病理解剖技術

1、病理解剖學技術（The technique of Pathology哈爾濱醫(yī)科大學病理教研室哈爾濱醫(yī)科大學病理教研室金曉明金曉明序： 病理學的理論和技術被視為一輛車的兩個車輪，病理學的理論和技術被視為一輛車的兩個車輪，缺一不可，互為依存，互相促進，兩者的結(jié)合決缺一不可，互為依存，互相促進，兩者的結(jié)合決定病理學的發(fā)展。定病理學的發(fā)展。病理學的技術主要體現(xiàn)在幾個結(jié)合上病理學的技術主要體現(xiàn)在幾個結(jié)合上1.傳統(tǒng)病理學技術與現(xiàn)代生物新技術相結(jié)合傳統(tǒng)病理學技術與現(xiàn)代生物新技術相結(jié)合2.宏觀、臟器、組織、細胞、超微與分子基因不同層次技術宏觀、臟器、組織、細胞、超微與分子基因不同層次技術相結(jié)合相結(jié)合3.形態(tài)、

2、機能與代謝變化相結(jié)合形態(tài)、機能與代謝變化相結(jié)合4.定性、定位與定量觀測相結(jié)合定性、定位與定量觀測相結(jié)合5.實驗研究技術與臨床應用技術相結(jié)合實驗研究技術與臨床應用技術相結(jié)合6.技術的基本原理與具體方法相結(jié)合技術的基本原理與具體方法相結(jié)合7.基本技術知識與作者實踐經(jīng)驗相結(jié)合基本技術知識與作者實踐經(jīng)驗相結(jié)合病理學的發(fā)展與使用的工具病理學的發(fā)展與使用的工具和方法的更新密切相關和方法的更新密切相關1.用解剖刀剪等進行尸體檢查，開展了器官病理學用解剖刀剪等進行尸體檢查，開展了器官病理學2.顯微鏡發(fā)明百年之后，建立了細胞病理學顯微鏡發(fā)明百年之后，建立了細胞病理學3.電子顯微鏡的問世，發(fā)展了超微病理學電子顯微

3、鏡的問世，發(fā)展了超微病理學4.免疫組織化學促進了免疫病理學的發(fā)展免疫組織化學促進了免疫病理學的發(fā)展5.分子生物學帶動了分子病理學的興起分子生物學帶動了分子病理學的興起6.計算機及其網(wǎng)絡的應用，將病理學走向信息病理學時代計算機及其網(wǎng)絡的應用，將病理學走向信息病理學時代傳統(tǒng)病理學技術：傳統(tǒng)病理學技術： 傳統(tǒng)的傳統(tǒng)的Formalin固定，石蠟切片和固定，石蠟切片和HE染色技染色技術仍是病理學的基本技術，大量應用與基礎和臨術仍是病理學的基本技術，大量應用與基礎和臨床病理學日常工作中，保證和提高常規(guī)質(zhì)量和現(xiàn)床病理學日常工作中，保證和提高常規(guī)質(zhì)量和現(xiàn)代設備水平十分重要。代設備水平十分重要。第一章：病理解剖

4、技術第一章：病理解剖技術一、病理解剖的意義一、病理解剖的意義 病理解剖技術是病理學的基礎之一，是病理學不可病理解剖技術是病理學的基礎之一，是病理學不可分割的一部分。分割的一部分。 通過病理解剖收集病理教學及科研資料是其中一個通過病理解剖收集病理教學及科研資料是其中一個途徑，大量病理資料的積累促進了醫(yī)學的發(fā)展與進步。途徑，大量病理資料的積累促進了醫(yī)學的發(fā)展與進步。 病理解剖是通過解剖尸體觀察和發(fā)現(xiàn)死者器官、組病理解剖是通過解剖尸體觀察和發(fā)現(xiàn)死者器官、組織的病理變化，找出主要病變，分析判斷直接死亡的一織的病理變化，找出主要病變，分析判斷直接死亡的一個重要方法。個重要方法。二、病理解剖室的設備和器械

5、二、病理解剖室的設備和器械1. 設備：設備：1解剖室的設計要求解剖室的設計要求 最好位于太平間；最好位于太平間； 室內(nèi)面積要大，必須有兩個門；室內(nèi)面積要大，必須有兩個門； 地面用水磨石，四周有排水溝或地漏；地面用水磨石，四周有排水溝或地漏； 室內(nèi)通風好；室內(nèi)通風好； 有消毒室，男女更衣室，浴室等。有消毒室，男女更衣室，浴室等。2解剖臺的設計解剖臺的設計 高低和大小要合適高低和大小要合適 臺面可用水磨石或不銹鋼臺面可用水磨石或不銹鋼 有條件可購置能夠升降的解剖臺有條件可購置能夠升降的解剖臺 解剖臺可帶有抽氣的功能等解剖臺可帶有抽氣的功能等 水磨石臺面的解剖臺水磨石臺面的解剖臺水磨石臺面的解剖臺水

6、磨石臺面的解剖臺不銹鋼臺面的解剖臺不銹鋼臺面的解剖臺病理解剖器械2. 器械：3. 清潔、消毒和個人保護清潔、消毒和個人保護1病理解剖室的清潔和消毒病理解剖室的清潔和消毒2病理解剖器械的清潔和消毒病理解剖器械的清潔和消毒3個人保護等個人保護等三、病理解剖的方法和步驟三、病理解剖的方法和步驟1. 病理解剖前的準備病理解剖前的準備 主要辦理一切手續(xù)，非常重要。主要辦理一切手續(xù)，非常重要。2. 體表檢查體表檢查體表檢查體表檢查尸斑，尸僵尸斑，尸僵3. 胸腹腔檢查胸腹腔檢查1切口切口2腹腔檢查腹腔檢查3胸腔檢查胸腔檢查腹腔有滲出液腹腔有滲出液心包積液（血液氣管周圍血液液體稱量4. 內(nèi)臟器官的取出及檢查內(nèi)

7、臟器官的取出及檢查 一般有兩種方法：一般有兩種方法：1各臟器分別取出法各臟器分別取出法 是病理解剖最常用的方法是病理解剖最常用的方法2多臟器聯(lián)合取出法多臟器聯(lián)合取出法 此法比較簡單，可保持各器官的完整性。此法比較簡單，可保持各器官的完整性。心臟表面充血絨毛心雙肺和支氣管肝臟表面有結(jié)節(jié)胰腺，出血改變腸管，出血腦腦干出血第二章第二章 病理大體標本的制作病理大體標本的制作一、大體標本的收集、取材、固定和保存一、大體標本的收集、取材、固定和保存1.大體標本的收集大體標本的收集 通過尸體解剖和活體組織（包括外科手術切通過尸體解剖和活體組織（包括外科手術切除標本和活體組織穿刺標本除標本和活體組織穿刺標本檢

