石墨烯-DNA電化學(xué)傳感器對(duì)乳腺癌易感1號(hào)基因的靈敏度檢測(cè)研究

1、石墨烯-DNA電化學(xué)傳感器用于乳腺癌1號(hào)基因靈敏檢測(cè)的研究P.Abdul Rasheed , N.Sandhyarani （納米科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，納米科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國(guó)立技術(shù)學(xué)院科澤科德，加爾各答，喀拉拉邦，印度）摘要：一種基于石墨烯的電化學(xué)DNA傳感器已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并用于乳腺癌相關(guān)基因BRCA1的低濃度檢測(cè)。該DNA傳感器采用所謂的“三明治”檢測(cè)方法，即使捕捉探針（DNA-c）和報(bào)告探針（DNA-r）與靶探針（DNA-t）在石墨烯修飾的玻碳電極的夾層中進(jìn)行雜交。報(bào)告探針被偶聯(lián)在金納米顆粒上，氧化態(tài)的金納米顆粒則被用于靶探針的電化學(xué)檢測(cè)。該傳感器的性能用循環(huán)伏安法（CV）和計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，

2、并已經(jīng)證實(shí)其性能是穩(wěn)定、可重復(fù)且靈敏的，而且它可以檢測(cè)出高達(dá)1飛摩爾的BRCA1基因（5.896毫微微克/毫升）。關(guān)鍵詞：石墨烯 電化學(xué)生物傳感器 DNA傳感器 乳腺癌 計(jì)時(shí)電流法1.引言DNA傳感器廣泛應(yīng)用于癌癥早期和突變檢測(cè)的診斷測(cè)試，以及基因序列分析，法醫(yī)調(diào)查和醫(yī)療評(píng)估等領(lǐng)域。在各種各樣的DNA傳感器中，電化學(xué)DNA傳感器由于其構(gòu)造簡(jiǎn)單，成本低，靈敏度高，小型化等優(yōu)點(diǎn)而極具吸引力且前景廣闊?，F(xiàn)在用于固定DNA電極材料各異，包括金電極，修飾電極，其中修飾電極又包括碳納米管電極和石墨烯修飾的電極等。石墨烯為二維納米結(jié)構(gòu)，它是一種擁有巨大的潛力電極材料，基于石墨烯擁有比表面積大、導(dǎo)電率高、在室

3、溫下的電子遷移率快等優(yōu)點(diǎn)，其已被廣泛用于電化學(xué)生物傳感器的研究和發(fā)展。石墨烯分析能夠快速的進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移并為生物分子的固定提供一個(gè)無(wú)細(xì)胞毒性且面積較大的表面。在電催化和傳感器方面，在石墨烯/功能石墨烯和生物分子之間通過(guò)非共價(jià)鍵的相互作用如-共軛或氫鍵，使石墨烯在連接各種生物分子方面表現(xiàn)出巨大的潛能。單鏈DNA（ssDNA）通過(guò)鍵的相互作用直接固定在石墨烯和氧化石墨烯上，研究結(jié)果表明，與雙鏈DNA相比，單鏈DNA和石墨烯有的較強(qiáng)相互作用。此外石墨烯-DNA不易降解，故能夠長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。乳腺癌1號(hào)基因（BRCA1）是能在人體乳腺細(xì)胞和其他組織細(xì)胞中表達(dá)的一種管護(hù)基因。如果乳腺癌1號(hào)基因中檢測(cè)到超過(guò)數(shù)

4、百個(gè)突變基因的話，這就意味著有較大的患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。BRCA1基因突變能引起約40%的遺傳性乳腺癌和超過(guò)80%的遺傳性乳腺和卵巢癌。目前有關(guān)于BRCA1與DNA雜交的電化學(xué)靈敏度和選擇性的檢測(cè)的報(bào)告都已經(jīng)被報(bào)道，這些報(bào)道提出了一種基于使用不同的傳感器進(jìn)行無(wú)標(biāo)記檢測(cè)BRCA1基因的新型格諾磁電化學(xué)分析法。另一項(xiàng)研究指出，在乳腺癌BRCA1基因相關(guān)的DNA雜交的檢測(cè)中，與使用未修飾的電極相比，使用多壁碳納米管（碳納米管）修飾的玻碳電極（GCE）能使鳥(niǎo)嘌呤的氧化信號(hào)增強(qiáng)。此外，基于絲網(wǎng)印刷石墨電極的單壁碳納米管（SWCNT）可用于DNA雜交的特定BRCA1基因序列的電化學(xué)檢測(cè)。在本文的研究中，為了檢

