色層分析法課件

1、色層分析法課件l4.5.1 技術(shù)參數(shù)l4.5.2 理論基礎(chǔ)l4.5.3 薄層層析固定相選擇原則l4.5.4 薄層層析展開劑選擇原則l4.5.5 薄層層析的實驗技術(shù)l4.5.6 應(yīng)用技術(shù)10-60min塔板塔板數(shù)高數(shù)高0.01g薄層層薄層層析法析法快速快速分離效分離效率高率高靈敏靈敏度高度高顯色方顯色方法多法多應(yīng)用應(yīng)用面廣面廣fR 原點至斑點中心間的距離原點至溶劑前緣間的距離 在薄層層析分離中，原點距展開劑前緣的距離為12cm，原點距展開斑點A.B的距離各為6cm.8cm。A.B兩斑點的比移值各為多少？ RfA=6/12=0.50 RfB=8/12=0.67a為Rf=1及Rf=0兩種組分斑點中心

2、距離W1/20為Rf=0 的組分斑點寬度的1/2W1/2為Rf=組分斑點寬度的1/2 什么是相對比移值（Rf)，他如何測定？代表了什么？為什么可以利用它來進行定性鑒定？ 展開劑在薄層中的流速與展開劑的表面張力、黏度及吸附劑的種類，粒度，均勻度等因素有關(guān)，即和層析系統(tǒng)（包括固定相和流動相兩方面）有關(guān)，但也和展開距離有關(guān)。 溶劑在薄層中的流速問題溶劑在薄層中的流速問題L2=k t, V=dL/dt= k/2L 1、在薄層層析過程中為什么不討論平均塔板高度與展開劑流速間的關(guān)系，而是討論與展開距離間的關(guān)系？ 2、設(shè)用一定的層析系統(tǒng)進行薄層層析分離時，展開劑前緣移動5cm需要5min。如果展開劑前緣移動

3、10cm層析可以結(jié)束，需要多少時間？在展開劑前緣離原點5cm和10cm處，展開劑前緣的上升速度分別為多少？ 思考題思考題 何種層析(吸附、分配、親和、凝膠） 被分離組分性質(zhì)（極性、離子、分子 大小等） 吸附劑吸附性能強弱 固定相性質(zhì)被分離物質(zhì)酸堿性活性 分離機制硅膠酸性有吸附/分配 幾乎所有物質(zhì)氧化鋁堿性有吸附堿性物質(zhì)（生物堿）和固醇類硅藻土中性無分配糖類、藥物氫氧化鈣堿性弱吸附類胡蘿卜素、維生素E類磷酸鈣弱堿性有吸附類胡蘿卜素、維生素E類硫酸鈣酸性弱吸附脂肪酸、甘油酸纖維素粉中性無分配染料、氨基酸離子交換劑酸或堿離子交換核酸類及其衍生物葡聚糖凝膠中性排阻作用蛋白質(zhì)、核酸l吸附層析展開劑對被分

4、離組分有一定的溶解度展開劑對被分離組分有適當(dāng)?shù)挠H和力展開劑極性一般比被分離物質(zhì)的極性略小l分配層析展開劑選擇各組分溶解度相差大的溶劑l制備薄層板： 干板-軟板，濕板-硬板 定性定量時薄層厚度為0.2-0.3mm 制備薄層的厚度要求約為0.5-2mm 活化 形式：硅膠G、硅膠H、硅膠GF254、 硅膠HF360 粘合劑（煅石膏：牢度差，不能用于分離無機物；羧甲基纖維素：牢度好，不能用腐蝕性顯色劑；淀粉：不能用于分離有機物）硅膠硅膠l混合薄層：兩種不同吸附劑l酸堿薄層：稀酸或稀堿代替水l絡(luò)合薄層：加入絡(luò)合劑l涂布固定液的薄層：l具有濃縮區(qū)的薄層：不同粒度l高效薄層：極細(xì)均勻的吸附劑 1、層析用硅膠