8、查時發(fā)現(xiàn)并收檢查時發(fā)現(xiàn)并收集。集。2.大體標本的取材大體標本的取材取材室條件：取材室條件：通風要好，必須有排風通風要好，必須有排風設備；設備；固定的組織取材前要用固定的組織取材前要用流水充分沖洗；流水充分沖洗；排水要遠離住宅區(qū)等排水要遠離住宅區(qū)等不同器官的取材和固定不同：不同器官的取材和固定不同：1實質(zhì)性的器官：如肝、脾等實質(zhì)性的器官：如肝、脾等 要注意，實質(zhì)器官不容易被固定液所穿透。要注意，實質(zhì)器官不容易被固定液所穿透。肝癌肝癌肝癌肝癌肝癌肝癌肝癌2空腔器官：如胃、腸等空腔器官：如胃、腸等 取材時要看全層，保持粘膜、肌層和漿膜全取材時要看全層，保持粘膜、肌層和漿膜全層的組織。層的組織。胃癌，

9、呈菜花狀胃癌，呈菜花狀切面的形狀切面的形狀胃癌，潰瘍型胃癌，潰瘍型切面的形狀切面的形狀切面的形狀，切面的形狀，浸潤性至漿膜浸潤性至漿膜潰瘍型胃癌潰瘍型胃癌潰瘍型胃癌潰瘍型胃癌切面的形狀，浸潤切面的形狀，浸潤性至漿膜性至漿膜3肺肺 肺組織比較疏松，固定液容易滲透。肺組織比較疏松，固定液容易滲透。 肺組織的取材要清楚的了解各葉肺組織所伴肺組織的取材要清楚的了解各葉肺組織所伴隨的支氣管。隨的支氣管。 A：主支氣管B：葉支氣管肺肺和和氣氣管管周周圍圍的的淋淋巴巴結(jié)結(jié)肺癌肺癌肺門型肺門型肺癌肺癌肺門與周肺門與周圍之間圍之間肺癌肺癌周圍型周圍型肺癌肺癌空洞型空洞型4）其它類型 外科手術標本常見： 乳腺癌

10、子宮頸癌 腸癌 卵巢腫瘤等乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌子宮頸癌子宮頸癌子宮頸癌子宮頸癌子宮頸癌，切面3.大體標本的固定大體標本的固定1固定的目的：固定的目的： 將受檢組織盡快地侵入固定液內(nèi)，使組織和細將受檢組織盡快地侵入固定液內(nèi)，使組織和細胞的固有成分迅速凝固，防治自溶和腐敗，使其保胞的固有成分迅速凝固，防治自溶和腐敗，使其保持與生活狀態(tài)有相似的結(jié)構，以利于切片和觀察。持與生活狀態(tài)有相似的結(jié)構，以利于切片和觀察。2固定液的選擇：固定液的選擇：A.甲醛（甲醛（Fomaldehyde，又稱福爾馬林，其濃度在，又稱福爾馬林，其濃度在4，它是一種還原劑，極易揮發(fā)，散發(fā)出強烈的刺，它是一種

11、還原劑，極易揮發(fā)，散發(fā)出強烈的刺激性氣體，使人流鼻涕、流眼淚，呼吸道有異物感。激性氣體，使人流鼻涕、流眼淚，呼吸道有異物感。B.95酒精（乙醇酒精（乙醇，除具有固定組織的作用外，尚，除具有固定組織的作用外，尚有脫水作用。有脫水作用。3固定液的特性固定液的特性 甲醛固定液滲透力強，固定均勻，對組織收甲醛固定液滲透力強，固定均勻，對組織收縮較小，并能增加組織韌性的優(yōu)點，而且可以?？s較小，并能增加組織韌性的優(yōu)點，而且可以保存組織內(nèi)的脂類物質(zhì)，對組織的主要作用為硬化存組織內(nèi)的脂類物質(zhì)，對組織的主要作用為硬化和防腐。和防腐。 酒精可以保存組織內(nèi)的糖類物質(zhì)及尿酸結(jié)晶，酒精可以保存組織內(nèi)的糖類物質(zhì)及尿酸結(jié)晶

12、，不過，它常使組織明顯收縮，且使脂類物質(zhì)溶解。不過，它常使組織明顯收縮，且使脂類物質(zhì)溶解。4. 大體標本的脫水、包埋和切片大體標本的脫水、包埋和切片 為能制成滿意的切片，固定后的組織還要經(jīng)過為能制成滿意的切片，固定后的組織還要經(jīng)過脫水、透明、浸蠟及包埋等一系列程序。脫水、透明、浸蠟及包埋等一系列程序。1脫水：目的是將固定了的組織內(nèi)水分除去。以脫水：目的是將固定了的組織內(nèi)水分除去。以便使切片時的支撐物（石蠟便使切片時的支撐物（石蠟充分進入組織內(nèi)。常充分進入組織內(nèi)。常用的是酒精。用的是酒精。2透明：目的是使能與石蠟結(jié)合溶解的媒介劑進透明：目的是使能與石蠟結(jié)合溶解的媒介劑進入組織，進而將不能與石蠟結(jié)

13、合的脫水劑置換出來，入組織，進而將不能與石蠟結(jié)合的脫水劑置換出來，并使組織透明。常用的是二甲苯。并使組織透明。常用的是二甲苯。3浸透和包埋：可使組織具有一定的硬度和韌度，浸透和包埋：可使組織具有一定的硬度和韌度，便于切成薄的切片。常用的石蠟溶點為便于切成薄的切片。常用的石蠟溶點為6062，有時為保存更多的抗原成分?？刹捎玫腿茳c石蠟有時為保存更多的抗原成分?？刹捎玫腿茳c石蠟（4850 。4切片切片切片機類型：切片機類型： 旋轉(zhuǎn)式切片機旋轉(zhuǎn)式切片機 滑動式切片機滑動式切片機旋轉(zhuǎn)式切片機旋轉(zhuǎn)式切片機5. HE（Hematoxin Eosin,HE染色染色1蘇木素染色配方：蘇木素染色配方： 蘇木素蘇木

14、素 1g 純酒精純酒精 10ml 鉀明礬鉀明礬 20g 蒸餾水蒸餾水 200ml 氯化汞氯化汞 0.5g2伊紅染色配方：伊紅染色配方： 伊紅伊紅 0.5-1g 蒸餾水蒸餾水 99mlHE染色法：染色法：1蘇木素染色蘇木素染色57分鐘；分鐘；2自來水沖洗多余的染液；自來水沖洗多余的染液；31鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘，使細胞核呈紫藍色鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘，使細胞核呈紫藍色4自來水中充分洗滌；自來水中充分洗滌；51氨水中數(shù)秒，至返藍；氨水中數(shù)秒，至返藍；6自來水中至蒸餾水沖洗；自來水中至蒸餾水沖洗；71的伊紅染色，的伊紅染色，3分鐘左右；分鐘左右； 結(jié)果：細胞核呈紫藍色，細胞漿呈粉紅色，基結(jié)果：細胞核呈紫藍

