chapter 03 克隆載體

1、 Vectors1. 載體載體 （Vectors）體外重組體外重組DNADNA實(shí)驗(yàn)中，將外源實(shí)驗(yàn)中，將外源DNADNA片段運(yùn)送進(jìn)宿主片段運(yùn)送進(jìn)宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的DNADNA分子分子( (運(yùn)載工具運(yùn)載工具) )稱為稱為載載體體(vector)(vector) 。 （1 1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定存在，）在宿主細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定存在，自主復(fù)制自主復(fù)制, , 具有具有oriori。（2 2）有一段）有一段多克隆位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)（MCSMCS）。2. 2. 分子克隆對(duì)載體的要求（特征）分子克隆對(duì)載體的要求（特征）外源外源DNADNA插入其中不影響載體的復(fù)制。插入其中不影響載體的復(fù)制。（

2、4 4）分子量小，拷貝數(shù)多。易從宿主細(xì)胞中分離純化。）分子量小，拷貝數(shù)多。易從宿主細(xì)胞中分離純化。（5 5）符合生物安全要求）符合生物安全要求（3 3）有）有選擇性遺傳標(biāo)記選擇性遺傳標(biāo)記。 基因工程中常用的載體有基因工程中常用的載體有5類：類： 3. 載體載體 的種類的種類質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid）單鏈單鏈DNA噬菌體噬菌體M13 噬菌體的衍生物噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒（柯斯質(zhì)粒（cosmid）動(dòng)物病毒（動(dòng)物病毒（virus） 載體的功能：載體的功能：n運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞n為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力n為外源基因的擴(kuò)增或

3、表達(dá)提供必要的條件為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件第一節(jié)第一節(jié) 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（一、質(zhì)粒（plasmid）的基本特性）的基本特性是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀環(huán)狀DNA分子。一般為分子。一般為1-200kb。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。1 1、質(zhì)粒的復(fù)制、質(zhì)粒的復(fù)制oriRopRNA IRNA II-550RNase H400600大多數(shù)載體都帶大多數(shù)載體都帶有一個(gè)來(lái)源于有一個(gè)來(lái)源于pMB1pMB1質(zhì)粒或質(zhì)?；駽olE1ColE1質(zhì)粒的復(fù)質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)。制起點(diǎn)。2、質(zhì)粒的復(fù)制類

4、型、質(zhì)粒的復(fù)制類型1） 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent plasmid）拷貝數(shù)少拷貝數(shù)少，只有，只有15份拷貝。份拷貝。2） 松弛型質(zhì)粒（松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid）拷貝數(shù)多拷貝數(shù)多，有，有10幾百份拷貝。幾百份拷貝。（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型DNA polymerase III ）。）。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型DNA polymerase I ）。）。3、質(zhì)粒的不相容性、質(zhì)粒的不相容性 質(zhì)粒的不相容性( incompatibility)：兩個(gè)利用相同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒在同一個(gè)宿主

5、中不能共存的現(xiàn)象。在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：接合型質(zhì)粒接合型質(zhì)粒: :非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒能自我轉(zhuǎn)移能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移4 4 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性除了帶有自我除了帶有自我復(fù)制復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌控制細(xì)菌配對(duì)配對(duì)和質(zhì)粒和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移接合轉(zhuǎn)移的基因。的基因。如：如：F F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F F因子）：因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。不存在該質(zhì)粒的受體菌中。又叫又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒

6、。1. 1. 接合型質(zhì)粒：接合型質(zhì)粒：不符合基因工程的安全要求。不符合基因工程的安全要求。大腸桿菌接合（大腸桿菌接合（conjunction）2. 2. 非接合型質(zhì)粒：非接合型質(zhì)粒：帶有自我?guī)в凶晕覐?fù)制復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。（1 1）R R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）：質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）：帶有一種或數(shù)種帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（的抗生素抗性性狀（r resistancee

7、sistance）。）。符合基因工程的安全要求。符合基因工程的安全要求。帶有控制帶有控制大腸桿菌素（大腸桿菌素（colicin）合成的基因。合成的基因。（2）Col質(zhì)粒：質(zhì)粒：大腸桿菌素對(duì)不帶大腸桿菌素對(duì)不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。Col質(zhì)?；蛸|(zhì)?；騌質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒。為接合型質(zhì)粒。（1）分子量?。海┓肿恿啃。?質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1200 kb（2）編碼基因少：）編碼基因少：23個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。（3）環(huán)形狀：）環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNA。（酵母的（酵母的“殺傷質(zhì)粒殺傷

8、質(zhì)?！笔鞘荝NA）。）。如抗菌素抗性、毒素、代謝特征等，賦予細(xì)如抗菌素抗性、毒素、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）。菌一些額外的特性（非必須）。（4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型：）質(zhì)粒的空間構(gòu)型： 共價(jià)閉合環(huán)狀共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil）Covalent close circular DNA 線形線形DNA （ linear ，lDNA）一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。 開(kāi)環(huán)開(kāi)環(huán)DNA（ open circular， ocDNA）（5 5）質(zhì)粒空間構(gòu)型與電泳速率）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型

