九放免技術(shù)PPT課件

1、第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述第2頁/共68頁第1頁/共68頁熒光（熒光（fluorescencefluorescence） 熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時，以發(fā)射光形式釋遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時，以發(fā)射光形式釋放出能量，稱為熒光。放出能量，稱為熒光。 一、熒光的基本知識一、熒光的基本知識取決于物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)及其周圍的介質(zhì)環(huán)境取決于物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)及其周圍的介質(zhì)環(huán)境光致熒光光致熒光化學(xué)熒光化學(xué)熒光陰極射線熒光陰極射線熒光第3頁/共68頁第2頁/共68頁發(fā)射光譜和激發(fā)光譜發(fā)射光譜和激發(fā)光譜 發(fā)射光譜發(fā)射光譜是指固定激發(fā)波長

2、，在不同波長下記錄的樣是指固定激發(fā)波長，在不同波長下記錄的樣品發(fā)射熒光的強(qiáng)度。品發(fā)射熒光的強(qiáng)度。激發(fā)光譜激發(fā)光譜是指固定檢測發(fā)射波長，用不同波長的激發(fā)是指固定檢測發(fā)射波長，用不同波長的激發(fā)光激發(fā)樣品記錄的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。光激發(fā)樣品記錄的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。 熒光的基本知識熒光的基本知識第4頁/共68頁第3頁/共68頁熒光效率熒光效率定義定義: :熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率計(jì)算公式計(jì)算公式: : 熒光效率熒光效率= = 如何得到最高的熒光效率？發(fā)光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激熒光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光的基本知識熒光的基本知識第5頁/共68頁

3、第4頁/共68頁熒光淬滅熒光淬滅 定義定義: :熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。如紫外線照射、亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅、低消退稱為熒光淬滅。如紫外線照射、亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅、低濃度的高錳酸鉀、濃度的高錳酸鉀、I I- -等等。作用：作用：以減弱非特異性本底。以減弱非特異性本底。熒光的基本知識熒光的基本知識第6頁/共68頁第5頁/共68頁熒光壽命熒光壽命定義定義: :熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時所用的時間。度時所用的時間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不

4、同。 熒光的基本知識熒光的基本知識第7頁/共68頁第6頁/共68頁熒光偏振熒光偏振 FHFL PFHFL熒光的基本知識熒光的基本知識第8頁/共68頁第7頁/共68頁熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)是一類能吸收激發(fā)光的光能而發(fā)射熒光的物質(zhì)。 具備的條件具備的條件 二、熒光物質(zhì)二、熒光物質(zhì)（1）具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基團(tuán)，結(jié)合蛋白質(zhì)后不易解離，而未與蛋白質(zhì)結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物容易被清除；（2）熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率；（3）熒光的顏色與背景組織的顏色對比鮮明。（4）結(jié)合蛋白質(zhì)后，不影響蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)及免疫學(xué)活性，而且色素與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法簡單而快速，結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。

5、（5）安全無毒，不具有附加的抗原性。第9頁/共68頁第8頁/共68頁熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大吸收光譜最大發(fā)射光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用應(yīng)用異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素 (FITC)(FITC) 490490495nm495nm520520530nm 530nm （黃綠色）（黃綠色） FATFAT、熒光偏振免疫測定、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明四乙基羅丹明 (RB200)(RB200)570570575nm575nm595595600nm600nm（橘紅色）（橘紅色）FITCFITC的襯比染色或雙標(biāo)記的襯比染色或雙標(biāo)記FATFAT四甲基異硫氰酸羅丹明四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC)(TRI

6、TC)550nm550nm620nm620nm（橙紅色）（橙紅色）FITCFITC的襯比染色或雙標(biāo)記的襯比染色或雙標(biāo)記FATFAT藻紅蛋白（藻紅蛋白（PEPE）490-560nm490-560nm595nm595nm（紅色）（紅色）雙標(biāo)記雙標(biāo)記FATFAT、流式細(xì)胞術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)EuEu3+3+螯合物螯合物340nm340nm613nm613nm時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定常用的熒光物質(zhì)常用的熒光物質(zhì) 第10頁/共68頁第9頁/共68頁第第二二節(jié)節(jié) 熒光抗體技術(shù)熒光抗體技術(shù)第11頁/共68頁第10頁/共68頁熒光抗體技術(shù)的基本原理熒光抗體技術(shù)的基本原理 熒光色素與特異性抗體以共價鍵

