熒光原位雜交(FISH)實(shí)驗(yàn)步驟

1、-作者xxxx-日期xxxx熒光原位雜交(FISH)實(shí)驗(yàn)步驟【精品文檔】?jī)x器設(shè)備 1、 醫(yī)用微波爐； 2、 水浴鍋； 3、 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡； 4、 OLYMPUS DP11數(shù)字顯微照相機(jī)。FISH試劑 （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀釋而成，儲(chǔ)存于4； （2）20×SSC（pH7.0）； （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀釋而成； （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。 （5）變性液(70甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸餾水；28ml甲酰胺。每次新鮮配制。 （6）雜

2、交后洗滌液： 20×SSC 4ml；蒸餾水16ml；甲酰胺20ml。每次新鮮配制。調(diào)節(jié)pH前升至室溫。實(shí)驗(yàn)步驟 1、脫蠟： 1）二甲苯脫蠟3次，每次5min； 2）100酒精兩次，每次2min； 3）移出酒精，斜置切片，標(biāo)記末段向下，空氣干燥。 2、蛋白酶處理: 1）每個(gè)染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中預(yù)熱。將消化酶液加入管內(nèi)，搖動(dòng)直到酶溶解。 2） 37水浴槽中預(yù)熱染色缸和蛋白酶K溶液。37孵育20min。 3） ×SSC在室溫下漂洗切片3次，每次1min。 4）梯度酒精脫水（-20預(yù)冷）。 3、變性

3、： 1）每一個(gè)立式染色缸配制40ml變性溶液； 2）78水浴槽中平衡預(yù)熱混合液染色缸； 3）78孵育8min； 4） 即移入-20預(yù)冷70%酒精的染色缸內(nèi)2min，再依次移入80%、90%和100%的-20預(yù)冷酒精內(nèi)，每缸2min； 5）空氣干燥。 4、雜交： 1）準(zhǔn)備探針； 2）取一個(gè)較大的濕盒，交叉放置切片； 3）滴10l探針在切片的組織上，加蓋玻片； 4）蓋上濕盒蓋，37孵育12h16h。 雜交后的水洗： 5）鑷子小心去除蓋玻片； 6）43預(yù)熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min； 7）2×SSC(37)洗兩次，每次10min； 8）切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待

4、檢測(cè)，勿使切片干燥。 檢測(cè)： 9）從1×PBS中取出切片，除去過(guò)多的水分，避免標(biāo)本干燥。把切片放入濕盒內(nèi)，同時(shí)處理4張切片。 10）每張切片使用30l60l羅丹明抗-地高辛抗體或FITC卵白素，室溫下孵育20min； 11）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min。擴(kuò)增： 12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出； 13）每張切片滴30l60l抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min； 14）去掉塑料蓋膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min； 1

5、5）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出； 16）每張切片滴30l60l抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min； 17）1×PBS室溫下洗3次，每次2min。 5、細(xì)胞核染色： 1）張切片加10l20l DAPI，覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育25ml； 2）盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內(nèi)保存在-20冰箱。切片在染色之后1h內(nèi)可以在顯微鏡下觀察。PRINS步驟 1、常規(guī)脫蠟浸入0.01mol/LPBS； 2、用0.2mol/L鹽酸處理5min； 3、蛋白酶K(25g/m1)消化37 15min； 4、分別用80，95和100酒精脫水，室溫干片； 5、加PCR混合液25L(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200mol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5l，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加蓋片； 6、94變性5min后置入65濕盒中5min； 7、用0.1×SSC液，65洗5min； 8、片于65 10s20s；用4×SSC-0.1吐溫20液42洗5min，2次； 9、經(jīng)Buffer I液洗后滴加20羊血清封閉30min； 10、加地高辛抗體復(fù)合物(1:50