流式細(xì)胞的原理及臨床應(yīng)用

1、流式的原理及臨床應(yīng)用杭州輝圖生物有限公司技術(shù)支持部 胡榮連什么是流式細(xì)胞儀？ 檢測(cè)流動(dòng)中細(xì)胞（顆粒）的儀器 目標(biāo)物可以是細(xì)胞、細(xì)菌或各種微粒0.5um50um范圍內(nèi)流式細(xì)胞儀原理介紹流式細(xì)胞儀基本原理示意圖流式細(xì)胞儀基本原理示意圖流式細(xì)胞儀檢測(cè)什么信號(hào)？細(xì)胞抗原抗體熒光激光束通過(guò)流式細(xì)胞儀我們可以得到以下信息 - 相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度(ssc) - 相對(duì)細(xì)胞大小(fsc) - 染色過(guò)細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度流式細(xì)胞儀標(biāo)本準(zhǔn)備染色的一般原則及方法標(biāo)本來(lái)源： 外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細(xì)胞、脫落細(xì)胞及其他。 以及血清或各類(lèi)體液樣本。抗體染色一般方法 外周血白細(xì)胞分析：100ul全血 血小板分析：

2、15ul全血（根據(jù)樣本血小板數(shù)量） 紅細(xì)胞分析：1ul全血（根據(jù)樣本中紅細(xì)胞數(shù)稀釋后使用） 骨髓：100ul 其他樣本，計(jì)數(shù)后決定使用體積目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量及檢測(cè)終濃度：目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量及檢測(cè)終濃度：1106/ml孵育、溶血、固定孵育、溶血、固定 抗體孵育：室溫下避光15分鐘（某些情況下如：細(xì)胞內(nèi)因子檢測(cè)需冰育） 溶血：如樣本含中有紅細(xì)胞需溶血 樣本溶血后離心上機(jī)檢測(cè)（固定后可放置較長(zhǎng)時(shí)間）流式細(xì)胞儀分析報(bào)告及圖譜流式細(xì)胞儀分析報(bào)告及圖譜 ss（側(cè)向散射光）-反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的多少fs（前向散射光）-反應(yīng)細(xì)胞大小設(shè)門(mén)：選擇要分析的細(xì)胞群體設(shè)定陰性、陽(yáng)性范圍目前流式細(xì)胞儀臨床檢測(cè)項(xiàng)目目前流式細(xì)胞儀臨床檢測(cè)項(xiàng)

3、目流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用=hiv免疫分型，cd4絕對(duì)計(jì)數(shù)=白血病和淋巴瘤的免疫分型=腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析=網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)=細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)=干細(xì)胞計(jì)數(shù)=殘量白血病細(xì)胞檢查=hla-b27檢查=血小板功能及相關(guān)疾病1、 hla-b27的檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylistis）意為彎曲的脊柱。它是和種慢性、進(jìn)行性和炎性疾病，主要累及骶骼關(guān)節(jié)、脊柱、脊柱骨軟組織及四肢關(guān)節(jié)，表現(xiàn)為椎間盤(pán)維環(huán)和纖維環(huán)附近結(jié)締組織的骨化，椎間動(dòng)關(guān)節(jié)和四肢關(guān)節(jié)滑膜的炎癥和增生，嚴(yán)重者可失去勞動(dòng)能力。強(qiáng)直性脊柱炎是血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病中具有代表性的疾病，臨床上曾長(zhǎng)

4、期把a(bǔ)s 誤認(rèn)為是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)亞型，60 年代以來(lái)人們才認(rèn)識(shí)到期無(wú)論從病因?qū)W、遺傳學(xué)、流行病學(xué)和臨床表現(xiàn)特點(diǎn)等諸多方面來(lái)看，as 都是一種不同于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的獨(dú)立疾病。就目前的研究文獻(xiàn)而言，hla-b27 與as 并非絕對(duì)相關(guān)，有些as 患者表現(xiàn)為hla-b27陰性，而且并非所有hla-b27 陽(yáng)性者均出現(xiàn)as 癥狀。b27與強(qiáng)直性脊柱炎與強(qiáng)直性脊柱炎hla-b27診斷的臨床意義強(qiáng)直性脊柱炎強(qiáng)直性脊柱炎90-100% 的強(qiáng)直性脊柱炎患者h(yuǎn)lab27為陽(yáng)性。但是hla-b27陽(yáng)性的人群中只有820是強(qiáng)直性脊柱炎。瑞特綜合征瑞特綜合征6590瑞特綜合癥患者h(yuǎn)la-b27為陽(yáng)性。如果hla

