基因工程抗體片段

1、基因工程抗體片段 -譜寫(xiě)抗體家族的新樂(lè)章基因工程抗體片段之前奏曲小分子抗體第一代小分子抗體抗原結(jié)合片段( fragment with antigen binding，fab) 和重組fab fab 片段由完整輕鏈和重鏈的vh + ch1構(gòu)成，其大小為完整抗體的1/3,約55kd； 重組fab 是將輕、重鏈可變區(qū)分別與人抗體的 鏈和重鏈ch1重組； fab 基因工程構(gòu)建方法及其性能基因工程構(gòu)建方法及其性能 通常是保留鼠源性的cdr區(qū), 其余換成人源化,通過(guò)大腸桿菌以分泌表達(dá)的方式表達(dá)l鏈和fd鏈, 二者能在細(xì)菌的外周質(zhì)腔中折疊成具有一定構(gòu)象的fab； 該fab具有抗體的活性。因?yàn)槠洳缓衒c段、

2、分子量小、結(jié)合力高、抗原性低, 故在腫瘤治療上有其優(yōu)越性。目前已有多個(gè)片段藥物獲得fda批準(zhǔn)上市. fab的臨床應(yīng)用1）阿昔單抗( abciximab，reopro) 1994 年12 月fda 批準(zhǔn)的第一個(gè)重組fab 片段，該產(chǎn)品以血小板糖蛋白b /a 為靶點(diǎn)，用以防止血小板聚集及血栓形成，作為冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管插術(shù)時(shí)預(yù)防心肌缺血的輔助用藥，取得了巨大的成功；2）蘭尼單抗( lucentis)：治療黃斑變性， 2006 年獲得fda 的批準(zhǔn)。3）賽妥珠單抗( cimzia)：克羅恩病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，2008 年獲得fda 的批準(zhǔn)。在臨床研究中，fab 占據(jù)了臨床研發(fā)抗體片段的大多數(shù)( 30 /54

3、 種) 。第二代小分子抗體單鏈抗體( single chain fv，scfv) scfv指在重鏈v區(qū)cdna5端與輕鏈v區(qū)cdna5端之間用一寡聚核甘酸連接, 在大腸桿菌中表達(dá)成一單鏈多肽, 并在細(xì)菌體內(nèi)折疊成只由重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的一種新型的抗體, 大小僅為完整ig的1/6(約28kd); 是含有完整抗原結(jié)合部位的最小抗體片段；scfv的功能 1）用于治療：可進(jìn)人一般抗體不能達(dá)到的部位, 如蛋白偶聯(lián)受體、酶活性部位和病毒表面的腔囊等； 2）多肽接頭可設(shè)計(jì)為具有特殊功能的位點(diǎn)：多肽接頭是單鏈抗體的獨(dú)特組成,可設(shè)計(jì)為具有特殊功能的位點(diǎn)：如金屬贅合、連接毒素或藥物等, 用于影像和臨床治療；第三

4、代小分子抗體納米抗體和分子識(shí)別單位( molecular recognition unit，mru) 1. 納米抗體主要指僅由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體( vhh)，其體積約為完整抗體的1 /10，故稱為納米抗體；納米抗體的來(lái)源 1993 年hamers 等偶然發(fā)現(xiàn)駱駝體內(nèi)存在一 種僅具有重鏈的抗體，被稱為重鏈抗體( heavy-chain antibodies，hcabs) 。此后，在一些軟骨魚(yú)，如護(hù)士鯊體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)類似駱駝重鏈抗體結(jié)構(gòu)的新抗原受體( new antigen receptor，nar) 。 這類抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)僅由重鏈的可變區(qū)vhh( variable domainof t

5、he heavy chain of hcabs，vhh) 單結(jié)構(gòu)域形成，盡管缺失輕鏈可變區(qū)，卻仍具有良好和廣泛的抗原結(jié)合力； 克隆這種抗體重鏈的可變區(qū)，構(gòu)建僅由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體( vhh)。納米抗體單域的性質(zhì) 1）有高度水溶性和構(gòu)象穩(wěn)定性：盡管缺失輕鏈可變區(qū)，卻仍具有良好和廣泛的抗原結(jié)合力。并且由于在框架fr2 區(qū)存在一些不同于常規(guī)抗體的親水性氨基酸，使得vhh 抗體在水溶液中具有良好的穩(wěn)定性。 在苛刻的條件中，如胃液和內(nèi)臟中仍能保持抗原結(jié)合活性，為口服治療胃腸道功能紊亂性疾病提供新的思路； 2）納米抗體能識(shí)別獨(dú)特的抗原表位，由于具有伸展的抗原互補(bǔ)結(jié)合區(qū)( cdr) 以及更高的組織

