食品中致病菌的初篩鑒定和污染源的追溯

1、張志坤2009.3.10一一. .概述概述二二. .致病菌的初篩及鑒定系統(tǒng)致病菌的初篩及鑒定系統(tǒng) (一).目前食品安檢中致病菌常規(guī)的檢測(cè)方法 (二).常規(guī)檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn) (三).食品微生物檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì) (四).分子生物學(xué)理論基礎(chǔ) (五).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)-pcr技術(shù)和real-time pcr技術(shù)詳解 (六).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)-生物芯片技術(shù)（探針技術(shù)）簡(jiǎn)介 (七).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn) (八).分子生物學(xué)鑒定技術(shù)簡(jiǎn)介三三. .致病菌污染源的追溯系統(tǒng)致病菌污染源的追溯系統(tǒng) (一).概述 (二).目前常用的污染源追溯方法-pfge電泳方法簡(jiǎn)介 (三).dupont公司riboprin

2、ter system簡(jiǎn)介微生物檢測(cè)常規(guī)微生物檢測(cè)致病微生物檢測(cè)常規(guī)微生物項(xiàng)目：細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、酵母總數(shù)、霉菌總數(shù)，此 類(lèi)細(xì)菌不致病，但會(huì)嚴(yán)重影響食品的外觀及風(fēng)味。目前常用 微生物培養(yǎng)法來(lái)計(jì)數(shù)菌落，允許有該類(lèi)菌落，但菌落總數(shù)不 能超標(biāo)。致病微生物項(xiàng)目：沙門(mén)氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌o157： h7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞 菌等。致病微生物在食品中是絕對(duì)不允許存在的，所以快速 檢測(cè)食品中是否存在有致病微生物，是食品安全檢驗(yàn)的重中 之重。下面我們重點(diǎn)來(lái)談一下致病菌的檢驗(yàn)方法。食品微生物檢測(cè)食品中致病微生物的檢測(cè)致病微生物檢測(cè)致病微生物檢出及鑒定污

3、染源的追溯為什么要進(jìn)行污染源的追溯?1.可以搞清楚致病菌污染的源頭,進(jìn)而分析出污染爆發(fā)的原因;2.可以更為有效地消除污染源,杜絕污染的再次爆發(fā);3.在食品生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)可以有效地進(jìn)行質(zhì)控.收集樣品無(wú)選擇性富集細(xì)菌（4-8小時(shí)）選擇性的富集增菌（18-24小時(shí)）1.平板培養(yǎng)純化細(xì)菌，根 據(jù)菌落形態(tài)，生理生化 特征等檢測(cè)。2.免疫檢測(cè)收集樣品富集細(xì)菌選擇增菌培養(yǎng)檢測(cè)免疫檢測(cè)(一).2種顯色底物用來(lái)顯示2種阪崎腸桿菌的特異性酶活性：-d-吡喃葡萄糖苷酶glucopyranosidase and -d-纖維二糖酶,并可以檢測(cè)低活性的-d吡喃葡萄糖苷酶菌株?？股赜脕?lái)抑制大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、酵母菌和一些

4、革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng) 24小時(shí)培養(yǎng)后獲得典型的菌落（藍(lán)灰色到藍(lán)黑色），48小時(shí)培養(yǎng)后出現(xiàn)特有的菌落形態(tài)。因此可以在48小時(shí)一次判讀結(jié)果。 35-37c和 41.5c培養(yǎng)均通過(guò)評(píng)估，通過(guò)評(píng)估可在mlst新生霉素或ee肉湯增菌培養(yǎng)后使用 (fda/cfsan:2002)特異性: 3種顯色底物能更好地選擇性分離和區(qū)分 包括傷寒沙門(mén)氏菌、副傷寒沙門(mén)氏菌和絕大多數(shù)乳糖陽(yáng)性地沙門(mén)氏菌在內(nèi)的沙門(mén)氏菌。 營(yíng)養(yǎng)成份: 在強(qiáng)選擇性成分作用下，沙門(mén)氏菌經(jīng)過(guò) 37 c 18-24小時(shí)培養(yǎng)形成較大、邊緣不規(guī)則、顯色明顯的菌落。 選擇性: 強(qiáng)選擇性確保抑制污染食物的其它菌落如：革蘭陽(yáng)性球菌、酵母菌和大部分非發(fā)酵革蘭陰性細(xì)菌