7、牢固結(jié)合，而不影響該免疫血清的熒光色素與特異性抗體以共價鍵牢固結(jié)合，而不影響該免疫血清的抗體活性，成為熒光標(biāo)記的抗體，在一定條件下使之在涂片上或組織切片抗體活性，成為熒光標(biāo)記的抗體，在一定條件下使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待測抗原特異性地結(jié)合，然后采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透上與標(biāo)本中的待測抗原特異性地結(jié)合，然后采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透過濾色板發(fā)出一定波長的光，激發(fā)標(biāo)本中結(jié)合的熒光素而產(chǎn)生熒光，借助過濾色板發(fā)出一定波長的光，激發(fā)標(biāo)本中結(jié)合的熒光素而產(chǎn)生熒光，借助熒光檢測儀察看熒光現(xiàn)象或測量熒光強(qiáng)度，從而判斷抗原或抗體的有無、熒光檢測儀察看熒光現(xiàn)象或測量熒光強(qiáng)度，從而判斷抗原或抗體的有無、

8、定位和分布情況，或檢測受檢標(biāo)本中抗原（抗體）的含量等。定位和分布情況，或檢測受檢標(biāo)本中抗原（抗體）的含量等。第12頁/共68頁第11頁/共68頁熒光抗體技術(shù)的內(nèi)容熒光抗體技術(shù)的內(nèi)容 抗體的純化抗體的純化 抗體的熒光色素標(biāo)記抗體的熒光色素標(biāo)記 標(biāo)記抗體的純化標(biāo)記抗體的純化 熒光標(biāo)記抗體染色熒光標(biāo)記抗體染色 熒光顯微鏡檢查熒光顯微鏡檢查第13頁/共68頁第12頁/共68頁抗體要求抗體要求 高純度高純度 高特異性高特異性 高親和力高親和力 高效價高效價一、熒光抗體的制備一、熒光抗體的制備第14頁/共68頁第13頁/共68頁v有能與蛋白質(zhì)形成共價健的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解有能與蛋白質(zhì)形成共價健

9、的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。v熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍保持較高的熒光效率。熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍保持較高的熒光效率。v熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。v與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。v標(biāo)記方法簡單、安全無毒。標(biāo)記方法簡單、安全無毒。v與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。熒光素要求熒光素要求熒光抗體的制備熒光抗體的制備第15頁/共68頁第14頁/共68頁抗體的熒光素標(biāo)抗體

10、的熒光素標(biāo)記記v標(biāo)記原理標(biāo)記原理: :利用抗體蛋白的自由氨基（利用抗體蛋白的自由氨基（-NH2-NH2）與）與FITCFITC的異硫氰基的異硫氰基(-(-N=C=S)N=C=S)在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與FITCFITC結(jié)合成熒光抗結(jié)合成熒光抗體。體。v標(biāo)記方法標(biāo)記方法: : 攪拌法：攪拌法：適于標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗體。標(biāo)記時間適于標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗體。標(biāo)記時間 短，熒光素用量少，但有非特異性染色。短，熒光素用量少，但有非特異性染色。 透析法：透析法：適于標(biāo)記樣品量少，蛋白含量低的抗體。標(biāo)記比較勻，適于標(biāo)記樣品量少，蛋白含量低

11、的抗體。標(biāo)記比較勻， 非特異染色較低，但熒光素用量多。非特異染色較低，但熒光素用量多。熒光抗體的制備熒光抗體的制備第16頁/共68頁第15頁/共68頁v溫度、時間溫度、時間vpHv蛋白含量蛋白含量v熒光素純度熒光素純度v熒光素用量熒光素用量熒光抗體標(biāo)記影響因素?zé)晒饪贵w標(biāo)記影響因素?zé)晒饪贵w的制備熒光抗體的制備第17頁/共68頁第16頁/共68頁v去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：透析或凝膠過濾透析或凝膠過濾v去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：陰離子交換層析法陰離子交換層析法v去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：動物肝粉吸收或

