分子發(fā)光分析

1、第五章第五章 分子發(fā)光分析分子發(fā)光分析molecular luminescence analysis目前，該分析方法廣泛應(yīng)用于目前，該分析方法廣泛應(yīng)用于生命物質(zhì)（生命物質(zhì)（dnadna、蛋白質(zhì)、糖類）蛋白質(zhì)、糖類）的檢測，的檢測，病毒、細(xì)胞病毒、細(xì)胞等活性物質(zhì)的等活性物質(zhì)的分析，分析，超痕量元素超痕量元素分析等！分析等！dnadna排序排序sarsar病毒、禽流感病毒的檢測病毒、禽流感病毒的檢測單分子檢測單分子檢測目目 錄錄第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述第二節(jié)第二節(jié) 分子熒光分析法分子熒光分析法第三節(jié)第三節(jié) 分子磷光分析法分子磷光分析法第四節(jié)第四節(jié) 化學(xué)發(fā)光分析法化學(xué)發(fā)光分析法第一節(jié)第一節(jié) 概概 述

2、述一、分子發(fā)光的定義一、分子發(fā)光的定義 基態(tài)分子基態(tài)分子受到能量激發(fā)，吸收了一定能量后，躍遷至受到能量激發(fā)，吸收了一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子在很短時間內(nèi)以激發(fā)態(tài)分子在很短時間內(nèi)以輻射躍遷（發(fā)光）形式輻射躍遷（發(fā)光）形式釋放能釋放能量并返回基態(tài)，便產(chǎn)生了分子發(fā)光。量并返回基態(tài)，便產(chǎn)生了分子發(fā)光。外部能量光輻射基態(tài)激發(fā)態(tài)外部能量光輻射基態(tài)激發(fā)態(tài)根據(jù)激發(fā)方式不同，分子發(fā)光可分為根據(jù)激發(fā)方式不同，分子發(fā)光可分為光致發(fā)光致發(fā)光光、熱致發(fā)光熱致發(fā)光、場致發(fā)光場致發(fā)光和和化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光等。等。其中，其中，光致發(fā)光光致發(fā)光根據(jù)激發(fā)態(tài)不同可分為根據(jù)激發(fā)態(tài)不同可分為熒光熒光和和磷光磷光兩種。兩種

3、。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述第二節(jié)第二節(jié) 分子熒光分析法分子熒光分析法 molecular fluorescence analysis掌握要點(diǎn)：掌握要點(diǎn)：1.分子熒光分析法的定義、發(fā)展和特點(diǎn)；分子熒光分析法的定義、發(fā)展和特點(diǎn)；2.分子熒光的產(chǎn)生，熒光光譜及相關(guān)知識；分子熒光的產(chǎn)生，熒光光譜及相關(guān)知識；3.如何用分子熒光分析法進(jìn)行定量測定；如何用分子熒光分析法進(jìn)行定量測定；4.熒光分析儀器；熒光分析儀器；5.熒光分析法的應(yīng)用。熒光分析法的應(yīng)用。某些物質(zhì)被某些物質(zhì)被紫外光紫外光照射激發(fā)到單重激發(fā)態(tài)后，在回到基態(tài)照射激發(fā)到單重激發(fā)態(tài)后，在回到基態(tài)的過程中發(fā)射出比原激發(fā)的過程中發(fā)射出比原激發(fā)波長更長波長

4、更長的熒光，通過測量熒光強(qiáng)度進(jìn)的熒光，通過測量熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析的方法。行定量分析的方法。 一一. .分子熒光分析法的定義分子熒光分析法的定義紫外光紫外光熒光熒光基態(tài)基態(tài)單重激發(fā)態(tài)單重激發(fā)態(tài)二二. .分子熒光分析法的特點(diǎn)分子熒光分析法的特點(diǎn)1.靈敏度較紫外可見分析法高靈敏度較紫外可見分析法高24個數(shù)量級；個數(shù)量級；2.選擇性較好；選擇性較好；3.主要用于定量分析；主要用于定量分析；4.能發(fā)射熒光的物質(zhì)較少，應(yīng)用不如紫外可見廣泛。能發(fā)射熒光的物質(zhì)較少，應(yīng)用不如紫外可見廣泛。其高靈敏度和許多生命物質(zhì)都具有熒光性質(zhì)，所以該方法在藥物、其高靈敏度和許多生命物質(zhì)都具有熒光性質(zhì)，所以該方法在藥物、臨床、