5、。(一).葡菌腸毒素是引起食物中毒的常見(jiàn)原因。 7種不同的血清型可被鑒定。這些毒素蛋白最初僅由金黃色 葡萄球菌產(chǎn)生，但目前有報(bào)道中間型葡萄球菌和豬葡萄球菌也能產(chǎn)生毒素。盡管葡萄球菌可通過(guò)加熱 破壞，但這些毒素是熱穩(wěn)定性的，可在高溫下存活。 生物梅里埃采用尖端科技的elfa技術(shù)，運(yùn)用能更好的捕獲抗原的新抗體 工作。移去粘附在酶結(jié)合抗體上的fc片斷，明顯增強(qiáng)了試劑盒的性能。 移去fc片斷減少了可能產(chǎn)生潛在錯(cuò)誤信號(hào)干擾的食物成份和非特異性結(jié) 合的其它細(xì)菌，提高了特異性。釋放2個(gè)小的fab片斷優(yōu)化了抗體的位置， 更好地結(jié)合抗原，提高了敏感性.vidas set2是一個(gè)由包含成品試劑和spr （固項(xiàng)容器

6、）管組成的單劑量試劑。 vidas全自動(dòng)儀器進(jìn)行整個(gè)檢測(cè)步驟并打印結(jié)果：陽(yáng)性或陰性 檢測(cè)食品中的葡萄球菌毒素 檢測(cè)時(shí)間: 80 分鐘 整個(gè)檢測(cè)周期: 少于1天(一).(1).直觀 由于常規(guī)檢測(cè)方法是用微生物的培養(yǎng)法來(lái)進(jìn)行的，所以此類(lèi)方法很直觀，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)及細(xì)菌生理生化的鑒定，有沒(méi)有一目了然，非常直觀。 (2).經(jīng)濟(jì) 由于常規(guī)方法不需要特殊的試劑，顯色培養(yǎng)基和普通染色鏡檢即可完成檢驗(yàn)和鑒定，所以成本低廉。(1).周期長(zhǎng) 由于常規(guī)檢測(cè)用的是微生物的培養(yǎng)法，需要不斷的選擇性培養(yǎng)純化，再加上生理生化的鑒定，周期非常長(zhǎng)（一周左右）。 (2).不能準(zhǔn)確鑒定變種致病菌 打個(gè)

7、比方，常規(guī)的鑒定方法就像鑒定一個(gè)人一樣，先看人群的形態(tài)（物以類(lèi)聚，人以群分，類(lèi)似于菌落形態(tài)），再看此人穿什么樣的衣服（類(lèi)似于有無(wú)鞭毛和莢膜），接下來(lái)看此人的外貌（有無(wú)特殊的標(biāo)志，類(lèi)似于細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察），最后看此人的習(xí)慣（類(lèi)似于細(xì)菌的生理生化特點(diǎn)，遇染色培養(yǎng)基變色等）。但是細(xì)菌的變異率是非常高的，遇見(jiàn)變異的致病菌和未知的致病菌，我們往往會(huì)束手無(wú)策，常常會(huì)得出是是而非的結(jié)論。這是任何一種檢測(cè)方法的基本要求，其他有點(diǎn)要在此基礎(chǔ)上建立。對(duì)于變異的致病菌和未知的細(xì)菌也要能準(zhǔn)確無(wú)誤的做出鑒定。在準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上，能夠快速得出檢測(cè)的結(jié)果，以減輕倉(cāng)儲(chǔ)和物流的壓力，達(dá)到快速出貨加快產(chǎn)品流通的目的。在微生物的檢測(cè)中

