分子實(shí)驗(yàn)操作誤區(qū)

1、常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作誤區(qū)及經(jīng)驗(yàn)淺析報(bào)告內(nèi)容實(shí)驗(yàn)過程中存在的主要問題1 1Paul Steven實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn)漫談3 3實(shí)驗(yàn)室常用材料的成本4 4Paul Steven實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)2 2實(shí)驗(yàn)記錄的電子化管理5 5一 實(shí)驗(yàn)過程中存在的主要問題 實(shí)驗(yàn)效率低1、實(shí)驗(yàn)前材料準(zhǔn)備不足，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過程中、實(shí)驗(yàn)前材料準(zhǔn)備不足，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過程中臨時(shí)配置或購買某些必須材料，導(dǎo)致延誤；臨時(shí)配置或購買某些必須材料，導(dǎo)致延誤；2、實(shí)驗(yàn)理論、原理上把握不夠，遇到問題、實(shí)驗(yàn)理論、原理上把握不夠，遇到問題不懂得分析原因，單純地重復(fù)相同的操作，不懂得分析原因，單純地重復(fù)相同的操作，重復(fù)相同的錯(cuò)誤。重復(fù)相同的錯(cuò)誤。3、時(shí)間

2、安排不夠緊湊，實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)大、時(shí)間安排不夠緊湊，實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)大量的量的“等待等待”時(shí)間，不懂得合理安排利用，時(shí)間，不懂得合理安排利用，僅僅是在手機(jī)屏幕與手指之間白白流逝掉。僅僅是在手機(jī)屏幕與手指之間白白流逝掉。4、對實(shí)驗(yàn)不重視，操作過程中粗心隨意，、對實(shí)驗(yàn)不重視，操作過程中粗心隨意，不按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗又重新不按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗又重新進(jìn)行。進(jìn)行。5、實(shí)驗(yàn)操作不熟練，動(dòng)作較慢，錯(cuò)誤較多。、實(shí)驗(yàn)操作不熟練，動(dòng)作較慢，錯(cuò)誤較多。6、其他的一些原因。、其他的一些原因。一 實(shí)驗(yàn)過程中存在的主要問題 實(shí)驗(yàn)效率低 缺乏整體觀念 文獻(xiàn)把握不夠1、對自己的研究需要做哪些實(shí)驗(yàn)、做到什、

3、對自己的研究需要做哪些實(shí)驗(yàn)、做到什么程度可以講出一個(gè)故事或者可以發(fā)表什么么程度可以講出一個(gè)故事或者可以發(fā)表什么樣的論文，沒有概念。樣的論文，沒有概念。2、實(shí)驗(yàn)沒有針對性，特別是表型檢測及拿、實(shí)驗(yàn)沒有針對性，特別是表型檢測及拿到突變體之后的實(shí)驗(yàn)，見別人在做什么就做到突變體之后的實(shí)驗(yàn)，見別人在做什么就做什么，沒有根據(jù)自己的材料的特點(diǎn)設(shè)計(jì)有針什么，沒有根據(jù)自己的材料的特點(diǎn)設(shè)計(jì)有針對性的檢測實(shí)驗(yàn)。對性的檢測實(shí)驗(yàn)。3、實(shí)驗(yàn)進(jìn)展與原理把握不夠，不能站在已、實(shí)驗(yàn)進(jìn)展與原理把握不夠，不能站在已發(fā)表的文獻(xiàn)資料的原有平臺上進(jìn)一步提升自發(fā)表的文獻(xiàn)資料的原有平臺上進(jìn)一步提升自己研究的高度和深度。己研究的高度和深度。4

4、、對自己的研究缺乏興趣，缺乏信心，缺、對自己的研究缺乏興趣，缺乏信心，缺乏成就感，不明白自己課題的意義，缺乏主乏成就感，不明白自己課題的意義，缺乏主動(dòng)探索的精神。動(dòng)探索的精神。一 實(shí)驗(yàn)過程中存在的主要問題 實(shí)驗(yàn)效率低 缺乏整體觀念 文獻(xiàn)把握不夠 材料浪費(fèi)嚴(yán)重1、酶制劑使用過多、實(shí)驗(yàn)操作中樣品使用過、酶制劑使用過多、實(shí)驗(yàn)操作中樣品使用過多；多；2、一次性塑料制品過多使用，導(dǎo)致白色污染；、一次性塑料制品過多使用，導(dǎo)致白色污染；3、實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，導(dǎo)致大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)；、實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，導(dǎo)致大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)；4、不懂得充分利用實(shí)驗(yàn)材料，如、不懂得充分利用實(shí)驗(yàn)材料，如KIX板顯色板顯色效果差了，可以用來轉(zhuǎn)