9、電泳遷同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：移率不同：scDNAscDNA最快、最快、l DNAl DNA次之、次之、ocDNAocDNA最慢。最慢。SCOCL二、標(biāo)記基因二、標(biāo)記基因 (marker gene)氨芐青霉素抗性（氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kanr）四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性 （Tetr）鏈霉素抗性鏈霉素抗性 （Strr）氯霉素抗性氯霉素抗性 （Cmlr）1 1、選擇標(biāo)記基因、選擇標(biāo)記基因絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記： 氨芐青霉素（氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。青霉素的衍生

10、物。通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)的細(xì)菌。a）抑菌原理）抑菌原理b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理Ampr基因編碼基因編碼 -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐，特異地切割氨芐青霉素的青霉素的 -內(nèi)酰胺環(huán)。內(nèi)酰胺環(huán)。b b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理a a）抑菌原理）抑菌原理通過(guò)于通過(guò)于30S30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)的細(xì)菌。TetTetr r 編碼特異性蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行編碼特異性蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，阻止四環(huán)素

11、通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。修飾，阻止四環(huán)素通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。通過(guò)與通過(guò)與50S50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死的合成并阻止肽鍵的形成。殺死。b b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理CmlCmlr r 編碼編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙?；?，特異地使氯霉素乙?；ㄐ纬陕让顾亓u已酰氧基衍生物）而失活。（形成氯霉素羥已酰氧基衍生物）而失活。a a）抑菌原理）抑菌原理通過(guò)與通過(guò)與70S70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNAmRNA發(fā)生錯(cuò)讀。發(fā)生錯(cuò)讀。殺死細(xì)菌殺死細(xì)菌。KanKanr r 編碼的編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶氨

12、基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。b b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理a a）殺菌原理）殺菌原理a）殺菌原理）殺菌原理通過(guò)與通過(guò)與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯(cuò)錯(cuò)譯。譯。殺死細(xì)菌殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理Strr 編碼一種編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)鏈霉素進(jìn)對(duì)鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結(jié)合作用。亞基結(jié)合作用。使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。Ampicillin 抗性抗性和和 lacZ的的 肽互補(bǔ)

13、肽互補(bǔ)（藍(lán)白（藍(lán)白斑）相結(jié)合。斑）相結(jié)合。-互補(bǔ)（互補(bǔ)（-complementation）藍(lán)白斑選擇原理：藍(lán)白斑選擇原理：1） X-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把無(wú)色的化合物能把無(wú)色的化合物Xgal分解成半分解成半乳糖和一個(gè)乳糖和一個(gè)深藍(lán)色深藍(lán)色的物質(zhì)的物質(zhì)5-溴溴-4-氯靛藍(lán)。氯靛藍(lán)。X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛藍(lán)氯靛藍(lán) -半乳糖苷酶半乳糖苷酶2） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶X-gal顯色反應(yīng)：顯色反應(yīng)：lacZlacZ的的 肽互補(bǔ)肽互補(bǔ)1 1） - -肽（肽（ lacZlacZ ）：）： -

14、 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端的一段氨基酸片段（端的一段氨基酸片段（11-4111-41氨基氨基酸）。酸）。lacZlacZ只有在只有在4 4聚體的狀態(tài)下才有功能聚體的狀態(tài)下才有功能. .C C端大部分端大部分N N端的端的11-41aa11-41aa受體菌基因組的受體菌基因組的 - -半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失氨基端有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4 4聚體的活性酶，不能分解聚體的活性酶，不能分解X-gal X-gal 受體菌株：受體菌株：JMJM系列系列、DH5DH5受體菌受體菌lacZlacZ突變（突變（lacZlacZM15M15）pUC質(zhì)粒載體上的

15、質(zhì)粒載體上的lacZ 編碼編碼 肽與這個(gè)缺失肽與這個(gè)缺失突變的突變的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互補(bǔ)互補(bǔ)”，使它能形成，使它能形成4聚體。又能分解聚體。又能分解X-gal。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ受體菌受體菌lacZ3）載體）載體lacZ與與 互補(bǔ)互補(bǔ)4） 互補(bǔ)的插入失活互補(bǔ)的插入失活 pUC載體上載體上LacZ的的5端有一段多克隆位點(diǎn)端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合成，但插入的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止外源基因就會(huì)阻止LacZ的合成。不能互補(bǔ)。的合成。不能互補(bǔ)。 lacZ53 肽肽互補(bǔ)互補(bǔ)M

16、CS 肽移碼突變肽移碼突變 lacZ53不互補(bǔ)不互補(bǔ)外源外源DNAIPTGIPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)laclac操縱子的操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使載體的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使載體的lacZlacZ 肽肽和受體菌基和受體菌基因組中的因組中的lacZ lacZ 的的C C端部分端部分都表達(dá)，從而互補(bǔ)。都表達(dá)，從而互補(bǔ)。但載體但載體MCSMCS上插入外源上插入外源DNADNA后，則不能產(chǎn)生后，則不能產(chǎn)生 肽！肽！IPTG通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有是否有DNADNA插入。插入。MCSMCS無(wú)插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。無(wú)插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。