8、，樣品間的交叉污染是個(gè)讓人十分頭疼的問(wèn)題，好的檢測(cè)方法應(yīng)該能有效的避免交叉污染的發(fā)生。 檢測(cè)成本不能太高，盡量減少企業(yè)的檢驗(yàn)成本。隨著我國(guó)加入世貿(mào)組織，國(guó)內(nèi)企業(yè)越來(lái)越多的產(chǎn)品走向了世界，但其他國(guó)家為了保護(hù)本國(guó)企業(yè)的利益，往往會(huì)在檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)上設(shè)置貿(mào)易壁壘，所以這就要求我們的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)接軌，這樣才能順利的把我們的產(chǎn)品銷(xiāo)往國(guó)外?；驔Q定著生物的種類(lèi)和性狀。大千世界，各種生物千姿百態(tài)，這一切皆源于各種生物所攜帶基因的差異。隨著科技的不斷發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)物種的水平已經(jīng)從形態(tài)及生理生化水平進(jìn)入到了基因水平。舉個(gè)例子來(lái)說(shuō)，門(mén)，綱，目，科，屬，種，亞種，人類(lèi)都是屬于同一個(gè)種-人種，人種又可分為黃，白，

9、黑，棕等亞種；就拿黃種人來(lái)說(shuō)吧，不同的生物，其基因也是不同的，這就是dna鑒定的理論基礎(chǔ)。在致病菌的檢驗(yàn)上，我們同樣可以用dna-這個(gè)基因的載體來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)和鑒定?；蚴且欢魏怂嵝蛄?，用來(lái)編碼特定的氨基酸序列，和指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成及加工，從而使生物體具有特殊的性狀。核酸經(jīng)水解可得到很多核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本單位。核酸就是由很多單核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解產(chǎn)生核苷和磷酸，核苷還可再進(jìn)一步水解，產(chǎn)生戊糖和含氮堿基。核苷酸中的堿基均為含氮雜環(huán)化合物，它們分別屬于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。核苷酸中的嘌呤堿(purine)主要是鳥(niǎo)嘌呤(guanine,g)和腺嘌呤(adenine,a)；

10、嘧啶堿(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,c)、尿嘧啶(uracil,u)和胸腺嘧啶(thymine,t)。dna和rna都含有鳥(niǎo)嘌呤(g)、腺嘌呤(a)和胞嘧啶(c)；胸腺嘧啶(t)一般而言只存在于dna中，不存在于rna中；而尿嘧啶(u)只存在于rna中，不存在于dna中。核酸脫氧核糖核酸（dna）,其戊糖環(huán)為脫氧戊糖核糖核酸 （rna）,戊糖環(huán)為非脫氧戊糖水解水解1.1.核酸鏈一般都是以雙鏈存在的，尤其是核酸鏈一般都是以雙鏈存在的，尤其是dnadna鏈。兩條鏈之間以堿基所形成的氫鍵連接，形成雙螺鏈。兩條鏈之間以堿基所形成的氫鍵連接，形成雙螺旋旋 結(jié)構(gòu)。堿基之間的連接是

11、有嚴(yán)格的配對(duì)原則的即結(jié)構(gòu)。堿基之間的連接是有嚴(yán)格的配對(duì)原則的即: :a-t;g-ca-t;g-c。如下圖：。如下圖：1.1.核酸鏈一般都是以雙鏈存在的，尤其是核酸鏈一般都是以雙鏈存在的，尤其是dnadna鏈。兩條鏈之間以堿基所形成的氫鍵連接，形成雙螺旋鏈。兩條鏈之間以堿基所形成的氫鍵連接，形成雙螺旋 結(jié)構(gòu)。堿基之間的連接是有嚴(yán)格的配對(duì)原則的即結(jié)構(gòu)。堿基之間的連接是有嚴(yán)格的配對(duì)原則的即: :a-t;g-ca-t;g-c。如下圖：。如下圖：2.核酸的變性，復(fù)性和雜交 dna雙鏈之間以氫鍵連接，氫鍵是一種次級(jí)鍵，能量較低，易受破壞，在某些理化因素作用下，dna分子互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，使dna雙