12、固相抗原吸收動物肝粉吸收或固相抗原吸收熒光抗體的純化熒光抗體的純化熒光抗體的制備熒光抗體的制備目的？目的？第18頁/共68頁第17頁/共68頁v熒光素與蛋白結(jié)合率：熒光素與蛋白結(jié)合率： F/P=F/P=v抗體效價：抗體效價：雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)v抗體特異性：抗體特異性：免疫電泳或交叉免疫電泳免疫電泳或交叉免疫電泳v抗體特異性染色滴度：抗體特異性染色滴度：倍比稀釋倍比稀釋nmnmAAA495280495nm35. 087. 2熒光抗體的鑒定熒光抗體的鑒定熒光抗體的制備熒光抗體的制備第19頁/共68頁第18頁/共68頁v-20-20：保存保存1 12 2年年v真空干燥：真空干燥：長期保

13、存長期保存熒光抗體的保存熒光抗體的保存熒光抗體的制備熒光抗體的制備第20頁/共68頁第19頁/共68頁組織切片：組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）冷凍切片、石蠟切片（最常用）印片：印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織 涂片：涂片：各種體液、穿刺液、細(xì)菌培養(yǎng)物和細(xì)胞懸液各種體液、穿刺液、細(xì)菌培養(yǎng)物和細(xì)胞懸液培養(yǎng)細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞：單層培養(yǎng)細(xì)胞單層培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本的類型標(biāo)本的類型二、標(biāo)本的制作二、標(biāo)本的制作第21頁/共68頁第20頁/共68頁冷凍切片：冷凍切片：操作簡單，抗原損失少，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠清晰。操作簡單，抗原損失少，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠清晰。 石蠟切片：石蠟切片：組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯

14、現(xiàn)清楚，抗原損失多。組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)清楚，抗原損失多。組織切片的類型組織切片的類型標(biāo)本的制作標(biāo)本的制作第22頁/共68頁第21頁/共68頁固定劑：固定劑：丙酮、乙醇、甲醇、甲醛等丙酮、乙醇、甲醇、甲醛等 保保 存：存：立即使用或立即使用或-20-20保存保存標(biāo)本標(biāo)本的固定和保存的固定和保存標(biāo)本的制作標(biāo)本的制作第23頁/共68頁第22頁/共68頁直接法直接法直接熒光抗體染色法示意圖直接熒光抗體染色法示意圖 熒光素標(biāo)記的特異熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。抗原反應(yīng)。三、熒光抗體染色及結(jié)果判斷三、熒光抗體染色及結(jié)果判斷第24頁/共68頁第23頁/共68頁間接法間接法特異性抗

15、體與相應(yīng)抗特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。體結(jié)合。 間接熒光抗體染色法示意圖間接熒光抗體染色法示意圖 熒光抗體染色及結(jié)果判斷第25頁/共68頁第24頁/共68頁雙標(biāo)記法雙標(biāo)記法 兩種熒光素分別標(biāo)記的兩種不同的特異性抗體，兩種熒光素分別標(biāo)記的兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。與同一標(biāo)本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。熒光抗體染色及結(jié)果判斷熒光抗體染色及結(jié)果判斷第26頁/共68頁第25頁/共68頁 設(shè)立實(shí)驗(yàn)對照設(shè)立實(shí)驗(yàn)對照: :陽性對照和陰性對照陽性對照和陰性對照 區(qū)分特異和非特異染色區(qū)分特異和非特

16、異染色 陽性細(xì)胞顯色分布陽性細(xì)胞顯色分布: :胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型熒光抗體染色結(jié)果判斷熒光抗體染色結(jié)果判斷熒光抗體染色及結(jié)果判斷熒光抗體染色及結(jié)果判斷第27頁/共68頁第26頁/共68頁 “- -”：無或僅見極微弱熒光。無或僅見極微弱熒光。 “+ +”：熒光較弱但清楚可見。熒光較弱但清楚可見。 “+”：熒光明亮。熒光明亮。 “+”：耀眼強(qiáng)熒光。耀眼強(qiáng)熒光。特異熒光強(qiáng)度特異熒光強(qiáng)度“+”以上判定為陽性，對照光應(yīng)呈以上判定為陽性，對照光應(yīng)呈“- -”或或“”。根據(jù)呈根據(jù)呈+的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價。的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價。 熒光抗體染色結(jié)果判斷熒光