5、測(cè)低濃度的BRCA1基因（靶DNA稱為DNA-t）序列，我們制作了一個(gè)靈敏度高且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的DNA傳感器。該傳感器上在5端氨基的DNA-c固定在石墨烯修飾的玻碳電極上（GCE），其中有一半的DNA-t與DNA-c進(jìn)行雜交固定，另一半的DNA-t與DNA-r在金納米粒子上形成共軛。最終通過(guò)采用循環(huán)伏安法監(jiān)測(cè)金納米顆粒的電化學(xué)氧化來(lái)檢測(cè)DNA-t的濃度。2、實(shí)驗(yàn)方法2.1 材料寡核苷酸是在IDT公司（美國(guó)最大的代客合成核酸供貨商）購(gòu)買，本研究采用如下的堿基序列：捕捉鏈（DNA-c）：5 CTT TTG TTC 3目標(biāo)鏈（DNA-t) ：5 GAA CAA AAG GAA GAA AAT C 3探針鏈

6、 (DNA-r) ：5 GAT TTT CTT C 3非互補(bǔ)鏈 (NC) : 5CCT TGT TGG ACT CCC TTC T33堿基錯(cuò)配的互補(bǔ)鏈 ：(3MM): 5 CAA CAA AAG CAA CAA AAT C 3 石墨粉(>20 um), O-(3-羧丙基)-O-2-(3-巰基丙酰氨基)乙基-聚乙二醇(CPEG)，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，三磺基-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，都向印度的西格瑪奧德里奇購(gòu)買。氯金酸是從印度的SRL化工公司購(gòu)買。使用的其他化學(xué)品多為分析純，它們是由印度的菲舍爾科學(xué)與默克公司提供。實(shí)驗(yàn)的所有過(guò)程都使用超

7、純?nèi)ルx子水?；旌暇彌_和共軛緩沖液分別用0.1 M NaCl- PBS緩沖液和0.3 M NaCl- PBS緩沖液，0.1 M NaCl- PBS緩沖液由0.1 M NaCl和10mM磷酸鹽緩沖液(Ph=7)組成，0.3 M NaCl- PBS緩沖液由0.3 M NaCl和10mM磷酸鹽緩沖液(Ph=7)組成。2.2 儀器 傳感器表面進(jìn)行了掃描電子顯微鏡（SEM）和SU-6600場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（日立，日本）的表征，循環(huán)伏安法（CV）、計(jì)時(shí)電流法的檢測(cè)是在CHI400A系列電化學(xué)分析儀（CH儀器公司，德克薩斯，美國(guó)）上進(jìn)行。一個(gè)三電極系統(tǒng)采用鉑絲作為輔助電極，甘汞電極為參比電極和以修飾玻碳的電極為

8、工作電極。電化學(xué)測(cè)量是在室溫下以掃描速率為100 mV/s進(jìn)行。2.3 石墨烯的合成 使用天然石墨粉采用改進(jìn)的Hummers法制備氧化石墨烯，簡(jiǎn)要地說(shuō)即1克的石墨粉加入到23 mL 含98% 的硫酸中，在室溫下攪拌過(guò)夜，然后100mg硝酸鈉添加到混合物中，攪拌30分鐘；將混合物放入低與5 C的冰浴中，并緩慢加入3 g 高錳酸鉀；加熱至3540 C攪拌30分鐘，然后在25分鐘內(nèi)向上述混合物中加入46 mL水，最后，140毫升水和10 mL 30% H2O2添加到混合物中抑制進(jìn)一步的反應(yīng)。其中混合物中未脫落的石墨可通過(guò)反復(fù)離心和過(guò)濾除去（先用5%的HCl然后用水），最終產(chǎn)物用水徹底清洗并在65C真