12、螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈，即為dna變性。dna變性只涉及二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，不伴隨一級(jí)共價(jià)鍵的斷裂。dna的變性從開(kāi)始到解鏈完全，是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度內(nèi)完成的，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值增加達(dá)到最大增加值的50時(shí)的溫度叫做dna的解鏈溫度（tm）。一種dna分子的 tm值的大小與其所含堿基中的 gc的比例相關(guān)也與dna分子大小及變性條件有關(guān)，g+c的比例越高，dna分子越長(zhǎng)，溶液離子強(qiáng)度越高，tm值越大。加熱、低鹽及強(qiáng)酸、強(qiáng)堿均可使dna變性。 2.復(fù)性 變性dna在適當(dāng)條件下，兩條互補(bǔ)鏈可重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱(chēng)為復(fù)性。熱變性的dna經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過(guò)程也叫退火，一般認(rèn)為，比

13、tm值低 25 的溫度是dna復(fù)性的最佳條件。 3.dna復(fù)性的實(shí)際應(yīng)用雜交：通過(guò)變性dna的復(fù)性性質(zhì)，我們可知道，dna單鏈之間、rna單鏈之間、一條dna和一條rna鏈之間只要存在序列互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域，不管是整條鏈互補(bǔ)，還是部分序列互補(bǔ)，即可重新形成整條雙鏈或部分雙鏈，這即為核酸分子雜交，這在分子生物學(xué)研究中有極大的應(yīng)用，比如：可用于在基因組中對(duì)特異基因的定位及檢測(cè)，pcr技術(shù)擴(kuò)增目的基因等，很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用的都是核酸分子雜交的原理，如southern blot, northern blot,這個(gè)性質(zhì)也是pcr的理論基礎(chǔ)。 2.核酸的變性，復(fù)性和雜交變性復(fù)性雜交聚合酶鏈鎖反應(yīng)，pol

14、ymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱(chēng)pcr，pcr這項(xiàng)技術(shù)是由凱利穆利斯(kary mullis)發(fā)明，并因此在七年之后，1993年10月，獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)該項(xiàng)殊榮。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反覆相同程序的方法，并利用一種特殊的酶即dna聚合酶來(lái)擴(kuò)增特定的dna片段。dna聚合酶天然存在于生物體內(nèi)，在細(xì)胞分裂前進(jìn)行dna的復(fù)制。當(dāng)dna開(kāi)始復(fù)制時(shí)，解旋酶將雙股的dna分開(kāi)成兩個(gè)單股。dna聚合酶便結(jié)合在兩dna單股鏈上，生成互補(bǔ)鏈。在穆利斯最初的pcr反應(yīng)中，將dna聚合酶用于體外試驗(yàn)。雙鏈dna被加熱到96，使得雙鏈分離成為兩條單鏈。但是在這個(gè)溫度下，dna聚合酶被

15、破壞，因此在每個(gè)循環(huán)的加熱步驟后必須補(bǔ)充新的聚合酶。穆利斯的原始pcr反應(yīng)效率極低，需要大量時(shí)間和dna聚合酶，并且在整個(gè)pcr反應(yīng)中都需要人來(lái)照看。后來(lái)，由嗜熱細(xì)菌水生棲熱菌(thermus aquaticus)體內(nèi)產(chǎn)生的dna聚合酶改善了這種低效的pcr反應(yīng)。由于嗜熱細(xì)菌生活在溫度超過(guò)110的間歇泉中，它的dna聚合酶具有耐熱性。在用于pcr反應(yīng)時(shí)，高溫并不能破壞這種dna聚合酶，因此不需要不斷加入新的聚合酶，pcr反應(yīng)由此變得簡(jiǎn)單并且可以由機(jī)器操作。最初的具有耐熱性的dna聚合酶來(lái)自于水生棲熱菌(thermus aquaticus)，因此被稱(chēng)為taq。taq酶被廣泛用于當(dāng)前的pcr操作中