17、MCSMCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。IPTGIPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：誘導(dǎo)的結(jié)果：無(wú)質(zhì)粒的無(wú)質(zhì)粒的受體菌受體菌 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解XgalXgal；無(wú)抗菌素抗性無(wú)抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)無(wú)菌斑無(wú)菌斑生長(zhǎng)生長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌的受體菌 - -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物缺失被載體產(chǎn)物 互補(bǔ)，能分解互補(bǔ)，能分解XgalXgal。且有抗菌。且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色有藍(lán)色菌斑生菌斑生長(zhǎng)長(zhǎng)帶外源帶外源

18、DNADNA插插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌的受體菌載體產(chǎn)物失活，載體產(chǎn)物失活，不能互補(bǔ)不能互補(bǔ) - -半半乳糖苷酶的缺乳糖苷酶的缺失。不能分解失。不能分解XgalXgal，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色有白色菌斑生菌斑生長(zhǎng)長(zhǎng) 插入失活（插入失活（insertational inactivation）插入失活，插入失活， pBR322具有雙抗菌素抗具有雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記，分兩次先后選擇：性選擇標(biāo)記，分兩次先后選擇：沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞

19、獲得載體的寄主細(xì)胞在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡（1 1）分子量大，拷貝數(shù)低）分子量大，拷貝數(shù)低1 1、 天然質(zhì)粒的局限性天然質(zhì)粒的局限性第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101pSC101，分，分子長(zhǎng)子長(zhǎng) 9.1 kb9.1 kb。只有一個(gè)。只有一個(gè)EcoR IEcoR I切點(diǎn)當(dāng)克隆位切點(diǎn)當(dāng)克隆位點(diǎn)。點(diǎn)。ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicin E1能殺死不含能

20、殺死不含ColE1 質(zhì)粒的菌，形成質(zhì)粒的菌，形成“噬菌噬菌斑斑” ）。唯一的克隆位點(diǎn)）。唯一的克隆位點(diǎn) EcoR I 正好位于這個(gè)正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。可以通過(guò)插入失活篩選。但細(xì)菌群基因的內(nèi)部?？梢酝ㄟ^(guò)插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗體容易自發(fā)突變出抗colicin E1的細(xì)胞的細(xì)胞.（2）篩選標(biāo)志不理想）篩選標(biāo)志不理想（1 1） 具有復(fù)制起點(diǎn)（具有復(fù)制起點(diǎn)（ORIORI）2 2、質(zhì)粒載體必須具備的基本條件、質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（2 2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（3 3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)MCSMCS）是

21、篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。菌素抗性基因。用來(lái)插入外源用來(lái)插入外源DNADNA片段。且插入后不影響復(fù)制片段。且插入后不影響復(fù)制功能。功能。（4 4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。第一階段（第一階段（1977年前）：年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如如pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322。第二階段：第二階段：增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pU

22、C系列載體。系列載體。第三階段：第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如的不同要求，如M13mp系列載體，含系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。 質(zhì)粒載體的發(fā)展：質(zhì)粒載體的發(fā)展：質(zhì)粒載體的命名質(zhì)粒載體的命名pBR322plasmid作者或?qū)嶒?yàn)室名稱作者或?qū)嶒?yàn)室名稱F.Bolivar, R.L.Rodriguez質(zhì)粒的編號(hào)質(zhì)粒的編號(hào)（1 1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1ColE1、pMB1pMB1派生質(zhì)粒。派生質(zhì)粒。在沒(méi)有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下

23、（蛋白質(zhì)合成在沒(méi)有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)抑制劑氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)細(xì)胞的拷貝數(shù)1000300010003000個(gè)！個(gè)！適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。因產(chǎn)物。（2 2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 但有特殊用途但有特殊用途: :由由pSC101pSC101派生來(lái)的載體特點(diǎn)：分子量小，拷貝數(shù)低。派生來(lái)的載體特點(diǎn)：分子量小，拷貝數(shù)低。當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過(guò)多時(shí)會(huì)嚴(yán)重地當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過(guò)多時(shí)會(huì)嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌死亡

24、時(shí)，影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。就需要低拷貝的載體。pLG338pLG338、pLG339pLG339、pHSG415pHSG415等等不適合大量擴(kuò)增不適合大量擴(kuò)增DNADNA用。用。（3 3）正選擇的質(zhì)粒載體）正選擇的質(zhì)粒載體如如pUC19pUC19、pET28apET28a等。等。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。Direct selection ve

25、ctorsDirect selection vectors（4 4） 克隆型質(zhì)粒載體克隆型質(zhì)粒載體主要用來(lái)擴(kuò)增和保存主要用來(lái)擴(kuò)增和保存DNADNA片段片段復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)Ori、選擇標(biāo)記、選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)MCS1）普通載體元件）普通載體元件 克隆載體的結(jié)構(gòu)克隆載體的結(jié)構(gòu)pBR322pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒（5 5） 表達(dá)型質(zhì)粒載體表達(dá)型質(zhì)粒載體主要用來(lái)使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。主要用來(lái)使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄翻譯信號(hào)控制之下。翻譯信號(hào)控制之

