會(huì)出圖標(biāo)，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)對(duì)話(huà)框，通過(guò)改變此對(duì)話(huà)框的現(xiàn)一個(gè)對(duì)話(huà)框，通過(guò)改變此對(duì)話(huà)框的High High 和和LowLow的值以改變明的值以改變明亮度。亮度。12l用工具欄的用工具欄的crop可以切割掉凝膠邊緣沒(méi)有蛋白質(zhì)點(diǎn)的部可以切割掉凝膠邊緣沒(méi)有蛋白質(zhì)點(diǎn)的部分，以減少分析的復(fù)雜性，但要注意對(duì)你要分析的多塊凝分，以減少分析的復(fù)雜性，但要注意對(duì)你要分析的多塊凝膠圖像最好是切割成同樣大小。膠圖像最好是切割成同樣大小。（在操作時(shí)先選擇其中的一個(gè)凝膠圖象并選定要切割的區(qū)（在操作時(shí)先

7、選擇其中的一個(gè)凝膠圖象并選定要切割的區(qū)域，然后在域，然后在imageadvance cropsave crop settingsimageadvance cropsave crop settings下保下保存存cropcrop的設(shè)定條件并輸入保存的名稱(chēng)，其他的圖象切割時(shí)的設(shè)定條件并輸入保存的名稱(chēng)，其他的圖象切割時(shí)在在imageadvance cropload crop settingsimageadvance cropload crop settings中選定先前保中選定先前保存的名稱(chēng)即可存的名稱(chēng)即可 ）13二 、斑點(diǎn)檢測(cè)(spots detection)14圖象采集與加工后就要進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)，

8、圖象采集與加工后就要進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)，PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析軟件通過(guò)一個(gè)稱(chēng)之為分析軟件通過(guò)一個(gè)稱(chēng)之為“蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測(cè)向?qū)У鞍踪|(zhì)斑點(diǎn)檢測(cè)向?qū)В╯pot identification wizardspot identification wizard）”的程序來(lái)實(shí)現(xiàn)的程序來(lái)實(shí)現(xiàn)的。的。15l單擊“spot”菜單，選擇“spot identification wizard”程序。l該程序首先需人工設(shè)定檢測(cè)參數(shù)如最小斑點(diǎn)、最弱斑點(diǎn)、最大斑點(diǎn)、最小斑點(diǎn)和背景值,然后程序進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)并可調(diào)節(jié)檢測(cè)的靈敏度，若檢測(cè)效果不理想，該步驟可反復(fù)進(jìn)行。程序允許人工調(diào)節(jié)脫尾（streaks）、背景、

9、斑點(diǎn)（speckles）和其他一些選項(xiàng)等。l這些參數(shù)設(shè)好后單擊Find spot centers,其結(jié)果在凝膠圖象會(huì)顯示檢測(cè)到的斑點(diǎn)會(huì)用“ 字（Spot Crosshairs）”表示，檢測(cè)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)應(yīng)盡量與肉眼觀測(cè)的相符。檢測(cè)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)應(yīng)盡量與肉眼觀測(cè)的相符。l在Parameter Set 項(xiàng)輸入保存的名稱(chēng)，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的參數(shù)可被保存，并能用保存的參數(shù)自動(dòng)檢測(cè)所有2-D凝膠中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，單擊Process all gels，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)Auto-detect spots窗口，其中可以選擇需要進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)的凝膠圖象（這些凝膠圖像需事先打開(kāi)）。l蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測(cè)完了之后，軟件會(huì)自動(dòng)創(chuàng)建另外兩種格式分

10、別為gel image 和和gel spot。161718l由于在進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)時(shí)會(huì)錯(cuò)誤的識(shí)別一些蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，比如將一些污染的非蛋白質(zhì)點(diǎn)識(shí)別為蛋白質(zhì)點(diǎn)、將本來(lái)是一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)識(shí)別為兩個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)或者反之。所以在匹配之前最好進(jìn)行處理，同時(shí)將gel scan 、gel image 和gel spot圖打開(kāi)，然后單擊edit spot tool，出現(xiàn)一個(gè)對(duì)話(huà)框，此對(duì)話(huà)框中有增加斑點(diǎn)（make a spot at cursor）, 刪除斑點(diǎn)（remove spot at cursor）,合并斑點(diǎn)（combine spot in box）等圖標(biāo)，可根據(jù)你的目的而選擇其中一個(gè)圖標(biāo)進(jìn)行相應(yīng)的斑點(diǎn)處理。這些處理只能