16、。taq酶的缺點(diǎn)是它缺少3-5校正外切酶活性，因此在復(fù)制dna時(shí)有時(shí)會(huì)出錯(cuò)，造成dna序列突變(錯(cuò)誤)。從古菌中獲得的pwo酶及pfu酶均有校正機(jī)制，能夠大大降低pcr反應(yīng)中的突變。將taq與pfu結(jié)合使用可以保證真實(shí)準(zhǔn)確得擴(kuò)增dnapcr用于擴(kuò)增一小段已知的dna片斷，可能是單個(gè)基因，或者僅僅是某個(gè)基因的一部分。與活體生物 不同的是，pcr只能復(fù)制很短的dna片斷，通常不超過(guò)10kbp。dna是雙鏈分子，因此用互補(bǔ)dna雙鏈的構(gòu)造單位(核苷酸)來(lái)度量其大小，單位為堿基對(duì)（base pair, bp）。某些特定的方法可以擴(kuò)增40kbp左右的片斷，但是這種大小與真核細(xì)胞的染色體dna相比仍然是很

17、少的。例如，人的體細(xì)胞dna含有大約30億個(gè)堿基對(duì)。目前應(yīng)用的pcr反應(yīng)需要幾個(gè)基本組成： （1）.dna模板（template），含有需要擴(kuò)增的dna片斷。 （2）.2個(gè)引物（primer），決定了需要擴(kuò)增的起始和終止位置。（見(jiàn)下面引物一節(jié)） （3）.dna聚合酶（polymerase），復(fù)制需要擴(kuò)增的區(qū)域。 （4）.脫氧單核苷酸（dntp），用于構(gòu)造新的互補(bǔ)鏈。 （5）.緩沖體系，提供適合聚合酶行使功能的化學(xué)環(huán)境。pcr反應(yīng)在熱循環(huán)設(shè)備中進(jìn)行。pcr儀可以將反應(yīng)管加熱或冷卻到每步反應(yīng)所需的精確的溫度。為防止反應(yīng)體系中液體蒸發(fā)，通常在反應(yīng)管上加蓋加熱的蓋子，或者在反應(yīng)體系表面加入一層石蠟油。

18、一般的pcr反應(yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下4個(gè)步驟： (1).利用高溫(93-98)使雙鏈dna分離(熔解)。高溫將連接兩條dna鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之 前，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物完全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分 鐘。 (2).在dna雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈dna上(降溫或稱(chēng)接合)。此階段的溫度通 常低于引子熔點(diǎn)5。錯(cuò)誤的黏合溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間 1-2分鐘。新技術(shù)的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會(huì)高于熔點(diǎn)35，僅需時(shí)間510秒。 (3).最后，dna聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引子開(kāi)始沿著dna鏈合

19、成互補(bǔ)鏈(延長(zhǎng))。此階段的溫度依賴(lài) 于dna聚合酶。該步驟時(shí)間依賴(lài)于聚合酶以及需要合成的dna片斷長(zhǎng)度。傳統(tǒng)的taq估計(jì)合成 1000bp大概需要1分鐘、較新的tbr(來(lái)自于嗜熱菌thermus brockianus)約40秒、融合型聚合酶 僅約15秒。 (4).瓊脂糖電泳檢測(cè)pcr產(chǎn)物,主要是片段大小。pcr簡(jiǎn)圖(1) 96高溫下使雙股dna打開(kāi) (2) 在約68下讓引物與dna配對(duì) (3) 在72 dna延長(zhǎng) (p=聚合酶). (4) 第一循環(huán)完成，做出的兩段雙股dna又可當(dāng)作下一個(gè)循環(huán)模板，這樣每次循環(huán)都使得擴(kuò)增的dna片段加倍。(5).經(jīng)過(guò)20-40輪的pcr反應(yīng)，目的基因被放大了上百