9、空中干燥過(guò)夜。低溫剝離常用于石墨烯轉(zhuǎn)化為氧化石墨烯，將氧化石墨烯粉末放入石英坩堝中在在熱空氣爐中以180 加熱3小時(shí)，經(jīng)過(guò)剝離后，我們能明顯的感覺(jué)到其質(zhì)量的改變和體積的膨脹。同時(shí)，熱剝離后石墨烯的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于氧化石墨烯的含量。通過(guò)使用掃描電子顯微鏡、X-射線衍射和拉曼光譜對(duì)氧化石墨烯和石墨烯的分析，證實(shí)了多層石墨烯的形成。將合成的石墨烯以0.5 mg/ml分散在二甲基甲酰胺（DMF）水混合物（1:9）中，用于滴涂修飾玻碳電極。2.4 探針鏈與金納米粒子的作用過(guò)程通過(guò)谷氨酸單鈉還原法合成金納米粒子，該反應(yīng)在pH=7的條件下完成。合成的金納米粒子以12000轉(zhuǎn)/秒離心30min來(lái)提純，沉淀再分散在

10、0.05 mM CPEG的水溶液中并放置過(guò)夜。然后，將樣品與相同濃度(0.5 mM) 二氯乙烷（EDC)和NHS混合，震蕩2h；未反應(yīng)的試劑以12000轉(zhuǎn)/秒離心30min并反復(fù)洗滌去除，接下來(lái)取100uL析出物溶解于600uL的混合緩沖溶液中，加入25 uM DNA-r100uL，在4C下孵育16h。當(dāng)未反應(yīng)的DNA不再使用時(shí)，通過(guò)離心將其分離，并將DNA沉淀溶解于共軛緩沖溶液中，在4 C下保存待用。這些與DNA-r作用的金納米粒子常用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，表示為DNA-r.AuNP。2.5 傳感器的制備 在修飾前，工作電極需用0.3 um氧化鋁漿料拋光，用水徹底沖洗干凈，然后分別在異丙醇和水中進(jìn)行超

11、聲預(yù)處理。電極清洗干凈后，取6 uL石墨烯溶液滴涂到玻碳電極表面，在空氣自然晾干保存2h，以此來(lái)獲得石墨烯修飾的玻碳電極。取1 uM DNA-c溶液 6 uL由石墨烯修飾過(guò)的玻碳電極上并在4 C下保溫2h。將電極浸入1 M牛血清白蛋白中1分鐘，從表面上看，由非特異結(jié)合的單鏈DNA-t 和 DNA-r將被封鎖在修飾過(guò)的玻碳電極里，繼續(xù)將DNA-t溶液滴涂在電極表面，在室溫下保持一小時(shí)。整個(gè)固定過(guò)程，DNA-t的一半與DNA-c進(jìn)行雜交另一半與DNA-r.AuNP雜交。DNA-r.AuNP溶液(含10 nM DNA-r)滴涂到電極表面完成雜交過(guò)程，將得到的GCE/Gr/DNA-c|DNA-t|DN

12、A-r.AuNP電極用10mM的PBS緩沖液進(jìn)行徹底清洗，用循環(huán)伏安法（CV）和計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行檢測(cè)。0.2 M高氯酸（HOCl4）常作為電解質(zhì)，而掃描電子顯微鏡（SEM）的分析常用氧化銦錫（ITO）玻璃板代替玻碳電極作為分析的基體。3. 結(jié)果與討論BRCA1基于序列傳感器具體制作的各個(gè)階段示意圖，如方案1所示。 3.1 掃描電子顯微鏡（SEM）電極修飾每一階段的表面特性是通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察的。雜交DNA-r.AuNP前和后傳感器表面的SEM圖像，如圖1所示。當(dāng)雜交DNA-r.AuNP后，在SEM圖像中電極表面上金納米顆粒的存在中是顯而易見(jiàn)的，這表面DNA-c已固定好，也代表著DNA-t和