5、板而無需直接丟棄。效果差了，可以用來轉(zhuǎn)板而無需直接丟棄。二 實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：操作粗獷、過于隨意、思想觀念上的誤區(qū)：操作粗獷、過于隨意實(shí)驗(yàn)操作過于隨意，對一切實(shí)驗(yàn)操作抱著無所謂的心理，不按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行。 稱量樣品時(shí)隨意，不擦拭樣品匙，不考慮精確度，不稱量樣品時(shí)隨意，不擦拭樣品匙，不考慮精確度，不在意樣品的灑落；取瓊脂粉時(shí)不稱量，在意樣品的灑落；取瓊脂粉時(shí)不稱量，“大概大概”式添加。式添加。 做凝膠不按時(shí)收膠，凝膠在外面放置太久；電泳時(shí)不做凝膠不按時(shí)收膠，凝膠在外面放置太久；電泳時(shí)不根據(jù)自己的樣品大小選擇某種濃度的瓊脂糖凝膠；電泳時(shí)電根據(jù)自己的樣品大小選擇某種濃度的

6、瓊脂糖凝膠；電泳時(shí)電壓過高；電泳液長期不更換。壓過高；電泳液長期不更換。 制備感受態(tài)的菌直接從制備感受態(tài)的菌直接從-80-80冰箱或長期放置的平板冰箱或長期放置的平板上取出液體培養(yǎng)；制備過程中過多步驟沒有在冰上操作；制上取出液體培養(yǎng)；制備過程中過多步驟沒有在冰上操作；制備的感受態(tài)不進(jìn)行驗(yàn)證就直接做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。備的感受態(tài)不進(jìn)行驗(yàn)證就直接做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。 揮發(fā)性材料沒有在室外通風(fēng)處或者室內(nèi)的通風(fēng)廚中取揮發(fā)性材料沒有在室外通風(fēng)處或者室內(nèi)的通風(fēng)廚中取用。用。二 實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：操作粗獷、過于隨意、思想觀念上的誤區(qū)：操作粗獷、過于隨意實(shí)驗(yàn)操作過于隨意，對一切實(shí)驗(yàn)操作抱著無所謂的心理，

7、不按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行。 因粗心大意、不認(rèn)真而導(dǎo)致的樣品取錯(cuò)、溶液配方看因粗心大意、不認(rèn)真而導(dǎo)致的樣品取錯(cuò)、溶液配方看錯(cuò)、實(shí)驗(yàn)樣品混淆（不認(rèn)真做筆記）、加錯(cuò)試劑、看錯(cuò)實(shí)驗(yàn)錯(cuò)、實(shí)驗(yàn)樣品混淆（不認(rèn)真做筆記）、加錯(cuò)試劑、看錯(cuò)實(shí)驗(yàn)條件等等情況常有發(fā)生，不一而足。條件等等情況常有發(fā)生，不一而足。 不認(rèn)真做筆記，無論是各種反應(yīng)的體系、溶劑配方還不認(rèn)真做筆記，無論是各種反應(yīng)的體系、溶劑配方還是某些關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)操作，不做筆記或者僅僅是寫在臨時(shí)的紙片是某些關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)操作，不做筆記或者僅僅是寫在臨時(shí)的紙片上，之后就遺失或遺忘了。上，之后就遺失或遺忘了。 實(shí)驗(yàn)操作的臺面實(shí)驗(yàn)操作的臺面“臟亂差臟亂差”，只能在，只能在“夾縫

8、中夾縫中”進(jìn)行進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，可能會(huì)使得很多未知的東西從桌面混入反應(yīng)體系，實(shí)驗(yàn)操作，可能會(huì)使得很多未知的東西從桌面混入反應(yīng)體系，影響實(shí)驗(yàn)。影響實(shí)驗(yàn)。 超凈臺滅菌開著風(fēng)機(jī)、不關(guān)死玻璃窗、里面的材料過超凈臺滅菌開著風(fēng)機(jī)、不關(guān)死玻璃窗、里面的材料過多，存在較多的死角。多，存在較多的死角。 不注意某些緩沖液的不注意某些緩沖液的pHpH值，感覺差不多就隨意用。值，感覺差不多就隨意用。二 實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：貪婪心理、思想觀念上的誤區(qū)：貪婪心理在實(shí)驗(yàn)中總覺得取用的材料不夠，總認(rèn)為多多益善，沒有微量的概念，不能克服貪婪心理，不僅造成不必要的材料浪費(fèi)，還會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，浪費(fèi)大量寶貴時(shí)間。