15、色，細胞漿呈粉紅色，基底膜，膠原纖維及肌纖維呈粉紅色。底膜，膠原纖維及肌纖維呈粉紅色。HE切片切片第三章第三章 特殊染色特殊染色 HE染色雖是一種快速、經(jīng)濟、且易掌握的染色雖是一種快速、經(jīng)濟、且易掌握的方法，但它不能回答病因?qū)W、方法，但它不能回答病因?qū)W、Z組織發(fā)生及發(fā)病組織發(fā)生及發(fā)病機制等方面的許多問題。而特殊染色可以協(xié)助機制等方面的許多問題。而特殊染色可以協(xié)助解決病理診斷問題。解決病理診斷問題。目前市場上有配制好的特殊染色試劑目前市場上有配制好的特殊染色試劑介紹常用的幾種特殊染色介紹常用的幾種特殊染色1. 脂肪染色脂肪染色 主要用于心、肝、腎的脂肪變性，動脈粥樣硬化，主要用于心、肝、腎的脂肪

16、變性，動脈粥樣硬化，以及因脂肪栓塞導致的死亡病例鑒定等。以及因脂肪栓塞導致的死亡病例鑒定等。1試劑配制：蘇丹染液試劑配制：蘇丹染液 蘇丹蘇丹III或蘇丹或蘇丹IV0.5g，70%乙醇乙醇250ml，丙酮，丙酮250ml。2染色方法：染色方法：（1標本常規(guī)甲醛固定后流水沖洗標本常規(guī)甲醛固定后流水沖洗12h；（2用濾紙吸干標本表面的水分，把標本放入蘇丹用濾紙吸干標本表面的水分，把標本放入蘇丹III染液中染液中浸泡浸泡30min；（3用用70乙醇分化，以脂肪組織呈橙黃色，其它組織不著色乙醇分化，以脂肪組織呈橙黃色，其它組織不著色為佳；為佳；（4水洗后浸存在水洗后浸存在5甲醛液中，為了防腐可加入適量的

17、防腐甲醛液中，為了防腐可加入適量的防腐劑。劑。 肝脂肪變蘇丹III染色2. 過碘酸過碘酸(periodic acid)-schiff染色，即染色，即PAS染色染色 此技術主要顯示糖原（在淀粉酶消化對照下此技術主要顯示糖原（在淀粉酶消化對照下、中性粘液物質(zhì)、基底膜、霉菌和寄生蟲等。中性粘液物質(zhì)、基底膜、霉菌和寄生蟲等。1 schiff氏試劑的配方：氏試劑的配方：（1將將200ml蒸餾水煮沸；蒸餾水煮沸；（2冷卻至冷卻至90時，慢慢加入堿性復紅時，慢慢加入堿性復紅1g;（3攪拌并煮沸攪拌并煮沸5分鐘使其全溶；分鐘使其全溶；（4冷卻至冷卻至50時過濾，并加入時過濾，并加入1N鹽酸鹽酸20ml；（5冷

18、卻至冷卻至25時，再加入無水亞硝酸鈉時，再加入無水亞硝酸鈉1g并攪拌勻。并攪拌勻。（6置入遮光瓶內(nèi)并放入在置入遮光瓶內(nèi)并放入在4冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。冰箱?nèi)保存?zhèn)溆谩?PAS染色方法：染色方法：（11過碘酸水溶液染過碘酸水溶液染10分鐘，使含有乙二醇的化合物氧分鐘，使含有乙二醇的化合物氧化形成醛基；化形成醛基；（2蒸餾水洗去過碘酸；蒸餾水洗去過碘酸；（3 schiff氏試劑反應氏試劑反應15分鐘，使醛基和分鐘，使醛基和schiff氏試劑結(jié)合，氏試劑結(jié)合，形成紫紅色產(chǎn)物；形成紫紅色產(chǎn)物；（40.5%亞硝酸鈉亞硝酸鈉(NaHSO3)處理三次，每次處理三次，每次2分鐘；分鐘；（5流水沖洗流水沖洗510分鐘

19、；分鐘；（6用蘇木素染色液復染細胞核；用蘇木素染色液復染細胞核；7水洗或水洗或1鹽酸酒精分化。鹽酸酒精分化。3結(jié)果：結(jié)果： 細胞核呈藍色，基底膜呈紅色，膠原纖維、肌細胞核呈藍色，基底膜呈紅色，膠原纖維、肌纖維及細胞漿呈紅色。纖維及細胞漿呈紅色。過碘酸Schiff反應：糖元及其他PAS反應陽性物質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色PAS念珠菌（念珠菌（PAS染色）染色）附：附：AB/PAS法（阿爾辛藍過碘酸雪夫染色法法（阿爾辛藍過碘酸雪夫染色法結(jié)果：中性粘液物質(zhì)呈紅色，酸性粘液物質(zhì)呈藍結(jié)果：中性粘液物質(zhì)呈紅色，酸性粘液物質(zhì)呈藍 色，中性和酸性粘液的混合物質(zhì)呈紫色。色，中性和酸性粘液的混合物質(zhì)呈紫色。阿爾辛藍阿

20、爾辛黃法：常用于黏液上皮腫瘤的鑒別診斷阿爾辛藍阿爾辛黃法：常用于黏液上皮腫瘤的鑒別診斷阿爾辛藍過碘酸雪夫反應：是顯示中性和酸性黏液物質(zhì)的有效方法阿爾辛藍過碘酸雪夫反應：是顯示中性和酸性黏液物質(zhì)的有效方法HID/AB:高鐵二胺奧新藍法高鐵二胺奧新藍法AB/PAS3. 六胺銀（六胺銀（PASM染色染色 在腎臟活體組織檢查和一些真菌感染的組織在腎臟活體組織檢查和一些真菌感染的組織選用此方法。選用此方法。1PASM染液的配方：染液的配方： 2硝酸銀水溶液硝酸銀水溶液3ml； 3六次甲基四胺液六次甲基四胺液25ml； 5硼砂硼砂2ml。注：注：2硝酸銀配制胺溶液，染色時間硝酸銀配制胺溶液，染色時間40分

21、鐘，溫度分鐘，溫度 5560，隨時鏡下觀察便于控制。，隨時鏡下觀察便于控制。 2PASM染色法染色法：（11過碘酸水溶液內(nèi)染過碘酸水溶液內(nèi)染10分鐘；分鐘；（2自來水沖洗，蒸餾水沖洗；自來水沖洗，蒸餾水沖洗；（3入入5鉻酸水溶液鉻酸水溶液40分鐘，出此溶液后用分鐘，出此溶液后用1亞硫酸鈉除亞硫酸鈉除掉鉻酸；掉鉻酸；（4自來水洗數(shù)次，蒸餾水洗自來水洗數(shù)次，蒸餾水洗34次；次；（5入六胺銀染液（入六胺銀染液（506040分鐘，分鐘，20分鐘后，每分鐘后，每5分鐘分鐘鏡下觀察一次，蒸餾水洗四次；鏡下觀察一次，蒸餾水洗四次；（6入入0.2%氯化金水溶液氯化金水溶液12分鐘，蒸餾水洗三次；分鐘，蒸餾水洗