13、DNA-r.AuNP有著良好的交聯(lián)。如圖1 b所示金納米粒子的尺寸在20-25nm范圍間。同時(shí)，增加DNA-t的濃度，它將允許更多的DNA-r.AuNPs與其雜交，將增加金納米粒子的數(shù)量。圖2顯示了在最終雜交步驟后各種DNA-t濃度傳感器表面的SEM圖像，從圖中可明顯的看出，隨著在DNA-t濃度的增加，納米金的數(shù)量也在增加。圖1：SEM圖 (a)為ITO/graphene/DNA-c|DNA-t和(b)為 ITO/graphene/DNA-c|DNA-t|DNA-r.AuNP，插圖顯示的是金納米粒子放大圖像圖2： ITO/graphene/DNA-c|DNA-t|DNA-r.AuNP傳感器與D

14、NA-t不同濃度下的SEM圖 圖(a)1fM, 圖(b)100fM, 圖(c)10pM and 圖(d)1nM.3.2 循環(huán)伏安法 每進(jìn)行一個(gè)階段后，均在5 mM K3Fe(CN)6-0.1M KCl體系中以100 mV/s 測(cè)定其循環(huán)伏安圖，每一個(gè)修飾步驟的電流都有明顯的變化，這樣可很好的確認(rèn)每次DNA探針的固定和雜交的效果（數(shù)據(jù)未顯示）。DNA-石墨烯電極對(duì)特異性基因序列的性能在圖3a 中表現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)中，DNA-t在GCE/Gr/DNA-c|DNA-t|DNA-r.AuNP電極上所用的濃度從1 fM 到 1 nM 。同時(shí)，我們使用高濃度的DNA-r確保其和探針鏈DNA充分進(jìn)行雜交。每次修飾

15、金納米粒子（10nm）后，圖3：DNA-石墨電極循環(huán)伏安圖 （a）不同濃度的DNA-t （b）修飾DNA-r 和 DNA-r.AuNP電化學(xué)測(cè)量體系為0.2M高氯酸（HClO4）水溶液，SCE掃描速率為0.1 V/s均要將未與DNA-r雜交的納米粒子洗凈，然后在進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)孵育DNA-r.AuNP以后，由于金納米粒子的表面上的氧化，將在1.1 V處觀察到一個(gè)明顯的氧化峰。這表明DNA-t 和 DNA-c的雜交以及遠(yuǎn)處的DNA-r.AuNP和DNA-t雜交導(dǎo)致了一個(gè)從金納米并通過(guò)DNA雙鏈到石墨烯的遠(yuǎn)程的電子轉(zhuǎn)移。隨著DNA-t濃度的增加，金納米粒子能吸附的表面積增加，這將允許更多的D

16、NA-r.AuNP進(jìn)行雜交。因此，由于金納米顆粒的氧化峰隨DNA-t濃度的增加，以此來(lái)靈敏的檢測(cè)DNA-t，采用這種策略，使用循環(huán)伏安我們可以檢測(cè)到1 fM BRCA1目標(biāo)基因。此外電化學(xué)反應(yīng)是可逆的，去活化之后，氧化峰便消失；當(dāng)重新再活化的DNA-t 和DNA-r.AuNP中進(jìn)行孵育，氧化峰將重新出現(xiàn)。去活化過(guò)程如下，首先滴加0.1 M NaOH溶液在電極表面，10秒后用含1% SDS的10mM PBS緩沖溶液沖洗干凈，最后用蒸餾水潤(rùn)洗。未修飾金納米粒子的DNA-r用于雜交則無(wú)法觀察到氧化峰（如圖3b），同時(shí)在相同條件下的非互補(bǔ)序列的DNA-t沒(méi)有顯示的氧化峰。正如預(yù)期的那樣，未雜交DNA-