17、抗體染色結(jié)果判斷熒光抗體染色及結(jié)果判斷熒光抗體染色及結(jié)果判斷第28頁/共68頁第27頁/共68頁熒光顯微鏡熒光顯微鏡 利用一定波長的激發(fā)光對利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對樣品結(jié)構(gòu)或其組分的熒光，對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。測。 四、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)四、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第29頁/共68頁第28頁/共68頁光源：光源：高壓汞燈、氙燈高壓汞燈、氙燈 濾光片：濾光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：光路：透射光、落射光透射光、落射光聚光器：聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器

18、明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：鏡頭：消色差鏡頭消色差鏡頭 熒光顯微鏡熒光顯微鏡熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第30頁/共68頁第29頁/共68頁隔熱濾光片：隔熱濾光片：阻斷紅外線通過而隔熱。阻斷紅外線通過而隔熱。 激發(fā)濾光片：激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過紫外線可見波長位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過紫外線可見波長 的光域，提供合適的激發(fā)光。的光域，提供合適的激發(fā)光。 吸收濾光片：吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，保護(hù)眼睛。保護(hù)眼睛。熒光顯微鏡熒光顯微鏡濾光片濾光片熒光顯微鏡的基本結(jié)

19、構(gòu)熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第31頁/共68頁第30頁/共68頁透射光：透射光：照明光線從標(biāo)照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過標(biāo)本本下經(jīng)聚光器透過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。進(jìn)入物鏡。落射光：落射光：照明光線從標(biāo)照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。入物鏡。透射熒光顯微鏡光路透射熒光顯微鏡光路(a)(a)落射熒光顯微鏡光路落射熒光顯微鏡光路(b)(b)熒光顯微鏡熒光顯微鏡光路光路熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第32頁/共68頁第31頁/共68頁第第三三節(jié)節(jié) 流式熒光免疫技術(shù)流式熒光免疫技術(shù)第33頁/共68頁第32頁/共68頁第第四四節(jié)節(jié) 熒光免疫分

20、析的類型熒光免疫分析的類型第34頁/共68頁第33頁/共68頁熒光免疫分析的基本原理熒光免疫分析的基本原理 將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測儀檢測抗原抗體復(fù)合物中特異性熒用熒光檢測儀檢測抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強(qiáng)度，對液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行光強(qiáng)度，對液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行定量測定。定量測定。第35頁/共68頁第34頁/共68頁熒光抗體技術(shù)熒光抗體技術(shù)熒光免疫測定熒光免疫測定均相熒光免疫測定均相熒光免疫測定（homogeneous fluorescence homogeneous fluorescence immunoa

21、ssayimmunoassay） 非均相熒光免疫測定非均相熒光免疫測定（heterogeneous fluorescence heterogeneous fluorescence immunoassayimmunoassay）熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，對抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測。感性相結(jié)合，對抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測。熒光免疫技術(shù)的類型熒光免疫技術(shù)的類型第36頁/共68頁第35頁/共68頁熒光免疫測定的方法類型熒光免疫測定的方法類型 非均相熒光免疫測定：非均相熒光免

22、疫測定： 時間分辨熒光免疫測定、熒光酶免疫測定時間分辨熒光免疫測定、熒光酶免疫測定 均相熒光免疫測定：均相熒光免疫測定： 熒光偏振免疫測定熒光偏振免疫測定第37頁/共68頁第36頁/共68頁自發(fā)熒光壽命短自發(fā)熒光壽命短: :1ns1ns10ns10ns鑭系元素壽命長鑭系元素壽命長: :10s10s1000s1000s短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系 元素特異熒光元素特異熒光 基本原理基本原理時間分辨檢測原理示意圖時間分辨檢測原理示意圖時間分辨時間分辨一、時間分辨熒光免疫測定一、時間分辨熒光免疫測定第38頁/共68頁第37頁/共68頁stokesstokes位移位移:

23、 :激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差鑭系元素鑭系元素StokesStokes位移大位移大(273nm)(273nm)，激發(fā)光譜，激發(fā)光譜 和發(fā)射光譜不重疊和發(fā)射光譜不重疊stokesstokes位移位移基本原基本原理理時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定第39頁/共68頁第38頁/共68頁發(fā)射光譜帶較窄：發(fā)射光譜帶較窄：613nm613nm10nm10nm，干擾少，干擾少 激發(fā)光譜帶較寬：激發(fā)光譜帶較寬：30nm30nm500nm500nm，靈敏度高，靈敏度高基本原理基本原理發(fā)射光譜和激發(fā)光譜發(fā)射光譜和激發(fā)光譜時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定第40頁/共68頁第