22、三次；（7入入5硫代硫酸鈉水溶液硫代硫酸鈉水溶液12分鐘，蒸餾水洗數(shù)次；分鐘，蒸餾水洗數(shù)次；（8復染復染HE，脫水、透明、封片，脫水、透明、封片結(jié)果：結(jié)果：底膜呈黑色，網(wǎng)狀纖維呈黑色，細胞核呈藍色，底膜呈黑色，網(wǎng)狀纖維呈黑色，細胞核呈藍色，背景呈粉紅色。背景呈粉紅色。PASM染色染色PASM染色染色PASMPASM附：附：PASM對真菌的染色對真菌的染色 真菌（真菌（fungus，又稱霉菌，其種類較多。，又稱霉菌，其種類較多。 真菌的基本結(jié)構成分是含有較多的粘多糖和蛋白質(zhì)。真菌的基本結(jié)構成分是含有較多的粘多糖和蛋白質(zhì)。1試劑的配制：試劑的配制：（1六次甲基四胺、硝酸銀原液（簡稱六胺銀原液六次甲

23、基四胺、硝酸銀原液（簡稱六胺銀原液。3六六次甲基四胺水溶液次甲基四胺水溶液100ml，5硝酸銀水溶液硝酸銀水溶液5ml；（2六胺銀硼砂染色液。六胺銀原液六胺銀硼砂染色液。六胺銀原液25ml，蒸餾水，蒸餾水25ml，5硼砂水溶液硼砂水溶液2ml；（3核固紅染液。核固紅核固紅染液。核固紅0.1g，硫酸鋁，硫酸鋁5g，蒸餾水，蒸餾水100ml；（4亮綠染色液。亮綠亮綠染色液。亮綠0.2g，蒸餾水，蒸餾水100ml，冰醋酸，冰醋酸0.2ml。2染色步驟：染色步驟：（15鉻酸水溶液氧化鉻酸水溶液氧化1小時，流水洗小時，流水洗2分鐘，蒸餾水洗分鐘，蒸餾水洗2次；次；（2浸入浸入1亞硫酸鈉水溶液除掉鉻酸亞硫

24、酸鈉水溶液除掉鉻酸1分鐘，流水洗分鐘，流水洗5分鐘，分鐘，蒸餾水洗蒸餾水洗3次；次；（3浸入六胺銀硼砂液染色浸入六胺銀硼砂液染色11.5小時（小時（4050溫箱內(nèi)溫箱內(nèi)，至切片呈淺棕色，蒸餾水至切片呈淺棕色，蒸餾水3次；次；（4用用0.2%氯化金水溶液調(diào)色氯化金水溶液調(diào)色3分鐘，蒸餾水稍洗；分鐘，蒸餾水稍洗；（5核固紅染色細胞核核固紅染色細胞核10分鐘，流水洗，蒸餾水洗；分鐘，流水洗，蒸餾水洗；（6亮綠染色液亮綠染色液30秒，用蒸餾水快速稍洗；秒，用蒸餾水快速稍洗；（7無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果：結(jié)果：真菌均呈黑色，菌絲和孢子呈黑褐色，

25、細胞核真菌均呈黑色，菌絲和孢子呈黑褐色，細胞核呈紅色，背景呈淡綠色。呈紅色，背景呈淡綠色。念珠菌（假菌絲）念珠菌（假菌絲）新生隱球菌性腦膜炎新生隱球菌性腦膜炎4. 淀粉樣物質(zhì)染色（介紹剛果紅染色）淀粉樣物質(zhì)染色（介紹剛果紅染色） 淀粉樣物質(zhì)是一種嗜伊紅性物質(zhì)，性質(zhì)屬于糖蛋淀粉樣物質(zhì)是一種嗜伊紅性物質(zhì)，性質(zhì)屬于糖蛋白成分。組織出現(xiàn)此物質(zhì)稱為淀粉樣變性。白成分。組織出現(xiàn)此物質(zhì)稱為淀粉樣變性。1試劑配制：試劑配制：（1剛果紅染色液。剛果紅剛果紅染色液。剛果紅1g，蒸餾水，蒸餾水100ml；（2Harris蘇木素染色液。蘇木素染色液。2染色步驟：染色步驟：（1蘇木素染色液浸染蘇木素染色液浸染2分鐘；分

26、鐘；（20.5%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘；鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘；（3流水洗，蒸餾水洗流水洗，蒸餾水洗2次；次；（4剛果紅染色液中剛果紅染色液中25分鐘；分鐘；（5無水乙醇迅速脫水無水乙醇迅速脫水2次；次；（6二甲苯透明，中性樹膠封固。二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果：結(jié)果：淀粉樣物質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色。淀粉樣物質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色。剛果紅染色剛果紅染色5. Mallory三色染色法（屬于結(jié)締組織復合染色法三色染色法（屬于結(jié)締組織復合染色法1試劑配制：試劑配制：（1重鉻酸鉀液。重鉻酸鉀重鉻酸鉀液。重鉻酸鉀2.5g，醋酸，醋酸5ml，蒸餾水，蒸餾水95ml；（2苯胺藍橘黃苯胺藍橘黃G液。苯胺藍液。苯胺藍

27、0.5g，橘黃，橘黃2g，磷鎢酸，磷鎢酸1g，蒸餾水蒸餾水100ml；（3酸性復紅液。酸性復紅酸性復紅液。酸性復紅0.5g，蒸餾水，蒸餾水100ml。2染色步驟：染色步驟：（1重鉻酸鉀液重鉻酸鉀液10分鐘；分鐘；（2流水洗流水洗2分鐘，蒸餾水洗分鐘，蒸餾水洗2次；次；（3酸性復紅液酸性復紅液2分鐘，蒸餾水稍洗；分鐘，蒸餾水稍洗；（4苯胺藍液苯胺藍液20分鐘，分鐘，95乙醇快速分化；乙醇快速分化；（5直接用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。直接用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果：結(jié)果：膠原和網(wǎng)狀纖維呈藍色，軟骨、粘液、淀粉膠原和網(wǎng)狀纖維呈藍色，軟骨、粘液、淀粉樣變性物質(zhì)呈淡藍色

28、，神經(jīng)膠質(zhì)纖維、肌纖維和酸樣變性物質(zhì)呈淡藍色，神經(jīng)膠質(zhì)纖維、肌纖維和酸性顆粒呈紅色，髓鞘和紅細胞呈橘紅色。性顆粒呈紅色，髓鞘和紅細胞呈橘紅色。特點：利用酸性復紅、苯胺藍、橘黃特點：利用酸性復紅、苯胺藍、橘黃G這三種染料對結(jié)締組織和這三種染料對結(jié)締組織和非結(jié)締組織進行著色。非結(jié)締組織進行著色。Mallory6. Masson三色染色法三色染色法1試劑配制試劑配制（1Masson復合染色液。堿性復紅復合染色液。堿性復紅1g，麗春紅，麗春紅2g，橘黃，橘黃G2g，0.25%醋酸醋酸300ml；（2）亮綠染色液。亮綠）亮綠染色液。亮綠SF0.1g，0.2%醋酸醋酸100ml。2染色步驟染色步驟（1 M