20、萬(wàn)倍。瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)過(guò)20-35輪的擴(kuò)增后，特異的目的基因（代表該微生物）被放大了近百萬(wàn)倍，將pcr所得的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)dna分子量marker進(jìn)行比對(duì)，得出pcr擴(kuò)增有沒(méi)有得到目的基因，進(jìn)而推斷出待檢物中有沒(méi)有該基因（該微生物）。每種致病菌的引物和特異基因都是該試劑公司經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究和并反復(fù)試驗(yàn)準(zhǔn)確無(wú)誤的，尤其是拿到了國(guó)際或國(guó)家檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的公司。pcr檢驗(yàn)不需要選擇性增菌，只需簡(jiǎn)單富集一下，即可進(jìn)行pcr檢驗(yàn)。一次可檢測(cè)96384個(gè)樣品（大型pcr檢測(cè)的樣品還可以更多）。一般24小時(shí)之內(nèi)出結(jié)果。由于普通pcr的檢驗(yàn)是在一個(gè)開(kāi)放的系統(tǒng)中進(jìn)行的，所以容易形成樣品間的交叉污染?，F(xiàn)在國(guó)

21、家已經(jīng)明令禁止在醫(yī)院檢驗(yàn)系統(tǒng)采用普通pcr檢驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcrpcr（real-time pcrreal-time pcr）的出現(xiàn)有效地解決了上述的問(wèn)題，并）的出現(xiàn)有效地解決了上述的問(wèn)題，并成為了現(xiàn)在醫(yī)院檢測(cè)傳染性疾?。ǜ窝?，性病，細(xì)菌感染）的首先。在食品成為了現(xiàn)在醫(yī)院檢測(cè)傳染性疾?。ǜ窝?，性病，細(xì)菌感染）的首先。在食品微生物安檢領(lǐng)域，美國(guó)微生物安檢領(lǐng)域，美國(guó)dupontdupont公司研發(fā)的公司研發(fā)的baxbax系統(tǒng)已獲系統(tǒng)已獲aoacaoac的認(rèn)證，并被多的認(rèn)證，并被多個(gè)國(guó)家所采納，個(gè)國(guó)家所采納，20072007年年7 7月月9 9日被我國(guó)作為官方標(biāo)準(zhǔn)用于食品的檢驗(yàn)，北京奧

22、日被我國(guó)作為官方標(biāo)準(zhǔn)用于食品的檢驗(yàn)，北京奧運(yùn)會(huì)期間作為被用于奧運(yùn)會(huì)食品安檢。運(yùn)會(huì)期間作為被用于奧運(yùn)會(huì)食品安檢。實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)于1996年由美國(guó)applied biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了pcr從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)pcr相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決pcr污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量pcr：在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr進(jìn)程， 最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。定量pcr儀是在普通pcr儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測(cè)裝置，pcr擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，最終結(jié)果不需進(jìn)行電

23、泳檢測(cè)，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。 常 規(guī) pcr技術(shù)：對(duì)pcr擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú) 法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。 實(shí)時(shí)定量pcr技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)pcr擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化， 通過(guò)ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集sybr greensybr green5353sgno emissionsgsgsgexcitatiexcitationonsgsgsgsgsgsgsg5353emissionexcitatiexcitationon 伴隨著每輪pcr的進(jìn)行，特異的基因片段不斷積累，

24、sybr green不斷的與新增加的基因片段結(jié)合而發(fā)出熒光，熒光信號(hào)不斷積累，熒光定量pcr儀實(shí)時(shí)記錄了熒光信號(hào)的變化。與目標(biāo)序列互補(bǔ)taqman探針的特性：(1).5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(reporter, r) ，如fam、vic等 (2).3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (quencher, q)(3).探針完整，r所發(fā)射的熒光能量被q基團(tuán)吸收 ，無(wú)熒光， r與q分 開(kāi)，發(fā)熒光(4).taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針每擴(kuò)增一條dna分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過(guò)程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光8.熒光定量pcr的數(shù)學(xué)原理理想的pcr反應(yīng)：x=x0*2n非理想的pcr反應(yīng)： x=x0* (1+ex)

25、n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) x：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 x0：初始模板量 ex：擴(kuò)增效率在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí): xct=x0 (1+ex)ct =m (1)xct:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為m方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:log m=log x0 (1+ex)ct (2)整理方程式(2)得: log x0= - log(1+ex) *ct+ log m (3)loglog濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量就可計(jì)算出樣品中所含的模板量