9、酶制劑取用過多。酶制劑取用過多。 菌體菌體PCRPCR時(shí)菌體取用過多。時(shí)菌體取用過多。 電泳時(shí)上樣量過多。電泳時(shí)上樣量過多。 做做PCRPCR時(shí)，模板量如總時(shí)，模板量如總DNADNA、總、總RNARNA添加過多。添加過多。 提取總提取總DNADNA或質(zhì)粒時(shí)，總認(rèn)為菌體越多越好。或質(zhì)粒時(shí)，總認(rèn)為菌體越多越好。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的哲學(xué)：做人勿貪！分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的哲學(xué)：做人勿貪！二 實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：總怕染菌、思想觀念上的誤區(qū)：總怕染菌有些同學(xué)在做實(shí)驗(yàn)時(shí)總覺得超凈臺不夠干凈，總怕染菌，表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。 超凈臺滅菌時(shí)間過長。超凈臺滅菌時(shí)間過長。 每次倒平板重新滅菌。每次倒平

10、板重新滅菌。 做感受態(tài)過程中樣品離心過程中超凈臺反復(fù)滅菌。做感受態(tài)過程中樣品離心過程中超凈臺反復(fù)滅菌。1 1、滅菌過程中產(chǎn)生的臭氧對人體有害、對馬上進(jìn)、滅菌過程中產(chǎn)生的臭氧對人體有害、對馬上進(jìn)行操作的樣品細(xì)胞有害；行操作的樣品細(xì)胞有害；2 2、紫外燈壽命縮短，作用變?nèi)酰尽⒆贤鉄魤勖s短，作用變?nèi)?，原?818分鐘可以分鐘可以完成的滅菌，可能需要完成的滅菌，可能需要2525分鐘甚至更長。分鐘甚至更長。二 實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：僥幸心理、思想觀念上的誤區(qū)：僥幸心理僥幸心理是分子生物實(shí)驗(yàn)中大家最容易犯的一種錯(cuò)誤，無論是有經(jīng)驗(yàn)的還是沒經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)，都不例外。大家總是想省時(shí)間、省步

11、驟以及對前一步實(shí)驗(yàn)的盲大家總是想省時(shí)間、省步驟以及對前一步實(shí)驗(yàn)的盲目自信是產(chǎn)生這種心理的主要原因。目自信是產(chǎn)生這種心理的主要原因。我們現(xiàn)用的絕多數(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法都是在分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論的基礎(chǔ)上，輔以前人大量的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)而建立的，實(shí)驗(yàn)條件的細(xì)小改變，不一定會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，但如果連續(xù)幾個(gè)步驟都有細(xì)小的改變，積累起來常會(huì)出大錯(cuò)，而一旦出錯(cuò)了，往往不能夠找到原因在哪里。所以，我們常常遇到一些莫名其妙的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無法用我們常識的知識去解釋的結(jié)果。二 實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：僥幸心理、思想觀念上的誤區(qū)：僥幸心理按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范認(rèn)真做好每一步操作，該進(jìn)行檢測和驗(yàn)證的，盡量不要省略。不要盲目、

12、過分地相信經(jīng)驗(yàn)！僥幸心理常有的表現(xiàn)：僥幸心理常有的表現(xiàn)： 質(zhì)粒酶切后不電泳檢測是否酶切完全；質(zhì)粒酶切后不電泳檢測是否酶切完全； 測序時(shí)樣品質(zhì)量不過關(guān)，僥幸認(rèn)為應(yīng)該可以測的出來；測序時(shí)樣品質(zhì)量不過關(guān)，僥幸認(rèn)為應(yīng)該可以測的出來； 感受態(tài)細(xì)胞制備完以后不檢測轉(zhuǎn)化效率、不檢測是否感受態(tài)細(xì)胞制備完以后不檢測轉(zhuǎn)化效率、不檢測是否染菌就直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料的轉(zhuǎn)化；染菌就直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料的轉(zhuǎn)化； 互補(bǔ)時(shí)將基因片段不連接到小載體上測序，而是直接互補(bǔ)時(shí)將基因片段不連接到小載體上測序，而是直接連接到互補(bǔ)的大質(zhì)粒上測序；連接到互補(bǔ)的大質(zhì)粒上測序； 提總提總DNADNA或質(zhì)粒時(shí)不進(jìn)活化的步驟，直接從或質(zhì)粒時(shí)不進(jìn)活化的步驟，