29、asson復合染色液復合染色液5分鐘；分鐘；（2 0.2%醋酸水溶液稍洗；醋酸水溶液稍洗；（35磷鎢酸磷鎢酸510分鐘；分鐘；（4 0.2%醋酸水溶液浸洗醋酸水溶液浸洗2次；次；（5亮綠染色液亮綠染色液5分鐘；分鐘；（6 0.2%醋酸水洗醋酸水洗2次；次；（7無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果：結(jié)果： 細胞核呈紅色，基底膜、膠原纖維呈藍細胞核呈紅色，基底膜、膠原纖維呈藍綠色，免疫復合物呈紅色。綠色，免疫復合物呈紅色。 適用于腦垂體、上皮、甲狀腺、神經(jīng)的正常和腫瘤組織適用于腦垂體、上皮、甲狀腺、神經(jīng)的正常和腫瘤組織Masson腎小球腎小球左：左：

30、HE染色染色右：右：Masson染色，膠原組織呈藍色，彈力纖維棕色，肌纖維、染色，膠原組織呈藍色，彈力纖維棕色，肌纖維、 纖維素、紅細胞呈紅色，胞核呈黑藍色。纖維素、紅細胞呈紅色，胞核呈黑藍色。7. 彈力纖維染色法彈力纖維染色法 病理診斷應用彈力纖維染色，目的是觀察組織內(nèi)彈力病理診斷應用彈力纖維染色，目的是觀察組織內(nèi)彈力纖維是否增生或破壞、斷裂和崩解，從而幫助診斷。纖維是否增生或破壞、斷裂和崩解，從而幫助診斷。試劑配制：試劑配制： 地衣紅酒精液地衣紅酒精液 1g 70%酒精酒精 100ml 濃鹽酸濃鹽酸 1ml結(jié)果：結(jié)果：Taner-Unna法，彈力纖維呈深棕紅色。法，彈力纖維呈深棕紅色。 V

31、erhoeff鐵蘇木素染色法，彈力纖維呈黑色。鐵蘇木素染色法，彈力纖維呈黑色。Verhoeff鐵蘇木素染色法：彈力纖維黑色或黑藍色，胞核黑色，膠原纖維呈紅色Verhoeff鐵蘇木鐵蘇木素染色素染色法法Lendrum纖維纖維素染色法素染色法顯示腎小球毛顯示腎小球毛細血管腔內(nèi)血細血管腔內(nèi)血栓形成栓形成第四章：第四章：免疫組織化學（免疫組織化學（Immunohistochemistry）一定義：一定義： 應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位的定性、定位、或定量研本中的某些化學成分進行原位的定性、定位、或定量研究，這種技術稱

32、免疫組織化學（究，這種技術稱免疫組織化學（immunohistochemistry） 或免疫細胞化學（或免疫細胞化學（immunocytochemistry），簡稱免疫），簡稱免疫組化。免疫組化技術是組化。免疫組化技術是1941年年 Coons等學者首創(chuàng)的，隨等學者首創(chuàng)的，隨著其理論及技術的發(fā)展，目前已發(fā)生了日新月異的變化。著其理論及技術的發(fā)展，目前已發(fā)生了日新月異的變化。1免疫組化的方法：免疫組化的方法： 1）直接法）直接法 2）間接法：）間接法： SPA、 PAP、 ABC、 LAB法等，間接法法等，間接法 的靈敏度高于直接法。的靈敏度高于直接法。2標記的物質(zhì)：熒光染料、放射性同位素，酶（

33、辣根過氧標記的物質(zhì)：熒光染料、放射性同位素，酶（辣根過氧 化物酶、堿性磷酸酶等）鐵蛋白、膠體金等?；锩?、堿性磷酸酶等）鐵蛋白、膠體金等。3根據(jù)標記物區(qū)分：免疫熒光法、放射免疫法、酶標法和根據(jù)標記物區(qū)分：免疫熒光法、放射免疫法、酶標法和 免疫金銀法。其中免疫熒光法和酶標法應用免疫金銀法。其中免疫熒光法和酶標法應用 廣泛。廣泛。反差二免疫組化的基本知識二免疫組化的基本知識1原理原理：抗體與抗原間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫紐織：抗體與抗原間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫紐織化學正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某種化學物質(zhì)化學正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某種化學物質(zhì)提取出來，以此作為

34、抗原或半抗原，通過免疫后獲得特異性抗提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫后獲得特異性抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的抗原物質(zhì)。由于抗原與體，再以此抗體去探測組織或細胞中的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體結(jié)合后形成的免疫復合物是無色的，因此還必須借助于組抗體結(jié)合后形成的免疫復合物是無色的，因此還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來，以期達到對組化或織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來，以期達到對組化或細胞中的未知抗原進行定性、定位甚至定量的研究。組織或細細胞中的未知抗原進行定性、定位甚至定量的研究。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、胞中凡是能作抗原或半抗

35、原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等，都可以用相應的特磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等，都可以用相應的特異性抗體進行檢測。異性抗體進行檢測。2.抗原性的保存：上述談到的抗原或半抗原物質(zhì)，防止在組抗原性的保存：上述談到的抗原或半抗原物質(zhì)，防止在組織或細胞內(nèi)丟失是非常重要的。在組織處理過程中，如固定、織或細胞內(nèi)丟失是非常重要的。在組織處理過程中，如固定、包埋、薄切、反應，必須保持其抗原性，特別是選擇的固定包埋、薄切、反應，必須保持其抗原性，特別是選擇的固定液及包埋方法要十分注意。液及包埋方法要十分注意。3.抗體：抗體是機體受抗原刺激后，由抗體：抗體是機體受抗原

36、刺激后，由B淋巴細胞、特別是淋巴細胞、特別是漿細胞分泌產(chǎn)生的一種與相應抗原發(fā)生反應的一種球蛋白，漿細胞分泌產(chǎn)生的一種與相應抗原發(fā)生反應的一種球蛋白，即免疫球蛋白（即免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig)，共有五類：，共有五類：IgG, IgA, IgM, IgD, 和和IgE，主要分布在血清或外分泌物中，以，主要分布在血清或外分泌物中，以IgG為為主，約占主，約占7080。1抗體的制備方法：抗體的制備方法：A 多克隆抗體多克隆抗體（血清抗體（血清抗體：指機體接受抗原主動免疫或被動：指機體接受抗原主動免疫或被動免疫后從血清中分離提純的抗體。免疫后從血清中分離提純的抗體。B 單克隆抗體單

37、克隆抗體：是：是1975年由年由Kohlenh Milstein發(fā)明的一種新技發(fā)明的一種新技術。其原理是將體外培養(yǎng)的骨髓細胞和免疫的脾細胞相融合，術。其原理是將體外培養(yǎng)的骨髓細胞和免疫的脾細胞相融合，產(chǎn)生雜交細胞。這種融合的雜交細胞既有骨髓細胞的無限生長產(chǎn)生雜交細胞。這種融合的雜交細胞既有骨髓細胞的無限生長能力，又有漿細胞分泌單一抗體的能力。將該免疫細胞純化，能力，又有漿細胞分泌單一抗體的能力。將該免疫細胞純化，成為單克隆系，就能產(chǎn)生大量專一的高純度的抗體，即單克隆成為單克隆系，就能產(chǎn)生大量專一的高純度的抗體，即單克隆抗體（抗體（monoclonal antibody,McAb)2) 單克隆抗