6、穿透性和更小的分子，vhh抗體可以結(jié)合一些常規(guī)抗體無(wú)法接近的抗原表位。可進(jìn)入酶的活性部位及細(xì)菌或病毒表面受體裂縫中，可以利用其模擬藥物來(lái)設(shè)計(jì)小分子酶的抑制劑、受體的激動(dòng)劑或拮抗劑等； 3）能有效地穿過(guò)血腦屏障：有望成為治療神經(jīng)性疾病和腦腫瘤的新藥vhh穩(wěn)定的機(jī)制 傳統(tǒng)抗體的vh 和vl 區(qū)通過(guò)疏水作用形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而重鏈抗體則通過(guò)選擇性突變vhh 胚系基因中幾個(gè)功能位點(diǎn)，使其形成較高的親水性表面，可在缺失vl 條件下保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；vhh 胚系基因序列特性 1）對(duì)駱駝vhh 胚系基因序列分析發(fā)現(xiàn)，vhh 與人源vh 基因家族序列具有較高的同源性； 2）比較人類和駱駝igg 重鏈可變區(qū)發(fā)現(xiàn)，在框架

7、fr2 區(qū)的氨基酸組成中，有4 個(gè)氨基酸顯著不同。這4 個(gè)氨基酸在vh 和vhh 中分別是v42f 或v42y，g49e，l50r 和w52g， 利用這一特點(diǎn), 可以對(duì)人源抗體vh 結(jié)構(gòu)域fr2 中的一些氨基酸進(jìn)行vhh特征性改造, 所得到的駱駝化單域vh 抗體不僅保持原有的抗體的特異性和親和力, 而且溶解性好、穩(wěn)定性好。2. 分子識(shí)別單位( molecular recognition unit，mru) mru 是由單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)組成的小分子抗體片段，約為完整抗體分子的1/80 1 /70。 mru 也具有與抗原結(jié)合的能力，且由于其穿透力強(qiáng)、半衰期短、顯像時(shí)本底低，在臨床診斷中具有潛在的應(yīng)用

8、前景。基因工程抗體片段之進(jìn)行曲抗體片段的改造和改型 通過(guò)對(duì)小分子抗體基因的改造和修飾，改善其親和力、免疫原性及效應(yīng)，構(gòu)建出多種基因工程抗體片段. 目前已有54 種基因工程抗體片段進(jìn)入臨床研究，其中30 種源自fab ( 56%) 、19 種源自scfv( 35%) 、5 種源自第三代小分子抗體( 9%)1.雙鏈抗體diabody設(shè)計(jì)背景 由于單價(jià)抗體片段(如scfv、fab)與靶抗原作用后保留時(shí)間短且解離速度快, 所以在實(shí)際應(yīng)用中有必要設(shè)計(jì)多價(jià)抗體分子, 這種多價(jià)分子可顯示出與抗原更加強(qiáng)的親和力和慢的解離速度； fab和scfv片段能夠通過(guò)化學(xué)的或基因工程linker構(gòu)成二聚體、三聚體或四聚體

9、。例如fab就被用化學(xué)連成二價(jià)或三價(jià)的多聚體, 實(shí)驗(yàn)表明其與抗原的保持性有所提高；最成功的設(shè)計(jì)縮短linker二價(jià)雙鏈抗體scfv05個(gè)氨基酸2.雙特異性抗體( bispecific antibody，bsab)一個(gè)結(jié)合靶細(xì)胞上的特異性抗原另一個(gè)結(jié)合淋巴細(xì)胞或吞噬細(xì)胞等效應(yīng)物雙特異性抗體的2個(gè)抗原結(jié)合部位兩條抗原結(jié)合臂可分別來(lái)自fv段、fab段、scfv或dsfv導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞靶向殺滅腫瘤細(xì)胞有二價(jià)、四價(jià)、六價(jià)雙特異抗體的設(shè)計(jì)和運(yùn)用 化學(xué)交聯(lián)：分別分離純化兩種親本單抗，采用還原劑使其解鏈，獲得單價(jià)抗體，再采用異雙功能交聯(lián)劑，把兩種具有不同抗原特異性的單價(jià)抗體或其片段交聯(lián)起來(lái)； 細(xì)胞工程：采用細(xì)胞