26、下。注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。止密碼的閱讀正確。強(qiáng)啟動(dòng)子及有利于分泌、分離純化的元件強(qiáng)啟動(dòng)子及有利于分泌、分離純化的元件復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)Ori、選擇標(biāo)記、選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因阻遏基因 I操縱基因操縱基因O啟動(dòng)基因啟動(dòng)基因P核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。1）普通載體元件）普通載體元件 表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)（6 6） 穿梭質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有人工構(gòu)建的、具

27、有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和和選擇標(biāo)記、可以在選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。Yeast復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)E.coli復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)E.coli選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記Yeast選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記MCS大腸桿菌大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體釀酒酵母穿梭載體大腸桿菌大腸桿菌動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體常用的穿梭質(zhì)粒載體常用的穿梭質(zhì)粒載體穿梭載體的優(yōu)點(diǎn)穿梭載體的優(yōu)點(diǎn) 也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）

28、進(jìn)行基因表達(dá)。 可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來(lái)回轉(zhuǎn)移基因。間來(lái)回轉(zhuǎn)移基因?？寺?、構(gòu)建克隆、構(gòu)建表達(dá)表達(dá)E.coliAnimal cell 利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)四、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體四、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體1. pSC101第一個(gè)成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)第一個(gè)成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。粒載體。（1）類型）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長(zhǎng)度）長(zhǎng)度9.09 kb。（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性Tetr6個(gè)克隆位點(diǎn)：個(gè)克隆位點(diǎn)：EcoR I、Xho I、Pvu I、H

29、ind III、BamH I、Sal I主要使用主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3個(gè)位于個(gè)位于選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）的內(nèi)部）（4）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)2. ColE1（1）類型）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長(zhǎng)度）長(zhǎng)度6.3 kb。（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（大腸桿菌素（colicin）E1和對(duì)和對(duì)E1免疫的基因免疫的基因（immE1）特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個(gè)細(xì)胞質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個(gè)細(xì)胞1000-3000拷貝之多！

30、拷貝之多！ colicin E1基因的結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 殺死不含有殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因細(xì)菌的原因cea + kil基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物 不被其他細(xì)菌的不被其他細(xì)菌的colicin E1所殺死的原因所殺死的原因imm基因基因EcoR I位于位于E1內(nèi)部，插入外源內(nèi)部，插入外源DNA會(huì)導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致致E1失活，使受體菌不能合成失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現(xiàn)出對(duì)），但仍然表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型免疫型（ImmE1+）。）。EcoR I（4）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)Colicin E1外源外源DNA無(wú)無(wú)Colicin用對(duì)外源用

31、對(duì)外源colicin E1的免疫性和自身不能合成的免疫性和自身不能合成colicin E1作選擇，操作非常繁雜。作選擇，操作非常繁雜。對(duì)對(duì)colicin E1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗抗colicin E1的頻率很高！的頻率很高?。?）ColE1的選擇缺陷的選擇缺陷ColE1抗抗 colicinE1殺殺ColE1- -仍抗仍抗 colicinE1不殺不殺ColE1- -插入片段插入片段ColE1pSP2124質(zhì)粒的質(zhì)粒的Ampr基因基因3. pBR322：（1）元件來(lái)源）元件來(lái)源F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體。人工構(gòu)建載體。 復(fù)

32、制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn) oripMB1系列（來(lái)源于系列（來(lái)源于ColE1）的的高拷貝高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)型復(fù)制起點(diǎn) Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因?；?。（2）長(zhǎng)度）長(zhǎng)度4361bp（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)其中其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Sal I 等）；等）；3個(gè)會(huì)導(dǎo)致個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（基因失活（Pst I、 PvuI 、 Sca I ）。）。24個(gè)。個(gè)。（5）pBR322的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) 雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記插入失活，先后分兩次選擇：

33、插入失活，先后分兩次選擇：沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞獲得載體的寄主細(xì)胞在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IBamH IAmpAmp中存活中存活但在但在TetTet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst IPst ITetTet中存活中存活但在但在AmpAmp中死亡中死亡氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)10003000copy10003000copy 安全安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mobmob（mobilizationmobilization）

34、。不能）。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移。通過(guò)接合轉(zhuǎn)移。 高拷貝數(shù)高拷貝數(shù) 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大載體越小越好。載體越小越好。10kb10kb的的DNADNA在純化過(guò)程中容易斷裂。在純化過(guò)程中容易斷裂。保留了轉(zhuǎn)移蛋白（保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的）的作用位點(diǎn)作用位點(diǎn)。（6）pBR322的缺點(diǎn)的缺點(diǎn)能夠被能夠被ColK質(zhì)粒編碼的質(zhì)粒編碼的mob蛋白識(shí)別，如蛋白識(shí)別，如果再有果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！ 刪除刪除mob識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn)（如質(zhì)粒（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：從從pBR322上切去上切去HaeII片斷，既除去了片斷，既除去了m

35、ob識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。（7）PBR322的改進(jìn)的改進(jìn)pBR325：在在pBR322位點(diǎn)上接入一段來(lái)自噬菌體位點(diǎn)上接入一段來(lái)自噬菌體PICm的的HaeII酶切片段（帶有氯霉素抗性基因酶切片段（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。）。cmlr上也帶一個(gè)上也帶一個(gè)EcoRI位點(diǎn)位點(diǎn)。使使EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn)。也成為插入失活型位點(diǎn)。 改造改造EcoR I 位點(diǎn)位點(diǎn)University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。而成。屬正選擇載體。