11、在gel image圖象中處理，但相應(yīng)的在gel spot圖象中會(huì)同時(shí)得到顯示。19三 、斑點(diǎn)匹配(Matching spots)20u蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測(cè)完了之后，為了比較和分析不同凝膠中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的改變，PDQUEST 可以建立一個(gè)建立一個(gè)Matchset。單擊matchcreat matchset, 出現(xiàn)一個(gè)Matchset的對(duì)話(huà)框，輸入文件名稱(chēng)，保存路徑，選擇（select）或上載（load）gel spot 圖像的文件名，然后單擊creat, 出現(xiàn)一對(duì)話(huà)框，選擇其中的一個(gè)圖象做為參考圖象（standard member）, 整個(gè)Matchset用單個(gè)窗口（signal window）來(lái)表示

12、，其中的亞窗口（subwindow）分別用來(lái)表示參考圖像（用REF來(lái)表示）和成員膠（member gel）圖像。2122232425Matchset 建成后，接著便是建成后，接著便是設(shè)立標(biāo)志點(diǎn)（landmark）,它的作用是對(duì)整個(gè)它的作用是對(duì)整個(gè)凝膠上蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行排列（凝膠上蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行排列（align）與定位（）與定位（position）以便進(jìn)行匹配）以便進(jìn)行匹配（match）。）。單擊工具欄中的單擊工具欄中的match toolsmatch tools圖標(biāo)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)窗口，其中有圖標(biāo)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)窗口，其中有 landmark, landmark, unlandmark, match gel

13、, match all gelsunlandmark, match gel, match all gels等斑點(diǎn)匹配的工具等斑點(diǎn)匹配的工具, , 在在matchmatch菜單中也有菜單中也有這些工具。這些工具。標(biāo)志點(diǎn)應(yīng)選擇分辨良好，且所有成員膠上均出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，并盡量避開(kāi)標(biāo)志點(diǎn)應(yīng)選擇分辨良好，且所有成員膠上均出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，并盡量避開(kāi)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)聚集的地方，最好在不同的放大倍數(shù)下確定該蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為所有蛋白質(zhì)斑點(diǎn)聚集的地方，最好在不同的放大倍數(shù)下確定該蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為所有成員膠上同一個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。至少要設(shè)立兩個(gè)標(biāo)志點(diǎn)后便可利用成員膠上同一個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。至少要設(shè)立兩個(gè)標(biāo)志點(diǎn)后便可利用PDQUEST

14、PDQUEST的自的自動(dòng)匹配功能來(lái)完成不同凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的匹配了。動(dòng)匹配功能來(lái)完成不同凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的匹配了。一般設(shè)立的landmark斑點(diǎn)個(gè)數(shù)為總斑點(diǎn)的10%左右，要用肉眼檢查每一個(gè)應(yīng)該能匹配上的斑點(diǎn)是否匹配上了。26u對(duì)錯(cuò)誤匹配的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)或沒(méi)有識(shí)別到的匹配可進(jìn)行手工方式編輯。在這里也可以進(jìn)行編輯斑點(diǎn)功能，單擊viewinterchange all images, 這樣所有的成員膠和參考膠有Gel spot 狀態(tài)下變成了Gel image, 而在Gel image 狀態(tài)下可進(jìn)行Edit Spot Tools 以編輯蛋白質(zhì)斑點(diǎn)以編輯蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。2728標(biāo)志點(diǎn)以綠色三角標(biāo)記，每塊膠上匹

