微生物遺傳結合轉(zhuǎn)移

1、 中插入 構建而成。 才能從供體菌向受體菌轉(zhuǎn)移。e. coli (ppk2073） ppk2073中帶完整的 sinorhizobium fredii 實驗菌株 供體菌：e.coli dh5(ptr102-luxab) (tcr、luxab) 受體菌: sinorhizobium fredii ( tc s) 輔助菌: e. coli mm294 (prk2073)（specr） 實驗產(chǎn)物 轉(zhuǎn)移接合子: s. fredii (ptr102-luxab), (tcr，luxab) 菌株活化（教師做）： 將受體、供體、輔助菌分別培養(yǎng)到對數(shù)期： e. coli (ptr102-luxab): 液體l

2、b + tc 20g/ml, 37oc震蕩培養(yǎng)1夜； s. fredii : ty液體, 28oc震蕩培養(yǎng)2天 ； e. coli (ppk2073) : 液體lb + spe 50g/ml ,37oc震蕩培養(yǎng)1夜 倒平板（學生做）：第1、2組：倒不加tc的sm（平皿上標記“純sm” ）： 融化sm后，每瓶加混合維生素0.2ml（裝在1.5ml離心管中，標記“維”)，混勻倒平板，3瓶250ml的培養(yǎng)基共倒3640皿。凝固后，報紙包好，放冰箱冷藏室（4oc）備用。第3、4組：倒ty平板： 融化1瓶ty固體, 倒平板12-13個, 凝固后分發(fā)到4個超凈臺使用。第5、6組：倒smtc平板（平皿上標記

3、“smtc” ） ： 融化sm后，每瓶加混合維生素0.2ml和四環(huán)素0.5ml （tc,10mg/ml,裝在1.5ml離心管中，標記“tc” ），混勻倒平板，3瓶250ml的培養(yǎng)基共倒3640皿。凝固后，報紙包好，放冰箱冷藏室(4oc) 備用。 (1)吸取供體菌、輔助菌各 0.4ml，吸受體菌0.6ml，都加入同一個1.5ml離心管內(nèi)（每個同學做1管），8000轉(zhuǎn)/min 離心1分鐘。 (2) 倒上清，向沉淀加 1ml 的 ty液體，用 tip上下抽吸，洗滌菌體，再8000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，倒上清，留沉淀。 (3) 用鑷子取滅菌濾紙片貼于已準備好的ty平板上（每個同學1片，3片/平板，平皿

4、背面標記姓名），用200l的 tip 抽吸離心管內(nèi)沉淀的菌體，打散成濃菌液，將之加到濾紙片中央（切勿傾斜平板，以免菌液流出濾紙片以外） (4) 加好菌液后，靜置510分鐘，待濾紙上的培養(yǎng)基液體被平板吸收后，倒置放培養(yǎng)箱，28oc培養(yǎng)1天。（1）滅菌小pa瓶中加5ml無菌水(1瓶/人), 鑷子揭下ty平板上的濾紙片，放入瓶中，在震蕩混勻器上充分打散菌體。（2）向1.5ml管加0.9ml無菌水,加0.1ml已打散的菌液,混勻。（3）吸已稀釋的菌液分別涂布于昨日倒的 sm+tc 平板和不加 tc的純sm上（每個同學各涂1板， 200l / 板）（4）放28 oc培養(yǎng)6-7天，下周看結果： 在暗室內(nèi)向培養(yǎng)皿中加10l