13、直接從-80-80冰箱冰箱取菌液體培養(yǎng)。取菌液體培養(yǎng)。 設(shè)計(jì)引物時(shí)忽略特異性比對的步驟，忽略二聚體等信設(shè)計(jì)引物時(shí)忽略特異性比對的步驟，忽略二聚體等信息的分析步驟。息的分析步驟。二 實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：不愿思考為什么、思想觀念上的誤區(qū)：不愿思考為什么很多同學(xué)在做實(shí)驗(yàn)時(shí)，容易出現(xiàn)兩種情況：一是按照自己的意愿隨意更改經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)操作，二是盲目相信往屆畢業(yè)生的畢業(yè)論文中的實(shí)驗(yàn)方法。這兩種情況的出現(xiàn)都是缺少必要的思考：該實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵點(diǎn)是什么？該實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵點(diǎn)是什么？別人為什么這么操作？別人為什么這么操作？如果不這么操作會(huì)出現(xiàn)什么后果？如果不這么操作會(huì)出現(xiàn)什么后果？哪些步驟是可以改

14、良的？哪些步驟是可以改良的？針對自己的具體實(shí)驗(yàn)，哪些步驟是不同的？針對自己的具體實(shí)驗(yàn)，哪些步驟是不同的？二 實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)2、常見的不規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作、常見的不規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作A 不知道哪些藥品需要滅菌，哪些不需要滅菌，如SDS溶液、NaOH溶液；不知道哪些可以高壓滅菌，哪些需要低壓滅菌。 PCR時(shí)不做正對照和負(fù)對照。 驗(yàn)證性PCR循環(huán)數(shù)過多。推薦推薦2525個(gè)循環(huán)。個(gè)循環(huán)。 PCR產(chǎn)物電泳上樣量過多。推薦推薦1ul-2ul1ul-2ul。 電泳時(shí)很多泳道都加DNA marker。 膠回收用的凝膠過厚。推薦使用推薦使用80ml80ml的打膠。的打膠。 膠回收時(shí)用酒精燈燒切膠刀。推薦使用多個(gè)切膠刀

15、。推薦使用多個(gè)切膠刀。 膠回收用的凝膠中加入過多的GelRed。推薦推薦0.8ul 0.8ul GelRedGelRed/100ml/100ml凝膠。凝膠。 提質(zhì)粒均用氯仿抽提。 PCRPCR驗(yàn)證、酶切驗(yàn)證用無需抽驗(yàn)證、酶切驗(yàn)證用無需抽提。提。二 實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)2、常見的不規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作、常見的不規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作B 使用PCR儀時(shí)，隨便更改他人的程序； 使用水浴鍋后不關(guān)閉，特別是高溫水??； 使用各類儀器時(shí)，不看貼在旁邊的使用操作說明。 倒平板時(shí)，不論各類平板，均倒13塊。對于普通的轉(zhuǎn)對于普通的轉(zhuǎn)板、藍(lán)白篩選等操作用的平板，推薦倒板、藍(lán)白篩選等操作用的平板，推薦倒15-1715-17塊板塊板/3

16、00ml/300ml培培養(yǎng)基。養(yǎng)基。三 實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn) 質(zhì)粒的提取常見問題與對策u提質(zhì)粒電泳顯示應(yīng)該幾條帶？哪種情況較好？提質(zhì)粒電泳顯示應(yīng)該幾條帶？哪種情況較好？ 質(zhì)粒在電泳時(shí)會(huì)出現(xiàn)三種情況的圖譜：質(zhì)粒在電泳時(shí)會(huì)出現(xiàn)三種情況的圖譜：1）三條帶，按照電泳泳動(dòng)速度（快到慢）排列為：）三條帶，按照電泳泳動(dòng)速度（快到慢）排列為：超螺旋、缺口閉環(huán)、開環(huán)。經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)。超螺旋、缺口閉環(huán)、開環(huán)。經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)。2）兩條帶，超螺旋）兩條帶，超螺旋/閉環(huán)閉環(huán)/開環(huán)開環(huán) 任意兩種。任意兩種。3）一條帶，超螺旋。）一條帶，超螺旋。出現(xiàn)不同的結(jié)果都是由抽提質(zhì)粒時(shí)的操作手法造成的。如果嚴(yán)格按照操作步驟，超螺旋的質(zhì)粒會(huì)較多。至