15、配上的蛋白質(zhì)標(biāo)志點(diǎn)以綠色三角標(biāo)記，每塊膠上匹配上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)以斑點(diǎn)以綠色字母綠色字母標(biāo)記，沒(méi)有匹配上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)用標(biāo)記，沒(méi)有匹配上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)用紅紅色圈色圈來(lái)標(biāo)記，即是有無(wú)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。來(lái)標(biāo)記，即是有無(wú)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。 293031四 、數(shù)據(jù)分析及輸出（analysis and report）3233為了分析蛋白質(zhì)斑點(diǎn)之間差異表達(dá)，PDQUEST提供了多個(gè)分析程序，包括蛋白質(zhì)斑點(diǎn)量量(Quantity)分析分析，散點(diǎn)圖工具（Satter Plot Tool） ,量的柱狀圖分析（Graph）等在內(nèi)的多種分析程序。34量的分析量的分析打開(kāi)Matchset，單擊DatabaseAnalys

16、isCreate Analysis Set, 然后再單擊參考圖，就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)對(duì)話(huà)框, 輸入名字（Name）, Type有多種選項(xiàng),要做量的比較就選Quantitative。3536比較（比較（Compare）形式有兩種，一種是）形式有兩種，一種是Gel, 可以單個(gè)的膠兩兩互相比可以單個(gè)的膠兩兩互相比較較(只能是成員膠和參考膠進(jìn)行比較只能是成員膠和參考膠進(jìn)行比較)，另一種是，另一種是Group，可以將同一樣，可以將同一樣品的多塊膠做為一組（這在品的多塊膠做為一組（這在Database Replicate GroupCreate Group下可以創(chuàng)建組），然后再組之間兩兩比較。然后再選擇下可以創(chuàng)建

17、組），然后再組之間兩兩比較。然后再選擇A 和和B，分別表示兩塊膠或者是兩組膠。分別表示兩塊膠或者是兩組膠。Replicate Group373839404142在在Select Spots Which are 中可以選擇中可以選擇Increased, Increased or Decreased 或者是或者是Decreased 等，激活選等，激活選項(xiàng)后可以輸入倍數(shù)關(guān)系項(xiàng)后可以輸入倍數(shù)關(guān)系, 默認(rèn)的是默認(rèn)的是2 times, 可以輸入其他數(shù)可以輸入其他數(shù)值，值， 如如3 times。參數(shù)設(shè)好后就單擊。參數(shù)設(shè)好后就單擊go, 在參考膠上就會(huì)出在參考膠上就會(huì)出現(xiàn)黃色圈標(biāo)記的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，如果你選擇是現(xiàn)

18、黃色圈標(biāo)記的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，如果你選擇是Increased BA 2 times, 那么這些那么這些黃色圈標(biāo)記的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)即為在量蛋白質(zhì)斑點(diǎn)即為在量上上B大于大于A 兩倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)兩倍的蛋白質(zhì)點(diǎn).43為了矯正銀染對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)定量分析的影響，所有點(diǎn)的含量為了矯正銀染對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)定量分析的影響，所有點(diǎn)的含量通過(guò)單個(gè)點(diǎn)的光密度值比上膠上所有點(diǎn)光密度質(zhì)而正?；ㄟ^(guò)單個(gè)點(diǎn)的光密度值比上膠上所有點(diǎn)光密度質(zhì)而正?；∟ormalize）, 單擊單擊EditNormalize, 出現(xiàn)一對(duì)話(huà)框，選擇出現(xiàn)一對(duì)話(huà)框，選擇左上角左上角Enable Normalize，下面的窗口被激活，在，下面的窗口被激活，在Basis下下選

19、擇選擇Total of all Valid Spots, 在在Scaling下選擇下選擇PPM(1000000), 然后單擊然后單擊 go。這樣所有的點(diǎn)都正?；?。這樣所有的點(diǎn)都正?；∟ormalize）了。）了。歸一化歸一化 Normalization4445散點(diǎn)圖工具散點(diǎn)圖工具 Scatter plot464748單擊單擊Reports 下的下的Scatter plot，會(huì)出現(xiàn)散點(diǎn)圖分析的對(duì)話(huà)，會(huì)出現(xiàn)散點(diǎn)圖分析的對(duì)話(huà)框，可以選擇框，可以選擇x, y軸，分別代表一塊膠，軸，分別代表一塊膠，Markers 下可以選下可以選擇倍數(shù)，下面的散點(diǎn)圖即顯示了兩個(gè)擇倍數(shù)，下面的散點(diǎn)圖即顯示了兩個(gè)2-D膠