36、pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)pBR322的的 ori但其上失去了克隆位點(diǎn)。但其上失去了克隆位點(diǎn)。 Ampr 基因基因（1）元件來(lái)源）元件來(lái)源 lacZ的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子大腸桿菌大腸桿菌 lacZ基因基因大腸桿菌大腸桿菌lacZ的的 -肽鏈序列，肽鏈序列， 是是LacZ 的氨的氨基端片段。基端片段。pBR322的的Ampr基因基因（2）長(zhǎng)度）長(zhǎng)度2686 bp（3）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于點(diǎn)，位于lacZ基因的基因的5端。端。多克隆位點(diǎn)排列方向相反多克隆位點(diǎn)排列方向相反 更小的分子量

37、：更小的分子量：如如pUC18pUC18為為2682bp2682bp，pUC8pUC8為為2750bp2750bp。 選擇方便選擇方便X-galX-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇。顯色、抗菌素雙重直接選擇。 克隆便利克隆便利具有多克隆位點(diǎn)（具有多克隆位點(diǎn)（MCSMCS），使有兩個(gè)不），使有兩個(gè)不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNADNA方便地插入。方便地插入。 測(cè)序方便測(cè)序方便pUC的的MCS與與M13噬菌體載體的噬菌體載體的MCS完全相同，完全相同，便于把外源便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到M13載體上測(cè)序。載體上測(cè)序。pUC118、pUC119n由由pUC18pUC18、pUC19pUC19

38、改造而來(lái)；改造而來(lái)；n增加了增加了M13phage DNAM13phage DNA合成起始和終止及包合成起始和終止及包裝進(jìn)入噬菌體顆粒中必需的順式序列（裝進(jìn)入噬菌體顆粒中必需的順式序列（IGIG）n噬菌粒（噬菌粒（phagemidphagemid）5. pGEM-3Z/4Z由由pUC派生而來(lái)。派生而來(lái)。與與pUC的主要區(qū)別是在的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別加了一個(gè)的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體噬菌體啟動(dòng)子啟動(dòng)子T7和和SP6。2.74kbT7啟動(dòng)子啟動(dòng)子SP6啟動(dòng)子啟動(dòng)子MCSlacZAmprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄。聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄。 如果加入純化的如果加入純化的T7T7

39、或或SP6 RNASP6 RNA聚合酶，在聚合酶，在體外就可以轉(zhuǎn)錄體外就可以轉(zhuǎn)錄mRNAmRNA 外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。 MCS MCS與與pUC18pUC18的完全一樣。的完全一樣。與與pGEM-3ZpGEM-3Z相同，只是相同，只是T7T7啟動(dòng)子和啟動(dòng)子和SP6SP6啟啟動(dòng)子的動(dòng)子的位置互換位置互換。（1 1）pGEM-3ZpGEM-3Z的特點(diǎn)：的特點(diǎn)：（2 2）pGEM-4ZpGEM-4Z的特點(diǎn)：的特點(diǎn)：6. 多功能質(zhì)粒載體多功能質(zhì)粒載體 pBluescript II KS（）五、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性五、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性1. 1. 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)

40、條件：質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)條件：（1 1）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次（2 2）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過(guò)的質(zhì)粒必須分）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過(guò)的質(zhì)粒必須分 配到兩個(gè)子細(xì)胞中。配到兩個(gè)子細(xì)胞中。有主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種假說(shuō)。有主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種假說(shuō)。（1 1）主動(dòng)分配）主動(dòng)分配天然質(zhì)粒。天然質(zhì)粒。具有一個(gè)控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)具有一個(gè)控制質(zhì)粒拷貝分配的功能區(qū)（ParPar），能以主動(dòng)分配的方式確保質(zhì)粒能），能以主動(dòng)分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。正確分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了缺失了parpar區(qū)區(qū)，只，只能以隨

41、機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。人工質(zhì)粒。人工質(zhì)粒。（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）（2 2）隨機(jī)分配）隨機(jī)分配但在一定條件下會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。但在一定條件下會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。在寄主菌細(xì)胞分裂的過(guò)程中，有一個(gè)細(xì)胞沒(méi)在寄主菌細(xì)胞分裂的過(guò)程中，有一個(gè)細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)?？截悾⒆罱K繁殖成無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)有獲得質(zhì)?？截?，并最終繁殖成無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。勢(shì)群體。3. 分離的不穩(wěn)定性分離的不穩(wěn)定性 （segregation instability）4. 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性（structural instability）寄主基因組的寄主基

42、因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。ISdimer重組重組（1 1）新陳代謝負(fù)荷：）新陳代謝負(fù)荷：5. 5. 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素使寄主細(xì)胞生長(zhǎng)減緩：使寄主細(xì)胞生長(zhǎng)減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時(shí)間延長(zhǎng)約質(zhì)粒載體使寄主的世代時(shí)間延長(zhǎng)約15%15%。 復(fù)制負(fù)荷復(fù)制負(fù)荷減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。 轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會(huì)成為優(yōu)勢(shì)群體！丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會(huì)成為優(yōu)勢(shì)群體！每個(gè)菌體中所擁有的質(zhì)粒拷貝數(shù)不完每個(gè)菌體中所擁有的