5、b27+個(gè)體是非淋菌性尿道炎，那么有20-25%的可能性發(fā)展為瑞特綜合癥，只有1的可能性正常。hlab27不是該疾病發(fā)生的必要條件，但是卻與病程發(fā)展有緊密聯(lián)系?！胺磻?yīng)性關(guān)節(jié)炎反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎”是一種自身限制的少關(guān)節(jié)型關(guān)節(jié)炎伴隨著革蘭氏陰性細(xì)菌如桿菌性痢疾，沙門(mén)氏菌，弧形桿菌，耶爾森氏菌和至賀氏菌引起的胃腸感染。銀屑病關(guān)節(jié)炎銀屑病關(guān)節(jié)炎 - 90%的銀屑病關(guān)節(jié)炎聯(lián)合薦腸關(guān)節(jié)炎和脊椎炎患者h(yuǎn)la b27陽(yáng)性。急性前葡萄膜炎急性前葡萄膜炎通常表現(xiàn)為疼痛，畏光和流淚?？赡苁呛缒じ腥净蚪Y(jié)合了睫狀體或視網(wǎng)膜萎縮。青少年風(fēng)濕癥青少年風(fēng)濕癥/慢性關(guān)節(jié)炎慢性關(guān)節(jié)炎ii 這些兒童中75為hla b27+。相反，青少年

6、風(fēng)濕癥/慢性關(guān)節(jié)炎i，同樣也是少關(guān)節(jié)性的，但是更常見(jiàn)于女孩，與慢性虹膜睫狀體炎(30%)，陽(yáng)性的ana (80%)和hla dr5關(guān)聯(lián)，卻不是b27。 hla-b27的臨床檢測(cè)的臨床檢測(cè) hla-b27屬于1型mhc基因?；旧媳磉_(dá)在機(jī)體所有有核細(xì)胞上，特別是淋巴細(xì)胞表面有豐富的含量。使用熒光定量標(biāo)準(zhǔn)微球，校正hla-b27實(shí)驗(yàn)條件后，測(cè)定樣本中t淋巴細(xì)胞hla-b27表達(dá)水平。若hla-b27表達(dá)水平大于標(biāo)準(zhǔn)微球設(shè)定mark，則為陽(yáng)性結(jié)果；若hla-b27表達(dá)水平低于標(biāo)準(zhǔn)微球設(shè)定mark，則為陰性結(jié)果。 anti-hla-b27 kit(美國(guó)bd biosciences公司；cat:3401

7、83)， 其中包括：1、anti-hla-b27-fitc/cd3-pe 2、hla-b27 calibration beads 3、facs lysing solutionhla-b27流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式細(xì)胞儀檢測(cè)2 2、淋巴細(xì)胞亞群分析、淋巴細(xì)胞亞群分析淋巴細(xì)胞亞群基礎(chǔ)知識(shí)淋巴細(xì)胞亞群基礎(chǔ)知識(shí) t淋巴細(xì)胞：主要?dú)≡w感染細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞。 表面標(biāo)志物：cd3，與tcr形成復(fù)合體，是t細(xì)胞識(shí)別抗原和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的主要單位。 cd3+/cd4+：輔助性t細(xì)胞 cd3+/cd8+：殺傷性t細(xì)胞 cd8+t細(xì)胞又稱細(xì)胞毒性細(xì)胞又稱細(xì)胞毒性t細(xì)胞，細(xì)胞，tc或或ctl，它在，它在t細(xì)胞免細(xì)胞免疫應(yīng)答中

8、發(fā)揮重要功能。疫應(yīng)答中發(fā)揮重要功能。 tc細(xì)胞識(shí)別抗原活化后釋放胞漿內(nèi)顆粒毒素：穿孔素細(xì)胞識(shí)別抗原活化后釋放胞漿內(nèi)顆粒毒素：穿孔素perforin和顆粒酶和顆粒酶granzyme，殺傷靶細(xì)胞。，殺傷靶細(xì)胞。b淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 b淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。 1，產(chǎn)生的抗體可與抗原起特異性的結(jié)合，如中和細(xì)菌的外毒素使其失去毒性作用； 2，抗體與抗原結(jié)合后形成的復(fù)合物易被吞噬細(xì)胞清除； 3，抗體與抗原結(jié)合后再結(jié)合補(bǔ)體清除病原體。 b b細(xì)胞特異性標(biāo)志物：細(xì)胞特異性標(biāo)志物：cd19cd19nk細(xì)胞細(xì)胞 nk自然殺傷細(xì)胞：識(shí)別病毒感染細(xì)胞表面表達(dá)的相應(yīng)配體，nk細(xì)胞一經(jīng)識(shí)別病毒感染細(xì)胞后即對(duì)之