5、，有硅膠G、硅膠H、硅膠GF254、硅膠HF360等等不同標(biāo)號，這些分別表示什么？應(yīng)用這些硅膠時應(yīng)分別注意些什么？ 2、聚酰胺薄層的作用機理是什么？ 3、試比較軟板和硬板的優(yōu)缺點。 4、簡述混合薄層、酸堿薄層、絡(luò)合薄層、涂布固定液的薄層、具有濃縮區(qū)的薄層、高效薄層的分離原理。思考題思考題l點樣： 溶解試樣的溶劑，點液集中，點量精確，點樣量適當(dāng)l展開： 極性增強順序：石油醚環(huán)己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸 原則：先用單一溶劑，再用混合溶劑在硅膠薄層上分離生物堿： 單一溶劑：環(huán)己烷、苯、氯仿 混合溶劑：苯-氯仿（9：1，1：1） 環(huán)己烷-

6、氯仿-二乙胺（5：4：1） 苯-乙酸乙酯-二乙胺（7：2：1） 苯-正庚烷-氯仿-二乙胺（60：50：10：0.2） 二乙胺：改變極性，調(diào)整酸堿度，增大試樣的溶解度 聚酰胺薄層聚酰胺薄層 展開劑洗脫能力的大小順序： 水乙醇甲醇丙酮稀氫氧化銨（鈉）溶液甲酰胺二甲基甲酰胺 在聚酰胺薄層上用混合展開劑： 水-乙醇（1:1） 水-甲醇（1:1） 水-乙醇-乙酰基丙酮（4:2:1） 水-乙醇-丁酮-乙?；?3:3:3:1） 水-乙醇-乙酸-二甲基丙酰胺(6:4:2:1) 二甲基甲酰胺-苯 （3:97）數(shù)值分析方法數(shù)值分析方法 用56種展開劑分離22種磺胺類藥物時，可較快地找到最佳 系統(tǒng)組合 上行展

7、開上行展開 下行展開下行展開 徑向展開徑向展開 多次展開多次展開 連續(xù)展開連續(xù)展開 雙向展開雙向展開程序控制多次展開法程序控制多次展開法邊緣效應(yīng)l思考題1、怎樣選擇薄層層析的展開劑？應(yīng)該怎樣來考慮？2、新發(fā)展的薄層技術(shù)有哪些？3、用Al2O3薄層層析分離并測定氨基蒽醌中的-氨基蒽醌時，用環(huán)己烷-丙酮(3:1)的混合溶劑為展開劑。你認(rèn)為下列三種溶劑中選用哪一種來溶解試樣最為合適？為什么？吡啶、二氧六烷、丙酮，他們的沸點分別為116C，101 C ，56 C ，溶劑的極性和試樣在他們之中的溶解度都依次遞減。 顯色：在紫外光下觀察，以蒸汽熏， 噴以各種顯色劑以及生物自顯影 l定性：比移值，斑點的顯色

8、特性，斑點的原位光譜掃描，與其他分析技術(shù)的聯(lián)用 l定量：目視比較半定量法，洗脫法（誤差約為1-5% ），薄層掃描儀l瑞士瑞士CAMAG9(CAMAG9(長瑪長瑪) )公司公司, ,質(zhì)量優(yōu)質(zhì)量優(yōu)異異, , 價格昂貴價格昂貴, ,主流薄層色譜掃主流薄層色譜掃描儀為描儀為SCANNER-SCANNER-。l日本日本SHIMADEU(SHIMADEU(島津島津) ) 公司銷售公司銷售量大量大, ,其主流掃描儀為其主流掃描儀為CS-9300CS-9300、CS-9301CS-9301。l上海科賀生化技術(shù)有限公司是國上?？瀑R生化技術(shù)有限公司是國內(nèi)唯一的薄層色譜掃描儀生產(chǎn)廠內(nèi)唯一的薄層色譜掃描儀生產(chǎn)廠商商