43、質(zhì)?？截悢?shù)不完全相同，稱差度。全相同，稱差度。（2 2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。差度（差度（variancevariance）：）：是產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。是產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。野生型野生型E.coli中，質(zhì)粒在寄主的中，質(zhì)粒在寄主的重組酶重組酶作作用下會(huì)發(fā)生重組形成用下會(huì)發(fā)生重組形成二聚體質(zhì)粒二聚體質(zhì)粒。（3）寄主菌的重組體系）寄主菌的重組體系二聚體災(zāi)難（二聚體災(zāi)難（

44、dimer catastrophe）：）：含有大分子量插入片段的質(zhì)粒載體普遍含有大分子量插入片段的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。能形成質(zhì)粒寡聚體。二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。致質(zhì)粒失控。（1）長(zhǎng)度為）長(zhǎng)度為48502 bp；（2）雙鏈線性）雙鏈線性DNA；（3）但在兩端有）但在兩端有cos位點(diǎn)，可以環(huán)化。位點(diǎn)，可以環(huán)化。 DNA兩端各有兩端各有12bp的互補(bǔ)粘性末端（的互補(bǔ)粘性末端（5單鏈），單鏈），粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。位點(diǎn)。5GGGCGGCGACCT31. DNA分子的特點(diǎn)分子的特點(diǎn) cos位

45、點(diǎn)（位點(diǎn)（cohensive-end site）：）：一、一、 噬菌體的一般特性噬菌體的一般特性第二節(jié)第二節(jié) 噬菌體載體噬菌體載體 DNADNA進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀DNADNA復(fù)制型（復(fù)制型（RF DNARF DNA）。）。 DNADNA上有至少上有至少6161個(gè)基因，有一半是必須的，與自身的個(gè)基因，有一半是必須的，與自身的活動(dòng)有關(guān)，成簇排列?；顒?dòng)有關(guān)，成簇排列。其他約其他約1/31/3是是非必須基因（非必須基因（位于尾部合成至阻遏之間的位于尾部合成至阻遏之間的區(qū)段）。區(qū)段）。2. 2. 噬菌體的基因組特點(diǎn)噬菌體的基因組特點(diǎn) NulAJred gamat

46、t intN cl cro O P Q SR噬菌體噬菌體DNA包包裝和顆粒形成裝和顆粒形成編碼基因調(diào)節(jié)、溶編碼基因調(diào)節(jié)、溶原狀態(tài)的發(fā)生、維原狀態(tài)的發(fā)生、維持和遺傳重組等持和遺傳重組等包含噬菌體復(fù)包含噬菌體復(fù)制和溶菌的必制和溶菌的必需基因需基因 噬菌體感染細(xì)菌的早期：雙鏈進(jìn)行噬菌體感染細(xì)菌的早期：雙鏈進(jìn)行 型復(fù)制。型復(fù)制。3. 3. DNADNA的復(fù)制模型的復(fù)制模型（1 1） 型復(fù)制型復(fù)制（2 2）滾環(huán)復(fù)制）滾環(huán)復(fù)制 感染的晚期：?jiǎn)?dòng)滾環(huán)復(fù)制機(jī)制。感染的晚期：?jiǎn)?dòng)滾環(huán)復(fù)制機(jī)制。形成多聯(lián)體形成多聯(lián)體 DNADNA分子。分子。這種多聯(lián)體分子必須在這種多聯(lián)體分子必須在coscos位點(diǎn)被切斷成單位點(diǎn)被切

47、斷成單體分子才能被包裝起來(lái)。體分子才能被包裝起來(lái)。分為兩種：分為兩種：1. 溶菌周期：溶菌周期：二、噬菌體的生活周期二、噬菌體的生活周期感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。解體，釋放出大量子代噬菌體。烈性噬菌體（烈性噬菌體（virulent phage)2. 溶源周期：溶源周期：感染細(xì)菌后，將自己的感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過(guò)程稱為溶源化（中。形成這一過(guò)程稱為溶源化（lysogenizati

48、on)。整合到細(xì)菌染色體的噬菌體整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為稱為原噬菌體原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。溫和噬菌體（溫和噬菌體（temperate phage)原噬菌體（原噬菌體（prophage)：（1 1）構(gòu)建原理：）構(gòu)建原理：3. 3. 噬菌體載體的構(gòu)建噬菌體載體的構(gòu)建（2 2）構(gòu)建過(guò)程）構(gòu)建過(guò)程在這個(gè)非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點(diǎn)在這個(gè)非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點(diǎn)引進(jìn)某些突變表型，作為選擇標(biāo)記引進(jìn)某些突變表型，作為選擇標(biāo)記突變某些基因，使它成為安全載體突變某些基因，使它成為安全載體刪除刪除 DNADNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點(diǎn)必須區(qū)段上常用的限制酶切點(diǎn) 噬菌