5、環(huán)境、食品的微量和痕量分析以及生命科學(xué)研究上具有重臨床、環(huán)境、食品的微量和痕量分析以及生命科學(xué)研究上具有重要意義。要意義。三三. .分子熒光分析法的發(fā)展分子熒光分析法的發(fā)展 第一次記錄熒光現(xiàn)象的是第一次記錄熒光現(xiàn)象的是1616世紀(jì)西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)世紀(jì)西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家家n.monardesn.monardes，15751575年他提到在含有一種稱為年他提到在含有一種稱為“l(fā)ignumnephriticum”lignumnephriticum”的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛可愛的天藍(lán)色的天藍(lán)色。 在在1717世紀(jì)，世紀(jì)，boyleboyle（

6、1626169116261691）和）和newtonnewton（1624172716241727）等）等著名科學(xué)家再次觀察到著名科學(xué)家再次觀察到熒光現(xiàn)象熒光現(xiàn)象。 18521852年，年，stokesstokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光計(jì)觀在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光計(jì)觀察到其察到其熒光的波長熒光的波長比比入射光的波長入射光的波長稍為稍為長些長些，才判明這種現(xiàn)象是這，才判明這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光。些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光。他還由發(fā)熒光的礦物他還由發(fā)熒光的礦物“螢石螢石”推演而提出推演而提出“熒光熒光”這一術(shù)語這一術(shù)語. 入射光入射光熒

7、光熒光stokesstokes還對還對熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度與與濃度濃度之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，描述之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，描述了在高濃度時以及外來物質(zhì)存在時的熒光猝滅現(xiàn)象。此外，他了在高濃度時以及外來物質(zhì)存在時的熒光猝滅現(xiàn)象。此外，他還是第一個（還是第一個（18641864年）提出應(yīng)用熒光作為分析手段的人。年）提出應(yīng)用熒光作為分析手段的人。 18671867年，年，goppelsrgoppelsr進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用鋁鋁桑色素配合物的熒光進(jìn)行桑色素配合物的熒光進(jìn)行鋁鋁的測定。的測定。 18801880年，年，liebemanliebeman提出了最早

8、的關(guān)于提出了最早的關(guān)于熒光熒光與與化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)結(jié)構(gòu)關(guān)系的關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)法則。經(jīng)驗(yàn)法則。 到到1919世紀(jì)末，人們已經(jīng)知道了包括熒光素、曙紅、多環(huán)芳世紀(jì)末，人們已經(jīng)知道了包括熒光素、曙紅、多環(huán)芳烴等烴等600600種以上的熒光化合物。種以上的熒光化合物。 19 19世紀(jì)以前，熒光的觀察是靠世紀(jì)以前，熒光的觀察是靠肉眼肉眼進(jìn)行的，直到進(jìn)行的，直到19281928年，年，才由才由jettejette和和westwest提出了第一臺提出了第一臺光電熒光計(jì)光電熒光計(jì)。早期的光電熒光。早期的光電熒光計(jì)的靈敏度是有限的，計(jì)的靈敏度是有限的，19391939年年zworykinzworykin和和rajchman

9、rajchman發(fā)明發(fā)明光電倍光電倍增管增管以后，在增加靈敏度和容許使用分辨率更高的單色器等方以后，在增加靈敏度和容許使用分辨率更高的單色器等方面，是一個非常重要的階段。面，是一個非常重要的階段。19431943年年duttondutton和和baileybailey提出了一提出了一種種熒光光譜的手工校正步驟熒光光譜的手工校正步驟，19481948年由年由studerstuder推出了第一臺推出了第一臺自自動光譜校正裝置動光譜校正裝置，到，到19521952年才出現(xiàn)商品化的年才出現(xiàn)商品化的校正光譜儀器校正光譜儀器。 熒光分析方法的發(fā)展，與儀器的發(fā)展是分不開的。熒光分析方法的發(fā)展，與儀器的發(fā)展是