20、圖像中蛋白質(zhì)點(diǎn)膠圖像中蛋白質(zhì)點(diǎn)之間的相關(guān)性，上面會(huì)顯示二者的相關(guān)系數(shù)，如果相關(guān)系數(shù)之間的相關(guān)性，上面會(huì)顯示二者的相關(guān)系數(shù)，如果相關(guān)系數(shù)大于大于0.4，說(shuō)明二者有較大的相關(guān)性，如果小于，說(shuō)明二者有較大的相關(guān)性，如果小于0.4大于大于0.2, 說(shuō)明相關(guān)性較小，小于說(shuō)明相關(guān)性較小，小于0.2, 說(shuō)明沒(méi)有相關(guān)性。在說(shuō)明沒(méi)有相關(guān)性。在Reports Scatter plots 下可以將所有的凝膠圖之間的相關(guān)圖都打印下可以將所有的凝膠圖之間的相關(guān)圖都打印出來(lái)。出來(lái)。495051量化柱狀圖量化柱狀圖 Graphs5253單擊單擊ReportsMore GraphsPage Graphs, 在有邊會(huì)出在有邊會(huì)

21、出現(xiàn)一對(duì)化框，顯示所有蛋白質(zhì)點(diǎn)在不同膠上的現(xiàn)一對(duì)化框，顯示所有蛋白質(zhì)點(diǎn)在不同膠上的量化柱狀圖，如果要顯示所要分析的蛋白質(zhì)點(diǎn)的量化柱狀圖，則在對(duì)話(huà)框如果要顯示所要分析的蛋白質(zhì)點(diǎn)的量化柱狀圖，則在對(duì)話(huà)框的的Input下選擇下選擇Analysis set, 出現(xiàn)一對(duì)話(huà)框，然后選擇分析出現(xiàn)一對(duì)話(huà)框，然后選擇分析的名稱(chēng)即可。在的名稱(chēng)即可。在ReportsQuantity Graphs下可輸出所有下可輸出所有的蛋白質(zhì)點(diǎn)（的蛋白質(zhì)點(diǎn)（All Match Spots）或者是特定分析的蛋白質(zhì)）或者是特定分析的蛋白質(zhì)點(diǎn)（點(diǎn)（Specificd Analysis Set）在不同膠上的量化柱狀圖。）在不同膠上的量化柱

22、狀圖。54555657應(yīng)用材料：58無(wú)腔眼金魚(yú)胚胎正常眼金魚(yú)胚胎5960差異點(diǎn)：差異點(diǎn)：61量化柱狀圖：量化柱狀圖：622D Gel DatabaseslBiobase Biobase 角質(zhì)形成細(xì)胞角質(zhì)形成細(xì)胞, ,膀胱癌等膀胱癌等 ( (丹麥丹麥Center for Genome Research) Center for Genome Research) http:/biobase.dk/cgi-bin/celishttp:/biobase.dk/cgi-bin/celislECO2DBASE ECO2DBASE 大腸桿菌大腸桿菌 ( (在在NCBINCBI庫(kù)中庫(kù)中) ) ftp:/ncbi

23、./respository/ECO2DBASE/respository/ECO2DBASElHeart-2DPAGE Heart-2DPAGE 人心肌人心肌 ( (德國(guó)柏林德國(guó)柏林) ) http:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleisshttp:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleisslHSC-2DPAGE HSC-2DPAGE 人類(lèi)心臟人類(lèi)心臟 ( (英國(guó)英國(guó)Harefield, Heart Science Center) Harefield, Heart Science Center) http:/www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.htmlhttp:/www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.htmllLSB L