24、39頁/共68頁比活性：比活性：單位時間每個標(biāo)記分子被探測的信號量單位時間每個標(biāo)記分子被探測的信號量熒光激發(fā)光源熒光激發(fā)光源10001000次次/S/S激發(fā)，比活性提高激發(fā)，比活性提高基本原基本原理理熒光標(biāo)記物的相對比活性熒光標(biāo)記物的相對比活性時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定第41頁/共68頁第40頁/共68頁結(jié)合結(jié)合-二酮體二酮體EuEu3+3+解離解離酸性增強(qiáng)液酸性增強(qiáng)液熒光增強(qiáng)熒光增強(qiáng)EuEu3+3+標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物基本原理基本原理信號增強(qiáng)信號增強(qiáng)時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定第42頁/共68頁第41頁/共68頁 鑭系元素鑭系元素銪銪(Eu(Eu3+

25、3+) )（最常用）（最常用）釤釤(Sm(Sm3+3+) )鋱鋱(Tb(Tb3+3+) )釹釹(Nd(Nd3+3+) )鏑鏑(Dy(Dy3+3+) )標(biāo)記物標(biāo)記物熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)熒光壽命熒光壽命(ns)(ns)熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)熒光壽命熒光壽命(ns)(ns)非特異熒光背景非特異熒光背景1 11010SmSm3+3+ -NTA -NTA6500065000人血清蛋白人血清蛋白4.14.1SmSm3+3+-PTA-PTA6000060000球蛋白球蛋白3.03.0EuEu3+3+-NTA-NTA714000714000細(xì)胞色素細(xì)胞色素C C3.53.5EuEu3+3+-PTA-PTA9250009

26、25000FITCFITC4.54.5TbTb3+3+-PTA-PTA9600096000丹黃酰氯丹黃酰氯1414DyDy3+3+-PTA-PTA10001000羅丹明羅丹明B B3.03.0常見熒光物質(zhì)的熒光壽命時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定第43頁/共68頁第42頁/共68頁標(biāo)記方法標(biāo)記方法 雙功能螯合劑：雙功能螯合劑：1-1-（對（對- -苯偶氮）苯偶氮）-EDTA-EDTA異硫氰酸苯基異硫氰酸苯基-EDTA-EDTA異硫氰酸苯甲基異硫氰酸苯甲基-DTTA-DTTA二乙烯三胺五乙酸（二乙烯三胺五乙酸（DTPADTPA）標(biāo)記方法：標(biāo)記方法：一步法：先螯合一步法：先螯合EuEu3+

27、3+，再連接蛋白質(zhì)，再連接蛋白質(zhì)二步法：先連接蛋白質(zhì)，再螯合二步法：先連接蛋白質(zhì)，再螯合EuEu3+3+時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定第44頁/共68頁第43頁/共68頁方法類型方法類型 雙抗體夾心法雙抗體夾心法 固相抗體競爭法固相抗體競爭法 固相抗原競爭法固相抗原競爭法時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定第45頁/共68頁第44頁/共68頁方法類型方法類型時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖雙抗體夾心法雙抗體夾心法固相抗體和固相抗體和EuEu3+3+標(biāo)記抗體與待檢標(biāo)記抗體與待檢抗原結(jié)合，形成固相抗體抗原結(jié)合，形成固相抗體- -待檢

28、待檢抗原抗原-Eu-Eu3+3+標(biāo)記抗體復(fù)合物，酸標(biāo)記抗體復(fù)合物，酸性增強(qiáng)液下，性增強(qiáng)液下，EuEu3+3+解離，解離，340nm340nm激發(fā)光下發(fā)射激發(fā)光下發(fā)射613nm613nm熒光。熒光。時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定第46頁/共68頁第45頁/共68頁方法類型方法類型固相抗體競爭法固相抗體競爭法 待檢抗原和待檢抗原和EuEu3+3+標(biāo)記抗原與固相抗體競爭結(jié)合標(biāo)記抗原與固相抗體競爭結(jié)合, ,溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液, ,測定熒測定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒

29、光免疫測定第47頁/共68頁第46頁/共68頁方法類型方法類型固相抗原競爭法固相抗原競爭法 待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的EuEu3+3+標(biāo)記抗體，標(biāo)記抗體，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液, ,測定熒光強(qiáng)測定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定第48頁/共68頁第47頁/共68頁靈敏度高靈敏度高：最小檢出量最小檢出量1010-18-18mol/Lmol/L分析范圍寬：分析范圍寬：4 45 5個數(shù)量級個數(shù)量級標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用