10、融合的方法，將分泌單抗的雜交瘤與經(jīng)免疫的脾細(xì)胞結(jié)合，或者使兩種分泌不同單抗的雜交瘤細(xì)胞融合； 基因工程：多采用抗體分子片段，fab、scfv等經(jīng)過(guò)基因操作修飾后，通過(guò)體外組裝成bsab或者直接表達(dá)分泌型的bsab a majority of both bispecific diabodies and bis-scfv are designed to bind to the cd3 t-cell coreceptor and thereby recruit cytotoxic t-cells (ctls) to the tumor site. 雙特異抗體的臨床優(yōu)勢(shì) 1）靶向性好：用高價(jià)bsab

11、靶向目標(biāo)抗原可使藥物選擇性地結(jié)合到高抗原密度的腫瘤組織區(qū)，正常組織抗原密度低于bsab 的結(jié)合域值，因而bsab極少滲透入正常組織，從而提高了bsab 的靶向性；。 實(shí)例：lu 等設(shè)計(jì)了3 價(jià)抗erbb2 /cd16 的bsab，它包括2 個(gè)結(jié)合erbb2 的scfv 形式結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)定位于nk 細(xì)胞的單價(jià)fab 片段位點(diǎn)； 2）是一種有效的抗腫瘤策略：michaelson 等將抗ltr 的scfv 片段融合于抗trail-r2 單抗的重鏈端，設(shè)計(jì)了以tnf家族膜受體trail-r2 和ltr 為靶點(diǎn)的igg 樣bsab。該抗體血漿半衰期長(zhǎng)，體外實(shí)驗(yàn)中能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，在小鼠腫瘤

12、移植模型中較之親本抗體能更顯著地減小腫瘤體積； 3）具有更強(qiáng)的殺傷淋巴瘤細(xì)胞的功效，且對(duì)同體正常b 細(xì)胞的作用較弱：rossi 等報(bào)道了一對(duì)來(lái)自抗cd20 igg1)和依帕珠單抗( epratuzumab ) 的人源化6 價(jià)抗cd20 /22 的bsab20-22 和22-20。它們無(wú)需第二抗體交聯(lián)即可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖抑制2.小分子抗體與其他分子連接成融合物與毒素的連接 將抗體片段與細(xì)菌或植物毒素連接, 使其具有特異性的識(shí)別腫瘤細(xì)胞的功能, 并利用毒素來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞； 如di paolo等曾將人源化的抗ep一cam的單鏈抗體4d5mocb與綠膿假單胞外毒素a融合, 發(fā)現(xiàn)其優(yōu)先定位在ep一

13、cam陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞, 并能抑制多種腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng), 顯示了良好的應(yīng)用前景。與細(xì)胞因子連接 將抗體片段與il-2、 il-12或gm一csf等免疫刺激因子結(jié)合成融合蛋白后, 能刺激細(xì)胞增殖, 能促使自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生溶瘤細(xì)胞作用;其他形式的免疫結(jié)合物1）放射性標(biāo)記的抗體片段：，通過(guò)抗體特異性的識(shí)別作用使放射性物質(zhì)有效地導(dǎo)向腫瘤組織局部，用于放射免疫治療;2）抗體-化療藥物結(jié)合物：通過(guò)化學(xué)方法使抗體和化療藥物的某些基團(tuán)偶聯(lián)，在特異的作用位點(diǎn)產(chǎn)生細(xì)胞毒作用進(jìn)行免疫化療;3）抗體-酶連接物：利用抗體導(dǎo)向作用，將催化前體藥物的酶攜帶至腫瘤局部，待血液循環(huán)及正常組織中非特異分布的抗體酶藥物廓清后再注射前體藥物，在腫瘤局部造成高濃度化療藥物的微環(huán)境，從而高效率殺傷腫瘤細(xì)胞。4. 細(xì)胞內(nèi)抗體 將小分子抗體基因加上定位信號(hào)序列，使其在細(xì)胞內(nèi)特定部位表達(dá)，可中和或調(diào)節(jié)位于特定亞細(xì)胞部位