38、體與多克隆抗體特性的比較單克隆抗體與多克隆抗體特性的比較特性特性 多克隆多克隆 單克隆單克隆組成組成 多種類抗體的混合物多種類抗體的混合物 單一種類的抗體單一種類的抗體 特異性特異性 低針對多個抗原決定族低針對多個抗原決定族 高針對單一的抗原決定族高針對單一的抗原決定族親和力親和力 平均親和力較高平均親和力較高 不定，較低不定，較低交叉反應交叉反應 高高 低低4抗原與抗體的特異性結(jié)合抗原與抗體的特異性結(jié)合 抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。在抗體的輕鏈和重抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。在抗體的輕鏈和重鏈的可變區(qū)中有鏈的可變區(qū)中有3個特殊的易變部位，即在第個特殊的易變部位，即在第30位、位、

39、50一一60位和位和第第100位氨基酸殘基附近，這些部位稱為超變區(qū)。超變區(qū)直接參位氨基酸殘基附近，這些部位稱為超變區(qū)。超變區(qū)直接參與抗原接合部位的組成，形成的接合部位是一個淺平穴槽，槽與抗原接合部位的組成，形成的接合部位是一個淺平穴槽，槽大小約大小約I.5nm0.6nm0.6nm抗原決定族在空間呈互補性地嵌抗原決定族在空間呈互補性地嵌入槽內(nèi)，借分子間的范德華力、疏水作用靜電引力以及氫鍵而入槽內(nèi)，借分子間的范德華力、疏水作用靜電引力以及氫鍵而相互結(jié)合。抗原與抗體分子的結(jié)合不受兩者數(shù)量比例的限制，相互結(jié)合。抗原與抗體分子的結(jié)合不受兩者數(shù)量比例的限制，但如要出現(xiàn)肉眼可見的反應，但如要出現(xiàn)肉眼可見的反

40、應， 則抗原與抗體的量需有一定的適則抗原與抗體的量需有一定的適當?shù)谋壤駝t在抗原與抗體過量的情況下，不能聚合成大顆當?shù)谋壤?，否則在抗原與抗體過量的情況下，不能聚合成大顆粒，因此不能出現(xiàn)肉眼可見的反應。粒，因此不能出現(xiàn)肉眼可見的反應。 三免疫組織化學的基本技術 （一 取材1實驗動物：麻醉 （處死，鋒利刀片切成大小適中， 厚度3mm4mm; 小型實驗動物：灌注（流）固定（生理鹽水和4多聚甲醛 取材2人體材料：活檢組織、手術標本、細胞和組織 （二）固定：原則是保持組織形態(tài)良好和被檢測抗原的前提下，（二）固定：原則是保持組織形態(tài)良好和被檢測抗原的前提下，應采用濃度最低的固定劑和最短的固定時間，固定時

41、間一般為應采用濃度最低的固定劑和最短的固定時間，固定時間一般為112h。1常用的固定劑：常用的固定劑：1）甲醛緩沖液：廣泛應用于病理標本的固定，甲醛在很好地）甲醛緩沖液：廣泛應用于病理標本的固定，甲醛在很好地保護組織形態(tài)結(jié)構完整的同時也有效地保存某些抗原。由于甲保護組織形態(tài)結(jié)構完整的同時也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交聯(lián)作用會影響被固定細胞膜的通透性不利于染色時抗體醛的交聯(lián)作用會影響被固定細胞膜的通透性不利于染色時抗體的滲透，因此染色前常用酶進行消化以使抗原決定簇充分暴露，的滲透，因此染色前常用酶進行消化以使抗原決定簇充分暴露，固定時間不直超過固定時間不直超過24h。2）4多聚甲醛磷酸緩沖液

42、：廣泛應用于光鏡細胞化學研究。多聚甲醛磷酸緩沖液：廣泛應用于光鏡細胞化學研究。3）戊二醛）戊二醛多聚甲醛緩沖液：適用于光鏡、電鏡免疫組織化學多聚甲醛緩沖液：適用于光鏡、電鏡免疫組織化學研究。研究。4）其它：如）其它：如PLP液（過碘酸液（過碘酸賴賴AA多聚甲醛固定液）、丙酮多聚甲醛固定液）、丙酮及醇類、鋨酸等。及醇類、鋨酸等。2固定注意事項：固定注意事項：1）固定液的選擇標準：）固定液的選擇標準：A. 組織形態(tài)結(jié)構保存良好；組織形態(tài)結(jié)構保存良好；B. 最大限度最大限度 保存抗保存抗 原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是應用最廣的固定劑。原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是應用最廣的固定劑。2）組織塊的

43、大?。海┙M織塊的大小：1.5cm1.5cm0.5cm為宜。為宜。3）固定時間：與組織塊大小成正比，與固定液濃度成）固定時間：與組織塊大小成正比，與固定液濃度成 反比。反比。4）溫度：一般在室溫下進行，電鏡標本和固定時間較長時）溫度：一般在室溫下進行，電鏡標本和固定時間較長時 可放置在可放置在4 冰箱。冰箱。5固定后處理：充分沖洗，除去多余固定劑。固定后處理：充分沖洗，除去多余固定劑。（三）包埋：（三）包埋：1.石蠟包埋；石蠟包埋；2.冷凍包埋；冷凍包埋；3.環(huán)氧樹脂包理。環(huán)氧樹脂包理。（四）切片：（四）切片：1.載玻片的處理：載玻片的處理：1）清洗）清洗 ；2）涂膠（防止脫片）涂膠（防止脫片）

44、 常用粘附劑：常用粘附劑：明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠；樹脂膠：明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠；樹脂膠： 也稱白膠；也稱白膠； 多聚賴氨酸（多聚賴氨酸（PLL）；商品化粘附劑。）；商品化粘附劑。2.切片類型：切片類型：l）石蠟切片：厚約）石蠟切片：厚約 3 5 m放置放置 37 溫箱烘烤過夜，溫箱烘烤過夜， 以減少脫片。以減少脫片。2）冷凍切片：）冷凍切片：2 m。3）振動切片：特點是組織經(jīng)固定后不需包埋，只要用膠水粘在）振動切片：特點是組織經(jīng)固定后不需包埋，只要用膠水粘在 載物臺上即可切片。切片較厚，可將陽性部位作電鏡包埋。載物臺上即可切片。切片較厚，可將陽性部位作電鏡包埋。 神經(jīng)組織應用神經(jīng)組織應用