30、期長測量快速，易自動化測量快速，易自動化易受污染，本底增高易受污染，本底增高方法評價方法評價時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定第49頁/共68頁第48頁/共68頁光線通過偏振濾光片后，光線通過偏振濾光片后，形成一個方向的平面光稱形成一個方向的平面光稱為偏振光為偏振光。偏振熒光偏振熒光( (綠光綠光,525nm,525nm550nm)550nm)偏振光偏振光( (藍(lán)光藍(lán)光,485nm),485nm)熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)基本原理基本原理二、熒光偏振免疫測定二、熒光偏振免疫測定第50頁/共68頁第49頁/共68頁 抗原抗體競爭反應(yīng)抗原抗體競爭反應(yīng)AgAgF F分子小，轉(zhuǎn)動速度快，偏振熒光弱分子小，

31、轉(zhuǎn)動速度快，偏振熒光弱 AgAgF F-Ab-Ab分子大，轉(zhuǎn)動速度慢，偏振熒光強(qiáng)分子大，轉(zhuǎn)動速度慢，偏振熒光強(qiáng) 若待檢抗原多，則若待檢抗原多，則AgAgF F-Ab-Ab少，少，AgAgF F多，偏振熒光弱多，偏振熒光弱待檢抗原含量與偏振熒光強(qiáng)度成反比待檢抗原含量與偏振熒光強(qiáng)度成反比熒光偏振免疫測定原理示意圖熒光偏振免疫測定原理示意圖 基本原理基本原理熒光偏振免疫測定熒光偏振免疫測定第51頁/共68頁第50頁/共68頁方法評價方法評價 樣品用量少樣品用量少 熒光素標(biāo)記試劑穩(wěn)定，使用壽命長熒光素標(biāo)記試劑穩(wěn)定，使用壽命長 重復(fù)性好重復(fù)性好 快速，易自動化快速，易自動化 適于小、中等分子物質(zhì)檢測適于

32、小、中等分子物質(zhì)檢測 靈敏度較非均相熒光免疫測定法低靈敏度較非均相熒光免疫測定法低熒光偏振免疫測定熒光偏振免疫測定第52頁/共68頁第51頁/共68頁基本原理基本原理熒光酶免疫測定熒光物質(zhì)產(chǎn)生示意圖熒光酶免疫測定熒光物質(zhì)產(chǎn)生示意圖 堿性磷酸酶標(biāo)記抗體或抗堿性磷酸酶標(biāo)記抗體或抗原，固相載體包被抗原或原，固相載體包被抗原或抗體，酶分解抗體，酶分解4-MUP4-MUP，脫，脫磷酸根基團(tuán)形成磷酸根基團(tuán)形成4-MU4-MU，360nm360nm激發(fā)光照射，發(fā)出激發(fā)光照射，發(fā)出450nm450nm熒光。熒光。三、熒光酶免疫測定三、熒光酶免疫測定第53頁/共68頁第52頁/共68頁酶和熒光底物酶和熒光底物熒

33、光酶免疫測定標(biāo)記用酶及熒光底物熒光酶免疫測定標(biāo)記用酶及熒光底物 標(biāo)記酶標(biāo)記酶底物底物熒光產(chǎn)物熒光產(chǎn)物激發(fā)光激發(fā)光(nm)(nm)熒光熒光(nm)(nm)相應(yīng)信號相應(yīng)信號堿性磷酸酶堿性磷酸酶4-MUP4-MUP4-MU4-MU3603604504501010-半乳糖苷酶半乳糖苷酶4-MUG4-MUG4-MU4-MU3603604504501010辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶HPAHPA二聚體二聚體3173174144140.030.03熒光酶免疫測定熒光酶免疫測定第54頁/共68頁第53頁/共68頁方法類型方法類型 雙抗體夾心法雙抗體夾心法 雙抗原夾心法雙抗原夾心法 固相抗原競爭法固相抗原競爭法