17、t的DNA-c的電極表面不能與DNA-r.AuNP穩(wěn)定的結(jié)合，即電極表面沒(méi)有DNA-r.AuNP。3.3 計(jì)時(shí)電流法 為了進(jìn)一步研究該傳感器的檢測(cè)能力，使GCE/Gr/DNA-c|DNA-t|DNA-r.AuNP傳感器在不同濃度的DNA-t中以1.1 V條件下測(cè)定其計(jì)時(shí)電流響應(yīng)情況，結(jié)果顯示，隨著DNA-t的濃度的增加，氧化還原電流強(qiáng)度也在增大，這種變化可以檢測(cè)到100 aM DNA-t的濃度（如圖4a）。在1s時(shí)計(jì)時(shí)電流的響應(yīng)值強(qiáng)度與DNA-t濃度的對(duì)數(shù)繪制如圖4b的曲線，我們可以看出，DNA-t的濃度從1fM 到 1nM的范圍內(nèi)的對(duì)數(shù)與該傳感器的響應(yīng)值呈線性關(guān)系。 該傳感器的選擇性檢測(cè)則使

18、用相同濃度的3MM DNA-t和NC DNA-t代替DNA-t進(jìn)行測(cè)試，在1.1 V條件下，觀察到10fM的DNA-t, 3MM DNA-t 和 NC DNA-t的計(jì)時(shí)電流強(qiáng)度分別為34.1 ± 0.8， 31.17 ± 0.65 和23.16 ± 0.35 uA（如圖4c），這一結(jié)果證實(shí)該傳感器對(duì)DNA序列具有高度選擇性的，可以用于檢測(cè)錯(cuò)配序列。同時(shí)也表明，基于石墨烯的DNA傳感器可用于高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)特定的DNA序列。該傳感器經(jīng)過(guò)兩個(gè)再生周期后石墨烯層將被剝離，因此我們建議該傳感器應(yīng)作為一次性使用的一次性傳感器。為了驗(yàn)證一次性傳感器芯片的性能，我們采用

19、的絲網(wǎng)印刷電極（SPE）和恒電位階躍響應(yīng)技術(shù)，其在補(bǔ)充資料中介紹（圖S1），結(jié)果表明，SPE/Gr/DNA-c|DNA-t|DNA-r.AuNP傳感器靈敏度高，同時(shí)SPE的結(jié)果可以和修飾電極媲美。 關(guān)于BRCA1基因檢測(cè)所使用的不同的傳感器的比較及其特異性列于表1，表明本研究的傳感器具有靈敏度高、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單性和低的檢測(cè)限等優(yōu)良性能。 圖4： （a）不同DNA-t濃度下傳感器在計(jì)時(shí)電流法的響應(yīng)值 （b）氧化電位（1.1 V）的氧化還原電流與DNA-t濃度的對(duì)數(shù)作圖 （c）傳感器對(duì)NC DNA-t and 3MM DNA-t的選擇性研究 （d）條形圖表示選擇性表一：報(bào)道中檢測(cè)BRCA1基因

20、不同類型的傳感器4 結(jié)論 目前，利用基于石墨烯的電化學(xué)DNA生物傳感器已經(jīng)可以對(duì)乳腺癌相關(guān)基因BRCA1進(jìn)行飛摩爾級(jí)別的檢測(cè)，在本實(shí)驗(yàn)中我們測(cè)試了利用金納米粒子作為該傳感器電化學(xué)信號(hào)變化標(biāo)記的有效性，通過(guò)循環(huán)伏安法（CV）和計(jì)時(shí)電流法對(duì)該傳感器的性能進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該傳感器能檢測(cè)到最小可達(dá)1fM 目標(biāo)DNA。因其高度的靈敏度和選擇性，使得改進(jìn)后的這種生物傳感器能夠用于早期的癌癥的診斷。致謝感謝印度科學(xué)和工業(yè)研究委員會(huì)及科學(xué)技術(shù)部提供的資金支持。非常感謝印度哥印拜陀市阿里塔納米材料實(shí)驗(yàn)室的Dr. T.G. Satheesh Babu and Mr. P.V.Suneesh的支持，他們熱心的為我們提

21、供了絲網(wǎng)印刷電極以及為絲網(wǎng)印刷電極的電化學(xué)測(cè)量提供技術(shù)幫助。參考文獻(xiàn)1 E. Pale cek, M. Fojta, M. Tomschik, J. Wang, Electrochemical biosensors for DNA hybridization and DNA damage, Biosensors & Bioelectronics 13 (1998) 621.2 J. Wang, D. Xu, A. Kawde, R. Polsky, Metal nanoparticle-based electrochemical stripping potentiometric det

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