17、于那種情況好，要看我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的目的了，進(jìn)行分子克隆的操作，構(gòu)建載體。這隨便那種情況都可以，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和測序，必須要超螺旋，所以它們的質(zhì)量好壞順序是： 3）、2）、1）三 實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn) 質(zhì)粒的提取常見問題與對策u質(zhì)粒大小如何在電泳中的鑒定？質(zhì)粒大小如何在電泳中的鑒定？ 酶切將質(zhì)粒線性化以后，才可以用酶切將質(zhì)粒線性化以后，才可以用marker判斷大小。判斷大小。如果有三種構(gòu)像，可以用中間那條帶與marker比較判斷大小。 商品化的質(zhì)粒估計(jì)應(yīng)該大部分是超螺旋構(gòu)像。 酶切后線性化條帶電泳時(shí)所處的位置就指示質(zhì)粒的大小。三 實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn) 質(zhì)粒的提取常見問題與對策u在保存或抽提在

18、保存或抽提DNA過程中，一般采用什么緩沖過程中，一般采用什么緩沖液？為什么？液？為什么？ 一般采用一般采用TE緩沖液。在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液緩沖液。在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。采用干擾作用。采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存在提取或保存DNA時(shí)，大都采用時(shí)，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而系統(tǒng)，而TE緩緩沖液中的沖液中的EDTA更能穩(wěn)定更能穩(wěn)定

19、DNA的活性。的活性。 如下游有特殊需要也可用水保存如下游有特殊需要也可用水保存DNA。我們一般直接。我們一般直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作，無需考慮樣品的存儲問題，為進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作，無需考慮樣品的存儲問題，為避免可能帶來的各類離子的干擾，常選用滅菌的去離避免可能帶來的各類離子的干擾，常選用滅菌的去離子水溶解子水溶解DNA。三 實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn) 質(zhì)粒的提取常見問題與對策u抽提質(zhì)粒抽提質(zhì)粒DNA時(shí)，用酚、氯仿、異戊醇有什么作用？時(shí)，用酚、氯仿、異戊醇有什么作用？ 酚與氯仿是非極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白酚與氯仿是非極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯

20、仿擠去而變性。經(jīng)過離心，變性質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，沉淀在水相下面與水相中的蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，沉淀在水相下面與水相中的DNA分開。分開。 酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。酚的變性作用大，酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約但酚與水相有一定程度的互溶，大約1015的水溶解在酚相的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶

21、走DNA。所以在抽提過程。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。為了混合均勻，必須劇烈振蕩中，混合使用酚與氯仿效果最好。為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器，易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇容器，易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用能降低分子表面張力，能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1，同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性，同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變

22、性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。 經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走?？捎寐确碌诙巫冃缘鞍踪|(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。三 實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn) 質(zhì)粒的提取常見問題與對策u在提取質(zhì)粒時(shí)，是否可以不抽提蛋白質(zhì)？在提取質(zhì)粒時(shí)，是否可以不抽提蛋白質(zhì)？ 我們常用的質(zhì)?；蛘咧亟M質(zhì)粒，基本都是在DH5這類蛋白質(zhì)較少的大腸桿菌中的，如果是需要送樣測序，或者酶切后進(jìn)行連接操作，建議用酚：氯仿進(jìn)行抽提，如果僅僅是為了酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒，則無需進(jìn)行抽提。 在加完溶液I