9、施加殺傷作用。 nknk細(xì)胞表面標(biāo)志物：細(xì)胞表面標(biāo)志物：cd3-/cd16+cd56+cd3-/cd16+cd56+通過(guò)淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)可了解在不同情況下體內(nèi)免疫功能狀態(tài)，輔助臨床疾病的診斷，探索疾病發(fā)病機(jī)理、病程、預(yù)后，監(jiān)測(cè)、指導(dǎo)臨床治療方案。淋巴細(xì)胞亞群的臨床檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群的臨床檢測(cè)總總t和總和總b判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 t-t-淋巴細(xì)胞上升淋巴細(xì)胞上升多見(jiàn)于：慢性活動(dòng)性肝炎或慢性遷延性肝炎；器官移植排斥反應(yīng)；重癥肌無(wú)力；甲亢與甲狀腺炎患者；何杰金病 t-t-淋巴細(xì)胞下降淋巴細(xì)胞下降多見(jiàn)于：惡性腫瘤；自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)

10、炎等；原發(fā)性免疫缺陷病，如生天性胸腺發(fā)育不全等、艾滋??；接受放療、化療或者使用腎上腺皮質(zhì)激素等免疫抑制劑 b-b-淋巴細(xì)胞上升淋巴細(xì)胞上升多見(jiàn)于：多發(fā)性骨髓瘤；巨球蛋白血癥；淋巴瘤；艾滋病 b-b-淋巴細(xì)胞下降淋巴細(xì)胞下降多見(jiàn)于：原發(fā)性免疫缺陷病，如性聯(lián)無(wú)丙種球蛋白血癥等、惡性腫瘤 t-t-淋巴細(xì)胞與淋巴細(xì)胞與b-b-淋巴細(xì)胞同時(shí)下降淋巴細(xì)胞同時(shí)下降多見(jiàn)于：聯(lián)合免疫缺陷病，如重癥狀聯(lián)合免疫缺陷病等 cd4+和cd8+t細(xì)胞有助于監(jiān)測(cè)患有免疫缺陷疾免疫缺陷疾病?。ㄈ鐂cid、aids的病人體內(nèi)cd4+細(xì)胞亞群的百分率相對(duì)降低，而cd8+群體的百分率相對(duì)升高），自身免疫性疾病自身免疫性疾病（如在s

11、le病人中，cd8+淋巴細(xì)胞的相對(duì)百分比往往會(huì)降低，但當(dāng)使用類(lèi)固醇藥物治療時(shí)，也可能上升。在急性急性gvhd和和移植排斥移植排斥中，cd8+淋巴細(xì)胞所占的比例有可能在正常人的范圍之外） th和和ts淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù) cd4+/cd8+的比值：評(píng)價(jià)那些自身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)，此外，這一比值還可用來(lái)監(jiān)測(cè)骨髓移植病人以免受到急性gvhd的攻擊 cd4/cd8 升高：自身免疫性疾病，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、sle。 cd4/cd8 降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血等。th/ts比值比值自然殺傷細(xì)胞（自然殺傷細(xì)胞（nk） nk細(xì)胞增高常見(jiàn)于：某

12、些病毒感染性疾病的早期；長(zhǎng)期使用干擾素或使用干擾素的誘導(dǎo)物；骨髓移植后；習(xí)慣性流產(chǎn)。 nk細(xì)胞降低常見(jiàn)于：惡性腫瘤，特別是中晚期或伴有轉(zhuǎn)移的腫瘤；免疫缺陷病及使用腎上腺激素等免疫抑制劑。 部分病毒感染、細(xì)菌感染及真菌感染；某些白血病及白血病前期。惡性腫瘤患者t 細(xì)胞亞群和sil22r 的變化及意義盧香蘭1 ,李霞1 ,王萍萍1 ,李玲2 ,李艷1 3 4 2 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)j chin med univ 第33 卷第3 期2004 年6 月疾病 t 細(xì)胞亞群 cd4+/cd8+ cd4+ cd8+ 類(lèi)風(fēng)關(guān) （活動(dòng)期） sle - 或 （活動(dòng)期） sjogren綜合癥 多發(fā)性硬化癥 重癥肌無(wú)力 膜型腎小球腎炎 胰島素依賴性糖尿病 乙型肝炎 自身溶血性貧血 上呼吸道感染 傳染性單核細(xì)胞增多癥 （急性期） 巨細(xì)胞病毒感染 乙肝 （急性期/慢性肝炎） 結(jié)核 （胸水/重癥外周血） 麻風(fēng) 瘧疾