45、 較多。較多。四免疫組化染色過程中的基本技術四免疫組化染色過程中的基本技術（一）蛋白酶消化技術（一）蛋白酶消化技術 進行固定時，抗原決定簇有可能被固定劑所封閉，因此在進行固定時，抗原決定簇有可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應前，常用蛋白酶處理組織切片，使抗原決定抗原抗體反應前，常用蛋白酶處理組織切片，使抗原決定簇充分暴露出來，并使組織的通透性增高，以利抗原抗體簇充分暴露出來，并使組織的通透性增高，以利抗原抗體最大限度地結(jié)合增強特異性染色。最大限度地結(jié)合增強特異性染色。1常用的消化酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶常用的消化酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶2消化時間：因組織而異，一般為消化時間：因組織而異，一般為

46、530分鐘，消化時間不分鐘，消化時間不宜太長，以免損傷組織形態(tài)，破壞抗原決定族。消化結(jié)束宜太長，以免損傷組織形態(tài)，破壞抗原決定族。消化結(jié)束后要充分洗滌，以除去殘留的蛋白酶。后要充分洗滌，以除去殘留的蛋白酶。1）非特異染色的控制）非特異染色的控制 非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過程中凡不屬非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過程中凡不屬于特異性抗原抗體反應所出現(xiàn)的染色。于特異性抗原抗體反應所出現(xiàn)的染色。1原因分析：原因分析：組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光、內(nèi)源性過氧化物酶或堿組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光、內(nèi)源性過氧化物酶或堿 性磷酸酶、內(nèi)源性生物素等；性磷酸酶、內(nèi)源性生物素等；試劑方

47、面：因抗體不純、標記的酶和熒光不純或標記過量等。試劑方面：因抗體不純、標記的酶和熒光不純或標記過量等。2消除方法：消除方法： A. 加加 1抗前加正常血清抗前加正常血清1030分，以封閉組織中帶電荷的基分，以封閉組織中帶電荷的基 因，避免與因，避免與1抗的非特異性結(jié)合?？沟姆翘禺愋越Y(jié)合。 B . 減少非特異性染色：減少非特異性染色：a 免疫酶組化染色時，在加免疫酶組化染色時，在加1抗前，用抗前，用0.3的的H2O2甲醇溶甲醇溶 液將組織切片處理液將組織切片處理30分（若是分（若是3的的H2O2甲醇溶液處甲醇溶液處 理理510分）。分）。b 免疫熒光染色時，可用免疫熒光染色時，可用0.010.0

48、5伊文思藍稀釋熒光伊文思藍稀釋熒光 抗抗 體。體。（二）對照實驗（二）對照實驗 陽性對照片：用已知抗原為陽性的標本作對照。陽性對照片：用已知抗原為陽性的標本作對照。 陰性對照片：確認不含己知抗原的標本作對照。陰性對照片：確認不含己知抗原的標本作對照。（三）抗體的分裝、稀釋、滴加及保存（三）抗體的分裝、稀釋、滴加及保存1抗體的分裝：不能用完的抗體分裝在小的抗體的分裝：不能用完的抗體分裝在小的EP管內(nèi)，保存在管內(nèi)，保存在 -20 - 40 的低溫冰箱中持用可保持數(shù)年有效。的低溫冰箱中持用可保持數(shù)年有效。2抗體稀釋：常用抗體稀釋：常用 0.01M PBS（磷酸緩沖溶液）或（磷酸緩沖溶液）或 BSA

49、（牛血清白蛋白）（牛血清白蛋白）3滴加：滴加的抗體要充分覆蓋組織切片，一般加滴加：滴加的抗體要充分覆蓋組織切片，一般加 3050l，最好在滴加前，用蠟筆或特制的組化筆在組織周圍畫一圈，以防最好在滴加前，用蠟筆或特制的組化筆在組織周圍畫一圈，以防溶液的擴散。溶液的擴散。4保存：未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存，已稀釋未保存：未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存，已稀釋未 用完的抗體最好在一周內(nèi)用完，不宜長期保存。用完的抗體最好在一周內(nèi)用完，不宜長期保存。 （四）免疫酶組織化學技術和酶標抗體技術（四）免疫酶組織化學技術和酶標抗體技術1免疫酶染色原理：免疫酶染色原理： 用酶作為標記物，可分為直接法、

50、間接法、補體法、免疫用酶作為標記物，可分為直接法、間接法、補體法、免疫酶橋法、免疫酶雙橋法、過氧化物酶抗過氧化物酶法酶橋法、免疫酶雙橋法、過氧化物酶抗過氧化物酶法（PAP法）和雙法）和雙PAP法等。法等。1）直接法原理：用酶直接標記在特異性）直接法原理：用酶直接標記在特異性1抗上，與標本中的抗上，與標本中的 抗原結(jié)合，讓酶催化底物反應產(chǎn)生有色產(chǎn)物，沉淀在抗原抗原結(jié)合，讓酶催化底物反應產(chǎn)生有色產(chǎn)物，沉淀在抗原 抗體反應部位，即可在鏡下對標本的抗原進行檢測?？贵w反應部位，即可在鏡下對標本的抗原進行檢測。優(yōu)點：簡便、快速、特異性強；缺點：敏感性差。優(yōu)點：簡便、快速、特異性強；缺點：敏感性差。 2）間

51、接法原理：先用標記的特異性）間接法原理：先用標記的特異性1抗與標本中相應抗原結(jié)抗與標本中相應抗原結(jié) 合，再用酶標記的抗球蛋白抗體（合，再用酶標記的抗球蛋白抗體（2抗）孵育，然后再加抗）孵育，然后再加 酶的底物，顯示抗原抗體抗原抗體復合物存在的部酶的底物，顯示抗原抗體抗原抗體復合物存在的部 位，以對抗原進行檢測。位，以對抗原進行檢測。如：如：1抗是由免產(chǎn)生的多克隆抗體：抗是由免產(chǎn)生的多克隆抗體： 則則2抗常用羊抗兔抗常用羊抗兔IgG；如：如：1抗是由鼠產(chǎn)生的單克隆抗體：抗是由鼠產(chǎn)生的單克隆抗體： 則則2抗常用羊或馬抗鼠抗常用羊或馬抗鼠IgG。以上兩種方法稱為酶標抗體法以上兩種方法稱為酶標抗體法

52、3）非酶標記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動物，產(chǎn)生抗酶）非酶標記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動物，產(chǎn)生抗酶的抗體。通過酶與抗體的特異性結(jié)合進行標記。該方法適用于的抗體。通過酶與抗體的特異性結(jié)合進行標記。該方法適用于石蠟包埋的組織切片。石蠟包埋的組織切片。 原理：首先用酶作為抗原免疫動物，制備效價高、特異性原理：首先用酶作為抗原免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體，然后以強的抗酶抗體，然后以2抗為橋梁，將在組織中與抗原結(jié)合的抗為橋梁，將在組織中與抗原結(jié)合的lffo抗酶抗體連接起來，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)呈色反抗酶抗體連接起來，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)呈色反應顯示抗原的分布。在這種過程中