10、分不開的。目前，熒光分析法不斷朝著目前，熒光分析法不斷朝著高效、痕量、微觀和自動高效、痕量、微觀和自動化化的方向發(fā)展，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和選擇性日益提高，的方向發(fā)展，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和選擇性日益提高，方法的應(yīng)用范圍大大擴(kuò)展，遍及于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、方法的應(yīng)用范圍大大擴(kuò)展，遍及于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、公安情報(bào)和科學(xué)研究等各個領(lǐng)域中。環(huán)境保護(hù)、公安情報(bào)和科學(xué)研究等各個領(lǐng)域中。 四四. .分子熒光的原理分子熒光的原理分子軌道的多重態(tài)分子軌道的多重態(tài)如果分子中的電子自旋方向相反的，此時如果分子中的電子自旋方向相反的，此時 s=0，m=l，這種態(tài)被稱為，這種態(tài)被稱為單重態(tài)或單重態(tài)或

11、s 態(tài)態(tài)。一般分子的基態(tài)是。一般分子的基態(tài)是單重態(tài)單重態(tài)s0，若被激發(fā)時自旋方向沒有改變，若被激發(fā)時自旋方向沒有改變，則得到則得到激發(fā)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)s1、s2；如果被激發(fā)的電子在激發(fā)時自旋方向發(fā)生了改變，；如果被激發(fā)的電子在激發(fā)時自旋方向發(fā)生了改變，呈呈()或或()，則，則 s=1，m=3，此種態(tài)被成為，此種態(tài)被成為三重態(tài)或三重態(tài)或 t 態(tài)態(tài)。 分子多重態(tài)分子多重態(tài) m 定義為定義為m=2s+1 圖中按能量的高低，將單重態(tài)與三重態(tài)分別以圖中按能量的高低，將單重態(tài)與三重態(tài)分別以 s0、s1、s2和和 t1、t2表示之。應(yīng)該指出，表示之。應(yīng)該指出，三重態(tài)的能量總是低于相應(yīng)的單重態(tài)的。三重態(tài)的能量

12、總是低于相應(yīng)的單重態(tài)的。 電子躍遷態(tài)圖解電子躍遷態(tài)圖解 電子的躍遷需受電子的躍遷需受“選擇律選擇律”的限制的限制 ，s0t1 禁阻躍遷（幾率很小）。禁阻躍遷（幾率很?。?。熒光的產(chǎn)生熒光的產(chǎn)生人們16世紀(jì)就發(fā)現(xiàn)熒光現(xiàn)象，但真正懂得解釋這一現(xiàn)象的時候，時間已經(jīng)過了300多年了首先，人們懂得在分子的角度上解釋。首先，人們懂得在分子的角度上解釋。對紫外光或可對紫外光或可見光產(chǎn)生選擇見光產(chǎn)生選擇性的吸收。性的吸收。電子躍遷電子躍遷到激發(fā)態(tài)到激發(fā)態(tài). .具有不飽和具有不飽和鍵的基態(tài)分鍵的基態(tài)分子子. .電子躍遷到激發(fā)態(tài)后，不穩(wěn)定，要躍遷回基態(tài)，在這過程中能量需要被釋放，電子躍遷到激發(fā)態(tài)后，不穩(wěn)定，要躍遷回

13、基態(tài)，在這過程中能量需要被釋放，通過發(fā)光的形式和其他形式，我們稱為輻射躍遷和非輻射躍遷。通過發(fā)光的形式和其他形式，我們稱為輻射躍遷和非輻射躍遷。s2s1s0t1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2t2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫電子躍遷類型電子躍遷類型 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷躍遷(發(fā)光發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷輻射躍遷熒光熒光磷光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越系間跨越振動弛預(yù)振動弛預(yù)無輻射