23、II后，離心取上清，再次離心，重新取上清加無水乙醇沉淀。兩次離心可以去除絕大部分的不溶性蛋白質(zhì)，在最后所得的質(zhì)粒DNA中基本沒有不溶性的物質(zhì)出現(xiàn)。這種沒有抽提的質(zhì)粒完全可以滿足膠回收、酶切驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)的要求。三 實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn) 質(zhì)粒的提取常見問題與對策u在使用堿裂解法提取質(zhì)粒時(shí)，加溶液在使用堿裂解法提取質(zhì)粒時(shí)，加溶液III離心后離心后出現(xiàn)一層白色的蛋白質(zhì)漂浮物怎么辦？出現(xiàn)一層白色的蛋白質(zhì)漂浮物怎么辦？ 兩種解決方法：一是在加完溶液兩種解決方法：一是在加完溶液III后放在后放在-20冰冰箱冰上箱冰上10分鐘，可以有效減少和杜絕蛋白質(zhì)漂浮分鐘，可以有效減少和杜絕蛋白質(zhì)漂浮物；二是將這些上清液取出后再

24、次離心，再次取物；二是將這些上清液取出后再次離心，再次取上清，基本可以完全去除這些蛋白質(zhì)漂浮物。上清，基本可以完全去除這些蛋白質(zhì)漂浮物。三 實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn) 其他方面的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)其他方面的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) 制備感受態(tài)的菌每次從制備感受態(tài)的菌每次從-80冰箱取出活化，活化冰箱取出活化，活化后再轉(zhuǎn)接一次，然后再進(jìn)行液體培養(yǎng)。后再轉(zhuǎn)接一次，然后再進(jìn)行液體培養(yǎng)。 菌體菌體PCR，對于大腸桿菌只需用尖頭的牙簽碰一點(diǎn)，對于大腸桿菌只需用尖頭的牙簽碰一點(diǎn)點(diǎn)菌體便可。點(diǎn)菌體便可。 菌體菌體PCR的體系，推薦的體系，推薦10ul的體系，比的體系，比20ul的體系的體系減半。減半。 酶切的樣品如重組質(zhì)粒，不要一次性全部切完，

25、酶切的樣品如重組質(zhì)粒，不要一次性全部切完，要留一部分防止此次酶切失敗而又要重新制備材要留一部分防止此次酶切失敗而又要重新制備材料。料。三 實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn) 其他方面的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)其他方面的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) 連接時(shí)，可以使用連接時(shí)，可以使用10ul的連接體系，使用不超過的連接體系，使用不超過0.5ul的連接酶，不僅可以比使用的連接酶，不僅可以比使用5ul連接體系省酶，連接體系省酶，還可以在轉(zhuǎn)化步驟有多余的連接體系備用。還可以在轉(zhuǎn)化步驟有多余的連接體系備用。 做轉(zhuǎn)化時(shí)可以使用做轉(zhuǎn)化時(shí)可以使用5ul的連接液轉(zhuǎn)化，剩余的連接的連接液轉(zhuǎn)化，剩余的連接液放到液放到-20冰箱暫存；如果因某些不確定性因素冰箱暫存；如果因某

26、些不確定性因素導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失敗，可以用剩余的連接液再次轉(zhuǎn)化。導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失敗，可以用剩余的連接液再次轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化時(shí)如果轉(zhuǎn)化液不完全涂布的話，最好剩余的轉(zhuǎn)化時(shí)如果轉(zhuǎn)化液不完全涂布的話，最好剩余的轉(zhuǎn)化液放到轉(zhuǎn)化液放到4冰箱保存，直至確定本次轉(zhuǎn)化可以冰箱保存，直至確定本次轉(zhuǎn)化可以挑選到自己所需的轉(zhuǎn)化子；如果沒有獲得或者因挑選到自己所需的轉(zhuǎn)化子；如果沒有獲得或者因某些因素導(dǎo)致本次涂布失敗，可以用剩余的轉(zhuǎn)化某些因素導(dǎo)致本次涂布失敗，可以用剩余的轉(zhuǎn)化液重新涂布。液重新涂布。三 實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn) 其他方面的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)其他方面的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) 做做PCR時(shí)時(shí)8連管的標(biāo)記連管的標(biāo)記 做藍(lán)白篩選時(shí)，做藍(lán)白篩選時(shí)，37下培養(yǎng)下培養(yǎng)17小時(shí)以上便可顯色。小時(shí)以上便可顯色。顯色后將平板置于顯色后將平板置于4兩小時(shí)，藍(lán)色會(huì)加深。兩小時(shí)，藍(lán)色會(huì)加深。 用試劑盒提取質(zhì)?；蛘呒兓迷噭┖刑崛≠|(zhì)?；蛘呒兓疍NA、膠回收時(shí)，最后、膠回收時(shí)，最后一步加水或一步加水或TE Buffer溶解和收集溶解和收集