26、模板dna量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即ct值越小log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量25sample上世紀(jì)上世紀(jì)90年代中頁(yè)，從杜邦中心研發(fā)實(shí)驗(yàn)室發(fā)展出來(lái)年代中頁(yè)，從杜邦中心研發(fā)實(shí)驗(yàn)室發(fā)展出來(lái) outgrowth of dupont cr&d業(yè)務(wù)遍布美洲，歐洲和亞太地區(qū)的很多國(guó)家業(yè)務(wù)遍布美洲，歐洲和亞太地區(qū)的很多國(guó)家 presence in the americas, europe and asia-pacific杜邦杜邦qualiconqualiconaoac internationalaoac

27、 research instituteafnornordvalcertificationsusda-aphis npipbrazil mapapeoples republic of china aqsiqhealth canada danish veterinary and food administrationrussian rospotrebnadzorjapanese ministry of health, labour and welfareapprovalsusda-fsisadoption1.2008年7月9日被我國(guó)作為官方 標(biāo)準(zhǔn)用于食品的檢驗(yàn)。2.北京奧運(yùn)會(huì)期間作為被用于奧 運(yùn)會(huì)

28、食品安檢。熒光定量pcr檢測(cè)技術(shù)是基于基因水平上的檢測(cè)，毋庸置疑，其特異性和準(zhǔn)確性是目前所有檢測(cè)方法中最高的。熒光定量pcr檢測(cè)不需要選擇性增菌，只需簡(jiǎn)單富集一下，即可進(jìn)行pcr檢驗(yàn)。一次可檢測(cè)96384個(gè)樣品（大型pcr檢測(cè)的樣品還可以更多），使用復(fù)合引物的話，一次可檢測(cè)好幾種致病菌，一般24小時(shí)之內(nèi)出結(jié)果。基因探針固相支持物流程略圖(1).探針的制備 選取某種致病菌的特性基因序列，pcr擴(kuò)增該序列，將得到的pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后，點(diǎn)于固相支持物（尼龍膜、玻璃片等）上，制成基因探針。 (2).將細(xì)菌選擇性增菌后，提取細(xì)菌的總dna，以此總dna為模板，以（1）中該致病菌的特性基因序列的引物為引物

29、，以經(jīng)過(guò)化學(xué)發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記的單核甘酸（如datp）為dntp,進(jìn)行pcr，將得到的pcr產(chǎn)物與探針進(jìn)行雜交（變性，復(fù)性）。 (3).洗脫 將沒(méi)有雜交上的dna片段洗脫掉 (4).檢驗(yàn)，用掃描儀檢驗(yàn)。有化學(xué)發(fā)光則為陽(yáng)性，沒(méi)有化學(xué)發(fā)光則為陰性。rrna分子在生物體中普遍存在，生物細(xì)胞rrna分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)中既具有保守的片段，又具有變化的堿基序列。在生物進(jìn)化的漫長(zhǎng)過(guò)程中,rrna分子保持相對(duì)恒定的生物學(xué)功能和保守的堿基排列順序,同時(shí)也存在著與進(jìn)化過(guò)程相一致的突變率,在結(jié)構(gòu)上可分為保守區(qū)和可變區(qū), 保守的片段反應(yīng)了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變片段則能表明物種間的差異，那些保守的或高變的特征性核苷酸序列則

30、是不同分類(lèi)級(jí)別生物（如科、屬、種）鑒定的分子基礎(chǔ)。研究rrna基因序列可以發(fā)現(xiàn)各物種間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。細(xì)菌rrna按沉降系數(shù)分為3種，分別為5s、16s和23srrna。其中位于原核細(xì)胞核糖體小亞基上的16srrna長(zhǎng)約1540bp,結(jié)構(gòu)和堿基排列復(fù)雜度適中,較易于進(jìn)行序列測(cè)定和分析比較。16srdna是細(xì)菌染色體上編碼16srrna相對(duì)應(yīng)的dna序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中，它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)由保守區(qū)及可變區(qū)兩部分組成。因此可用pcr擴(kuò)增其相應(yīng)的rdna片斷，來(lái)快速、靈敏地檢測(cè)樣品中是否存在某些細(xì)菌或致病菌，或進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析，尤其是那些人工無(wú)法培養(yǎng)的微生物。rrna分子結(jié)構(gòu)1.分離出兩種不