34、熒光酶免疫測定熒光酶免疫測定第55頁/共68頁第54頁/共68頁方法類型方法類型雙抗體夾心法雙抗體夾心法固相抗體和酶標(biāo)記抗體與固相抗體和酶標(biāo)記抗體與待檢原反應(yīng)，形成固相抗待檢原反應(yīng)，形成固相抗體體- -抗原抗原- -酶標(biāo)抗體復(fù)合物，酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光反加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光反應(yīng)，發(fā)光量與待檢抗原含應(yīng)，發(fā)光量與待檢抗原含量成正比。量成正比。熒光酶免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖熒光酶免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖 熒光酶免疫測定熒光酶免疫測定第56頁/共68頁第55頁/共68頁方法類型方法類型雙抗原夾心法雙抗原夾心法 固相抗原和酶標(biāo)抗原與待檢抗體反應(yīng)，形成固相固相抗原和酶標(biāo)抗原與待

35、檢抗體反應(yīng)，形成固相抗原抗原- -待檢抗體待檢抗體- -酶標(biāo)抗原復(fù)合物，加入底物進(jìn)行酶標(biāo)抗原復(fù)合物，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光，發(fā)光量與待檢抗體含量成正比。酶促發(fā)光，發(fā)光量與待檢抗體含量成正比。 熒光酶免疫測定熒光酶免疫測定第57頁/共68頁第56頁/共68頁方法類型方法類型固相抗原競爭法固相抗原競爭法 待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的酶標(biāo)抗體，洗滌待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的酶標(biāo)抗體，洗滌除去未結(jié)合部分，固相抗原與酶標(biāo)抗體形成的復(fù)合物被留除去未結(jié)合部分，固相抗原與酶標(biāo)抗體形成的復(fù)合物被留下來，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光反應(yīng)，熒光強(qiáng)度與待檢抗原下來，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光反應(yīng)，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反

36、比。含量成反比。熒光酶免疫測定熒光酶免疫測定第58頁/共68頁第57頁/共68頁方法評價方法評價 用酶和熒光底物的化學(xué)反應(yīng)作為放大系統(tǒng)，提高靈敏度用酶和熒光底物的化學(xué)反應(yīng)作為放大系統(tǒng)，提高靈敏度背景熒光干擾測定，用固相熒光酶免疫測定效果好背景熒光干擾測定，用固相熒光酶免疫測定效果好熒光酶免疫測定熒光酶免疫測定第59頁/共68頁第58頁/共68頁第第四四節(jié)節(jié) 熒光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用熒光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用第60頁/共68頁第59頁/共68頁自身抗體檢測自身抗體檢測抗核抗體抗核抗體( (均質(zhì)型均質(zhì)型) )抗核抗體抗核抗體( (核膜型核膜型) )抗核抗體抗核抗體( (斑點(diǎn)型斑點(diǎn)型) )

37、一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用第61頁/共68頁第60頁/共68頁病原體檢測病原體檢測寄生蟲（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲）寄生蟲（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲）細(xì)菌（藤黃微球菌細(xì)菌（藤黃微球菌 ) )熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用第62頁/共68頁第61頁/共68頁免疫病理檢測免疫病理檢測腫瘤（人肝癌細(xì)胞）腫瘤（人肝癌細(xì)胞）熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用第63頁/共68頁第62頁/共68頁細(xì)胞表面抗原和受體檢測細(xì)胞表面抗原和受體檢測將游離細(xì)胞作熒光抗體特異染色后，在特殊將游離細(xì)胞作熒光抗體特異染色后，在特殊設(shè)計(jì)的儀器中通過噴嘴逐個流出，經(jīng)單色激設(shè)計(jì)的儀器中通過噴嘴逐個流出，經(jīng)單色激光照射發(fā)出的熒光信號由熒光檢測計(jì)檢測，光照射發(fā)出的熒光信號由熒光檢測計(jì)檢測，并自動處理各種數(shù)據(jù)。并自動處理各種數(shù)據(jù)。 特殊應(yīng)用：流式細(xì)胞分析特殊應(yīng)用：流式細(xì)胞分析熒光免疫技術(shù)可用于淋巴細(xì)胞表面熒光免疫技術(shù)可用于淋巴細(xì)胞表面CDCD抗原、抗原、抗原受體、補(bǔ)體受體、抗原受體、補(bǔ)體受體、FcFc受體等的檢測以及受體等的檢測以及淋巴細(xì)胞及其亞群的鑒定和計(jì)數(shù)。淋巴細(xì)胞