14、躍遷 激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對大；熒光熒光：10-710 -9 s,第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)；磷光磷光：10-410s；第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)；非輻射能量傳遞過程非輻射能量傳遞過程 振動弛豫振動弛豫：同一同一電子能級電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10 -12 s。 內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換：同：同多重度電子能級多重度電子能級中中,等能級間等能級間的無輻射能級交換。的無輻射能級交換。 通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重

15、態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。的最低振動能級。 外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子激發(fā)分子與與溶劑或其他分子之間溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；輻射躍遷； 外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅猝滅”。系間跨越系間跨越：不同多重態(tài)不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。 改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋軌道耦合進(jìn)行。軌道耦合進(jìn)行。輻射能量傳遞過程輻射能量傳遞過程 熒光發(fā)射熒光發(fā)射：電子由：電子由第一激發(fā)單重

16、態(tài)的最低振動能級第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)（基態(tài)（ 多為多為 s1 s0躍遷），發(fā)射波長為躍遷），發(fā)射波長為 l l 2的熒光；的熒光； 10-710 -9 s 。 由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長； l l 2 l l 2 l l 1 ； 磷光發(fā)射磷光發(fā)射：電子由電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)（基態(tài)（ t1 s0躍遷躍遷）；）； 電子由電子由s0進(jìn)入進(jìn)入t1的可能過程：（的可能過程：（ s0 t1禁阻躍遷）禁阻躍遷） s0 激發(fā)激發(fā)振動弛豫振動弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移系間跨越系間跨越振動弛

17、豫振動弛豫 t1 發(fā)光速度很慢：發(fā)光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持續(xù)一段時間。光照停止后，可持續(xù)一段時間。波長跟激發(fā)態(tài)基態(tài)能量差有關(guān)，強(qiáng)度與發(fā)生躍遷分子多少有關(guān)。波長跟激發(fā)態(tài)基態(tài)能量差有關(guān)，強(qiáng)度與發(fā)生躍遷分子多少有關(guān)。熒光和磷光光譜熒光和磷光光譜五五. .激發(fā)光譜與熒光激發(fā)光譜與熒光( (磷光磷光) )光譜光譜 熒光熒光( (磷光磷光) )：光致發(fā)光，照射光波長如何選：光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？擇？1.1.熒光熒光( (磷光磷光) )的激發(fā)光譜曲線的激發(fā)光譜曲線 固定測量波長固定測量波長( (選最大發(fā)射波長選最大發(fā)射波長),),化合物發(fā)化合物發(fā)射的射的熒光熒光( (磷

18、光磷光) )強(qiáng)度強(qiáng)度與與照射光波長照射光波長的關(guān)系曲線的關(guān)系曲線 （圖中曲線（圖中曲線i i ） 。 激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；分子最多，熒光強(qiáng)度最大；2.2.熒光光譜熒光光譜( (或磷光光譜或磷光光譜) ) 固定激發(fā)光波長固定激發(fā)光波長( (選最大激發(fā)波選最大激發(fā)波長長), ), 化合物化合物發(fā)射的熒光發(fā)射的熒光( (或磷光強(qiáng)或磷光強(qiáng)度度) )與與發(fā)射光波長發(fā)射光波長關(guān)系曲線關(guān)系曲線( (圖中曲圖中曲線線ii或或iii) )。450.0480500520540560580600620650.00.950100150200250

19、300350400450500550600650700750.0nm 525.54,645.29554.73,657.69丁省的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜丁省的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜波長（nm）200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜五五. .熒光效率和影響因素?zé)晒庑屎陀绊懸蛩?1.1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。 熒光量子產(chǎn)率（熒光量子產(chǎn)率（

20、 ）：）：被激發(fā)的分子數(shù)產(chǎn)生熒光分子數(shù) 熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；2.2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類型：）躍遷類型： * 的熒光效率高的熒光效率高，系間跨越過程的速，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作：可降低分子振動，減少與溶