31、同的菌種。（亦可使用選擇性培養(yǎng)基，如pea plate或mca plate）； 2.分離出兩種不同的菌落后，分別接種至新的tsa plate上，直到平板上的菌落為單一菌種為止； 3.提取單一菌落的細(xì)菌，進(jìn)行dna的提取，分光光度計(jì)法及瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定dna的質(zhì)量完整性和得 率； 4.以16srrna的通用引物為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物； 5.切取對(duì)應(yīng)的pcr條帶，回收并純化pcr產(chǎn)物； 6.pcr產(chǎn)物直接測(cè)序，以16srrna的通用引物為引物； 7.將測(cè)序所得的序列在genebank中進(jìn)行blast分析以確定該細(xì)菌所屬的類(lèi)別 此方法適于突發(fā)性未知菌或變異菌污染的緊急檢測(cè)

32、鑒定，而常規(guī)手段無(wú)法鑒定該細(xì)菌的種類(lèi)，只有從基因水平來(lái)鑒定該細(xì)菌的種類(lèi)。從細(xì)菌的分離純化到富集到檢測(cè)鑒定出結(jié)果，周期為2天左右，整個(gè)費(fèi)用rmb200.00左右。(一).概述 1.首先我們了解一下什么是致病菌污染源的追溯? 致病菌污染源的追溯就是在食品中檢出有致病菌時(shí),對(duì)原輔料及各個(gè)生產(chǎn)加工環(huán)節(jié) 中存在的致病菌進(jìn)行分離、純化、分型,并最終查找出導(dǎo)致終產(chǎn)品污染的源頭和原因的 過(guò)程. 2.為什么要進(jìn)行污染源的追溯? 1.可以搞清楚致病菌污染的源頭,進(jìn)而分析出污染爆發(fā)的原因; 2.可以更為有效地消除污染源,杜絕污染的再次爆發(fā); 3.在食品生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)可以有效地進(jìn)行質(zhì)控. (一).概述 終產(chǎn)品致病菌的

33、分離與純化與分型原輔料及生產(chǎn)環(huán)節(jié)存在的致病菌的分離純化與分型終產(chǎn)品中致病菌各亞型與中間環(huán)節(jié)致病菌各亞型的比對(duì)找出污染的源頭和原因 4.必須對(duì)致病菌進(jìn)行亞型分析才能更為準(zhǔn)確地找出污染源頭 每一種致病菌都可分為各種不同的亞型,這就像人可以分為黃種人白種人和黑種人一 樣,只有更為精細(xì)的分型才能更為有效的進(jìn)行污染源的追溯.所以污染源的追溯主要所以污染源的追溯主要 就是進(jìn)行致病菌的亞型分析就是進(jìn)行致病菌的亞型分析. .3.污染源追溯的過(guò)程(二).目前常用的致病菌污染源追溯方法 1.致病菌的免疫學(xué)分型法 以生物梅里埃為代表.用致病菌的不同亞型免疫動(dòng)物以產(chǎn)生不同的抗體,再用 這些不同的抗體來(lái)鑒定致病菌不同的亞型.優(yōu)點(diǎn)是速度快,但極易出現(xiàn)假陰性,尤其 是致病菌產(chǎn)生變異或其毒力基因表達(dá)和遺傳成分不穩(wěn)定時(shí).目前已經(jīng)很少被用來(lái)作 為致病菌污染源追溯了. 2.致病菌的表型分型法 biolog公司為代表，用致病菌不同亞型細(xì)微的形態(tài)差別和生理生化特性的不 同進(jìn)行分型分析，優(yōu)點(diǎn)是速度快，但極易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，而且分型時(shí)常常會(huì) 遇到似是而非的情況。目前基本不被用來(lái)做為致病菌的污染源追溯。(二).目前常用的致病菌污染源追溯方法 3. pfge電泳方法簡(jiǎn)介 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field ge