49、體噬菌體DNADNA上本身有上本身有5 5個(gè)個(gè) EcoR I 和和7 個(gè)個(gè)Hind III切點(diǎn)！切點(diǎn)！在在 噬菌體的非必需區(qū)刪除非必需區(qū)或插入基因，留噬菌體的非必需區(qū)刪除非必需區(qū)或插入基因，留出插入空間。出插入空間。EcoR IBamH ISal ISal IBamH IEcoR IInterested gene 923 kbcentral region 14kbleft arm 20kb interested gene 9kb right arm 9kbleft arm 20kb interested gene 23kb right arm 9kb5GGGCGGCGACC3T3GGGCGGC

50、GACC5T 噬菌體載體的構(gòu)建過(guò)程噬菌體載體的構(gòu)建過(guò)程（3 3）人工構(gòu)建的）人工構(gòu)建的 噬菌體載體有兩種類型：噬菌體載體有兩種類型： 插入型載體（插入型載體（insertion vectors)：如如 gt10、 gt11、 BV2、 NM540、 NM1590、 NM6071）免疫功能失活型：）免疫功能失活型：插入位點(diǎn)位于載體合成活性插入位點(diǎn)位于載體合成活性阻遏物區(qū)域阻遏物區(qū)域（cI基因）內(nèi)?；颍﹥?nèi)。EcoR IcI gt10插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物，插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物，載體載體DNADNA不能進(jìn)不能進(jìn)入溶源期，受體菌全部裂解，形成入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。清晰

51、的噬菌斑。沒(méi)有外源沒(méi)有外源DNADNA插入的插入的 載體感染受體菌形成載體感染受體菌形成混濁噬菌混濁噬菌斑斑。如如 NM1149NM1149載體的兩個(gè)克隆位點(diǎn)（載體的兩個(gè)克隆位點(diǎn)（EcoRIEcoRI和和Hind Hind IIIIII）都是位于）都是位于cIcI基因內(nèi)部?；騼?nèi)部。2 2） - -半乳糖苷酶失活型載體：半乳糖苷酶失活型載體：在在 基因組中引入了基因組中引入了LacZLacZ序列。（其上含有一個(gè)序列。（其上含有一個(gè)EcoR I EcoR I 克隆位點(diǎn)）?？寺∥稽c(diǎn)）。感染感染LacZLacZ突變的大腸桿菌，經(jīng)突變的大腸桿菌，經(jīng)IPTGIPTG的誘導(dǎo)，利用的誘導(dǎo)，利用XgalXga

52、l的顯色反應(yīng)的顯色反應(yīng)作選擇標(biāo)記。作選擇標(biāo)記。LacZEcoR ICharon16A 替換型載體（替換型載體（substitution vectors)substitution vectors)兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)以反向重復(fù)形式分別位于兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)以反向重復(fù)形式分別位于 DNADNA的非必須區(qū)兩端。的非必須區(qū)兩端。用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來(lái)，與用同樣用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來(lái)，與用同樣酶切成的外源酶切成的外源DNADNA片段置換。片段置換。可置換區(qū)可置換區(qū)MCSMCSMCSMCS如：如： EMBL4EMBL4、Charon40Charon40等。等。1） EMBL4 EMBL4的可

53、置換片段內(nèi)部還有的可置換片段內(nèi)部還有Sal I酶切位點(diǎn)。酶切位點(diǎn)。以便于進(jìn)一步消化中間片段，防止自我連接。以便于進(jìn)一步消化中間片段，防止自我連接。左臂左臂可置換區(qū)可置換區(qū)右臂右臂EcoR IBamH ISal ISal IBamH IEcoR ISal ISal I EMBL42）Charon40Charon40的可置換片段是由的可置換片段是由DNA短片段重復(fù)構(gòu)成，短片段重復(fù)構(gòu)成，片段之間有片段之間有Hae I 切點(diǎn)切點(diǎn)。在克隆的時(shí)候，可以用在克隆的時(shí)候，可以用Hae I 酶進(jìn)一步將可置換片酶進(jìn)一步將可置換片斷切成小片段，以防止重新與載體連接。斷切成小片段，以防止重新與載體連接。左臂左臂可置換

54、區(qū)可置換區(qū)右臂右臂MCSMCSCharon40Hae I可取代片斷中如果包含可取代片斷中如果包含LacZ，可用，可用Xgal顯色顯色作篩選標(biāo)記。作篩選標(biāo)記。（4） 載體的篩選標(biāo)記載體的篩選標(biāo)記 插入型載體插入型載體根據(jù)插入所引起的表型突變。根據(jù)插入所引起的表型突變。 置換型載體置換型載體 DNA DNA象質(zhì)粒載體那樣直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌時(shí)效率遠(yuǎn)象質(zhì)粒載體那樣直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌時(shí)效率遠(yuǎn)比質(zhì)粒低。比質(zhì)粒低。4. 4. 載體的體外包裝載體的體外包裝 在試管中與在試管中與 噬菌體的噬菌體的頭部頭部和和尾部尾部蛋白人蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組菌，把重組DN