9、全自動展開儀全自動展開儀 ADC2(瑞士瑞士) 全自動控制薄層活化、預(yù)平衡，展開缸飽和，展開距離及干燥等所有展開步驟，實時監(jiān)控并報告展開溫度及濕度 l一束光線的波長S是被測物的吸收峰所在；另一束光線的波長R是被測物不吸收的，可使由于薄層不均勻所引起的基線波動得以消除l由于斑點中被測組分的分布是不均勻的，一般是斑點中心被測組分較多，周圍較少，因此采用微小光束，曲折形的掃描方式 l采用背景補償來消除鋪薄層所用的吸附劑中可能含有雜質(zhì)和顯色不均勻性的影響l散射參數(shù)校正后吸光度和濃度之間成線性關(guān)系 l在醫(yī)藥方面的應(yīng)用在醫(yī)藥方面的應(yīng)用 聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜苯苯-甲醇甲醇-丁酮丁酮-甲酸（甲酸（7：1：1.

10、5：0.5）為展開劑）為展開劑分離了分離了7種黃芩中種黃芩中8種黃芩種黃芩苷及苷元苷及苷元人參皂苷的分離圖譜人參皂苷的分離圖譜 四環(huán)素中差向四環(huán)素的含量應(yīng)低于一定標(biāo)準(zhǔn)，因為后者毒性較大。溶四環(huán)素試樣于甲醇中配成一定濃度的溶液，取一份點于硅藻土薄層上，用丙酮-氯仿-乙酸乙酯（3：1：1）的混合溶劑為展開劑展開后，用濃氨水熏，然后在254nm的紫外光下觀察，除四環(huán)素主斑點外不得出現(xiàn)差向四環(huán)素的雜質(zhì)斑。 未知物結(jié)構(gòu)剖析未知物結(jié)構(gòu)剖析在薄層上分離良好的層析條件，在薄層上分離良好的層析條件，對于柱層析是很有參考價值的。對于柱層析是很有參考價值的。也可用薄層分離制備成品，把也可用薄層分離制備成品，把粗制品

11、點在較厚、較大的制備粗制品點在較厚、較大的制備型薄層板上分離雜質(zhì)，可達到型薄層板上分離雜質(zhì)，可達到制備純品的目的制備純品的目的保持層析過程于低保持層析過程于低溫或高于室溫的溫溫或高于室溫的溫度下進行度下進行粒徑越小，理論板粒徑越小，理論板高值降低高值降低;粒徑越小會降低流粒徑越小會降低流速速極細(xì)固定相，極細(xì)固定相，宜用直徑與長宜用直徑與長度比例大的層度比例大的層析柱析柱Rs正比于正比于n，也正比于，也正比于L;柱長增加使流速減慢柱長增加使流速減慢;峰寬度峰寬度正比于正比于L;柱的直徑大小與板高柱的直徑大小與板高H沒沒有直接關(guān)系有直接關(guān)系,影響柱效影響柱效.上樣和洗脫上樣和洗脫干法與濕干法與濕法

12、裝柱法裝柱固定相固定相的粒徑的粒徑直徑與長度直徑與長度之比之比為為:101:40柱外加夾套柱外加夾套 層析柱層析柱除去蛋白質(zhì)中的除去蛋白質(zhì)中的鹽及小分子物質(zhì)鹽及小分子物質(zhì) Sephadex G-25Bio-gel P30 大黃大黃70%甲醇提取液加到凝膠甲醇提取液加到凝膠色譜柱上，并用色譜柱上，并用70%的甲醇洗的甲醇洗脫，依次得到二蒽酮苷、蒽脫，依次得到二蒽酮苷、蒽醌二葡萄糖苷、蒽醌單糖苷、醌二葡萄糖苷、蒽醌單糖苷、游離苷元游離苷元弱極性的大孔樹脂，用弱極性的大孔樹脂，用水將糖等親水性成分洗水將糖等親水性成分洗脫，用不同濃度的乙醇脫，用不同濃度的乙醇洗下被大孔樹脂吸附的洗下被大孔樹脂吸附的苷類苷類 XDA大孔吸附樹大孔吸附樹脂脂, 用用85乙醇洗乙醇洗脫，可用于咖啡脫，可用于咖啡堿的吸附分離堿的吸附分離生物堿類生物堿類 皂苷類皂苷類其它苷類其它苷類 大