21、劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應(yīng)取代基效應(yīng)：芳環(huán)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增上有供電基，使熒光增強(qiáng)。強(qiáng)。3.3.影響熒光強(qiáng)度的因素影響熒光強(qiáng)度的因素 影響熒光強(qiáng)度的外部因素：影響熒光強(qiáng)度的外部因素：1.1.溶劑的影響溶劑的影響 除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；都將使化合物的熒光發(fā)生變化；2.2.溫度的影響溫度的影響 熒光強(qiáng)度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)

22、換去活的幾熒光強(qiáng)度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加率增加；3. 溶液溶液ph 對酸堿化合物，溶液對酸堿化合物，溶液ph的影響較大，需要嚴(yán)格控制；的影響較大，需要嚴(yán)格控制；4.4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象 自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。 內(nèi)濾光作用內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；5.5.溶液熒光的猝滅溶液熒

23、光的猝滅 碰撞猝滅；碰撞猝滅； 氧的熄滅作用等。氧的熄滅作用等。一、定量依據(jù)一、定量依據(jù)熒光量子產(chǎn)率（熒光量子產(chǎn)率（ ）：）：其中，其中，ifif為熒光強(qiáng)度，為熒光強(qiáng)度，iaia為被吸收的激發(fā)光強(qiáng)度。為被吸收的激發(fā)光強(qiáng)度。i i0 0為入射光強(qiáng)度，為入射光強(qiáng)度，i i為透射光強(qiáng)度。為透射光強(qiáng)度。吸收的光量子數(shù)發(fā)射的光量子數(shù)ifiaifi0-i因?yàn)閍=lgi0i則i=i010-aif= ( (i0-i)= )= i i0 0(1-10(1-10-a-a)= )= i i0 02.3a- - -2.3a- - -(-2.3a)22!(-2.3a)33!當(dāng)被測物濃度很小時，當(dāng)被測物濃度很小時，a0.

24、05a0.05， i if f= = 2.32.3 i i0 0a a 2.32.3 i i0 0k kbcbc五五. .熒光定量分析法熒光定量分析法if= 2.3 i0kbckc標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定 測量熒光的儀器主要由測量熒光的儀器主要由五個部分五個部分組成：組成：激發(fā)光源、第一激發(fā)光源、第一單色器、單色器、樣品池、第二單色器、檢測器樣品池、第二單色器、檢測器。 特殊點(diǎn)特殊點(diǎn)：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。 基本流程如圖：基本流程如圖：光源：光源：氙燈和高壓汞燈，氙燈和高壓汞燈，染料激光器染料激光器( (可見與紫外區(qū)可見與紫外區(qū)) )

25、單色器：單色器：選擇激發(fā)光波長選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射的第一單色器和選擇發(fā)射光光( (測量測量) )波長的第二單色波長的第二單色器；器；檢測器：檢測器：光電倍增管光電倍增管。二、儀器流程二、儀器流程三、熒光法的應(yīng)用三、熒光法的應(yīng)用1.單組分單組分物質(zhì)的物質(zhì)的直接測定直接測定和和間接測定間接測定（1 1）無機(jī)離子）無機(jī)離子如如mgmg、alal、caca等，本身不發(fā)射熒光，但與有機(jī)試劑可等，本身不發(fā)射熒光，但與有機(jī)試劑可形成熒光配合物進(jìn)行定量測定；形成熒光配合物進(jìn)行定量測定；（2 2）有機(jī)化合物）有機(jī)化合物本身發(fā)射熒光的，如羅丹明本身發(fā)射熒光的，如羅丹明b b、熒光素等可直接測定；、熒光素等可直接測定；不發(fā)射熒光的物質(zhì)可經(jīng)過處理后成為發(fā)射熒光的物質(zhì)不發(fā)射熒光的物質(zhì)可經(jīng)過處理后成為發(fā)射熒光的物質(zhì)進(jìn)行測定；進(jìn)行測定；（3 3）生命物