55、ADNA注入受體菌中。注入受體菌中。必須利用噬菌體外殼的作用！必須利用噬菌體外殼的作用！（1 1）體外包裝：）體外包裝： 的的D基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與 DNA 進(jìn)入頭部和頭部的成熟有關(guān)（只占進(jìn)入頭部和頭部的成熟有關(guān)（只占20%）。）。（2）體外包裝過(guò)程）體外包裝過(guò)程 噬菌體外殼蛋白的合成噬菌體外殼蛋白的合成E 基因基因的的E 基因編碼頭部蛋白的主要成分基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的（占頭部總蛋白的70%）。）。D基因基因重組的重組的 載體載體DNADNA外源的重組外源的重組 DNADNA載體被誘發(fā)與內(nèi)源性載體被誘發(fā)與內(nèi)源性原原 DNADNA

56、發(fā)生重組。發(fā)生重組。（3 3）體外包裝存在的問(wèn)題：）體外包裝存在的問(wèn)題： 包裝錯(cuò)誤：包裝錯(cuò)誤：既能包裝用于生產(chǎn)頭部蛋白的既能包裝用于生產(chǎn)頭部蛋白的內(nèi)源性原內(nèi)源性原 DNADNA，也能包裝，也能包裝重組的重組的 DNADNA載體載體。 重組：重組： 體外包裝的容量限制：體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的必須在正常野生型容量的75%105%75%105%（3651kb3651kb）之間。之間。既不能超過(guò)正常野生型容量的既不能超過(guò)正常野生型容量的5%5%；又不能低于正常野生型容量的又不能低于正常野生型容量的75%75%野生型野生型 DNADNA的必須區(qū)是的必須區(qū)是28kb28kb，所以，所以

57、 載體的最載體的最大克隆容量是大克隆容量是23kb23kb。（。（實(shí)際上為實(shí)際上為15kb15kb）。）。比一般的質(zhì)粒載體的容量大的多。比一般的質(zhì)粒載體的容量大的多。用在真核生物基因組或用在真核生物基因組或cDNAcDNA文庫(kù)的建立。文庫(kù)的建立。Sau3ABamHI5. 5. DNADNA載體的優(yōu)點(diǎn)載體的優(yōu)點(diǎn) 噬菌體感染細(xì)菌形成的噬菌斑噬菌體感染細(xì)菌形成的噬菌斑第三節(jié)第三節(jié) 單鏈?zhǔn)删w載體單鏈?zhǔn)删w載體單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNADNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：的絲狀大腸桿菌噬菌體：（2）復(fù)制型（）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀）是雙鏈環(huán)狀DNA。1. 1. 單鏈單鏈DNADNA噬菌體的特點(diǎn)噬菌體的特點(diǎn)（3）

58、RF DNA和和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)都能轉(zhuǎn)染感受態(tài) 大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。（5）可產(chǎn)生大量的含有外源）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片插入片 斷的斷的單鏈分子單鏈分子，便于作探針或測(cè)序。，便于作探針或測(cè)序。（1）+DNA。（。（ssDNA）（4）不存在包裝限制。）不存在包裝限制。1復(fù)制蛋白（基因復(fù)制蛋白（基因II, V, X）2形態(tài)發(fā)生蛋白（基因形態(tài)發(fā)生蛋白（基因I, IV, XI）3結(jié)構(gòu)蛋白（基因結(jié)構(gòu)蛋白（基因III,VI,VII,VIII,IX）基因組基因組DNA+鏈鏈M13噬菌體是絲狀的，只感染噬菌體是絲狀的，只感染雄性雄性大腸桿菌。大腸桿菌。但但M13 D

59、NA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。6407 bp。（2）DNA長(zhǎng)度長(zhǎng)度（3）DNA編碼蛋白編碼蛋白（1）寄主）寄主（4）DNA提純提純RF dsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。存在。成熟的噬菌體里只包裝有成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也容易，也容易提取。提取。（4）M13的生活周期的生活周期雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長(zhǎng)變慢，雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長(zhǎng)變慢，約為正常的約為正常的1/23/4）M13通過(guò)雄性細(xì)菌的通過(guò)雄性細(xì)菌的F性須性須注入其注入其+DNA+DNA合成合成DNA，形成，形成RF dsDNADNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄mRNA、

60、合成、合成+DNA、翻譯形成噬菌、翻譯形成噬菌體蛋白體蛋白組裝成新的噬菌體組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細(xì)胞擠出寄主細(xì)胞M13生活周期與生活周期與DNA復(fù)制復(fù)制基因基因5蛋白蛋白基因基因8蛋白蛋白+RFE. coli-+DNA-DNAmRNAM13外殼蛋白外殼蛋白組裝成子代組裝成子代M13+DNA注入大腸桿菌注入大腸桿菌復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯+DNA指導(dǎo)合成指導(dǎo)合成+DNA200個(gè)個(gè) RF DNA每個(gè)細(xì)胞可以放出約每個(gè)細(xì)胞可以放出約1000個(gè)個(gè)M13顆粒！顆粒！M13的包裝過(guò)程：的包裝過(guò)程：RF dsDNA指導(dǎo)合指導(dǎo)合成的成的+DNAM13基因基因V編碼單編碼單鏈鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白D