53、酶是通過免疫學原理與抗酶應顯示抗原的分布。在這種過程中酶是通過免疫學原理與抗酶抗體結(jié)合，避免了酶標時化學反應對抗體和酶活性的破壞。不抗體結(jié)合，避免了酶標時化學反應對抗體和酶活性的破壞。不但提高了敏感性，同時還節(jié)省了但提高了敏感性，同時還節(jié)省了1抗的用量?？沟挠昧?。常用的有常用的有PAP、sABC、LsAB法（附圖表說明）。法（附圖表說明）。（酶標識特異抗體（酶標識特異抗體（酶標識二次抗體（酶標識二次抗體生物素生物素 HRPALP1常用的酶種類：常用的酶種類： 常用的酶大多為辣根過氧化物酶（常用的酶大多為辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）介紹）介紹幾種酶的底

54、物及產(chǎn)生沉淀的顏色。幾種酶的底物及產(chǎn)生沉淀的顏色。常見的幾種酶的一般情況常見的幾種酶的一般情況酶酶 底物底物 沉淀顏色沉淀顏色HRP A 3,3氨基聯(lián)苯胺氨基聯(lián)苯胺DABH2O2 深褐色深褐色 B 5氨基水楊酸氨基水楊酸 H2O2 棕色棕色ALP A 苯酚磷酸鹽重氮鹽苯酚磷酸鹽重氮鹽 紅色紅色 B P校際酚磷酸鹽校際酚磷酸鹽 黃色黃色酸性磷酸酶酸性磷酸酶 Gomoui液液葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 D葡萄糖葡萄糖MTT酚嗪磷酸酚嗪磷酸 甲酯化合物甲酯化合物 藍色藍色五免疫組化的實際操作五免疫組化的實際操作（一）實驗準備（一）實驗準備 1. 必須器材：必須器材： 1）實驗臺：光線充足，方便操作。）

55、實驗臺：光線充足，方便操作。 2）濕潤盒：放置抗原抗體反應過程中反應，避免干燥。）濕潤盒：放置抗原抗體反應過程中反應，避免干燥。 3微量移液器：微量移液器：120 l、20200 l 、1001000 l必備。必備。 4其它：濾紙、紗布、吸頭、其它：濾紙、紗布、吸頭、EP管、染缸、提籃等。管、染缸、提籃等。2.試劑藥品試劑藥品 1緩沖液：緩沖液：PBS, 0.01 M 磷酸緩沖液（磷酸緩沖液（pH7.2） TBS, 0.05 M Tris鹽酸緩沖液（鹽酸緩沖液（pH7.6） 2抗體稀釋液抗體稀釋液: 1 BSA或或 0.01 M PBS 310 2抗免疫動物的正常血清抗免疫動物的正常血清 4D

56、BAH2O2顯色液顯色液 5核復染液：蘇木素或甲基綠核復染液：蘇木素或甲基綠 （二（二 sABC法的操作過程法的操作過程1. 基本原理：基本原理：sABC（strepto-avidin-biotin peroxidase complex）鏈球菌抗生物素（卵白蛋）生物素過氧化物酶復合物鏈球菌抗生物素（卵白蛋）生物素過氧化物酶復合物 生物素（生物素（ biotin）：是一種分子量為）：是一種分子量為 244da的小分子的維生素。的小分子的維生素。 抗生物素（抗生物素（avidin）：是一種糖蛋白，分子量為）：是一種糖蛋白，分子量為 68KDa。 生物素與抗生物素有很強的親和力，兩者一旦結(jié)合就很難生

57、物素與抗生物素有很強的親和力，兩者一旦結(jié)合就很難解離。同時生物素與抗生物素都有與其它示蹤劑如熒光素，膠解離。同時生物素與抗生物素都有與其它示蹤劑如熒光素，膠體金和過氧化物酶等相結(jié)合的能力。所以生物素體金和過氧化物酶等相結(jié)合的能力。所以生物素-抗生物素系抗生物素系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強及方便快速等顯著優(yōu)點。統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強及方便快速等顯著優(yōu)點。 基本操作步驟：基本操作步驟：六操作過程中的各種注意事項及結(jié)果判定六操作過程中的各種注意事項及結(jié)果判定 要想得到理想的結(jié)果，組織細胞形態(tài)的保存、抗原性的保存、要想得到理想的結(jié)果，組織細胞形態(tài)的保存、抗原性的保存、充分的顯示是非常必要的。要滿足這些

58、條件，取材、固定、切充分的顯示是非常必要的。要滿足這些條件，取材、固定、切片厚度、操作過程、抗體濃度及特異性的選擇、操作前蛋白酶片厚度、操作過程、抗體濃度及特異性的選擇、操作前蛋白酶的消化、抗原修復及顯色等各程序的操作不當均可導致不滿意的消化、抗原修復及顯色等各程序的操作不當均可導致不滿意結(jié)果的產(chǎn)生。結(jié)果的產(chǎn)生。1取材固定：標本要盡可能新鮮，取材固定要及時，固定液要取材固定：標本要盡可能新鮮，取材固定要及時，固定液要新新 鮮充足，防止組織破壞和抗原性的失活。鮮充足，防止組織破壞和抗原性的失活。2切片：切片不宜過厚，一般切片：切片不宜過厚，一般4m左右。切片不宜過大，載玻左右。切片不宜過大，載玻

59、片要涂粘附劑，以防脫片。切好的切片暫放片要涂粘附劑，以防脫片。切好的切片暫放 37 溫箱保存。溫箱保存。3脫蠟：脫蠟一定要徹底，新鮮二甲苯脫蠟：脫蠟一定要徹底，新鮮二甲苯 5min 3。4蛋白酶消化：由于組織在固定時抗原決定簇可能被固定蛋白酶消化：由于組織在固定時抗原決定簇可能被固定 劑所封閉，因此在抗原抗體反應前常用蛋白酶處理組織劑所封閉，因此在抗原抗體反應前常用蛋白酶處理組織 切片（根據(jù)切片（根據(jù)1抗要求），使抗原決定簇充分暴露出來，并抗要求），使抗原決定簇充分暴露出來，并 使組織通透性增高，使抗體充分結(jié)合抗原，增強特異性使組織通透性增高，使抗體充分結(jié)合抗原，增強特異性 染色。一般用染色。

60、一般用0.1% 胰蛋白酶或胃蛋白酶消化胰蛋白酶或胃蛋白酶消化530min。5抗原修復：一般在檸檬酸鈉抗原修復液內(nèi)，微波爐，抗原修復：一般在檸檬酸鈉抗原修復液內(nèi)，微波爐， 8595，10min左右。左右。6抗體的選擇：選擇抗體時要注意是用于冰凍切片還是用于抗體的選擇：選擇抗體時要注意是用于冰凍切片還是用于 石蠟切片的抗體，或是二者均可；其次要看抗體說明，是石蠟切片的抗體，或是二者均可；其次要看抗體說明，是 單抗還是多抗；適用于哪些組織；抗體來源于哪種動物，單抗還是多抗；適用于哪些組織；抗體來源于哪種動物， 由此來選擇由此來選擇2抗；還有抗體的稀度（在實驗前根據(jù)預實驗抗；還有抗體的稀度（在實驗前根