病毒宏基因組學PPT課件

1、病毒宏基因組學概述及其應用研究背景宏基因組學簡介病毒宏基因組學研究策略與技術路線研究成果與前景展望Here We Go！第1頁/共24頁2021-11-16一大難題virus Avirus Bvirus CBACTERIAvirus D在人類生產(chǎn)生活中，致病的微生物眾多，其中病毒性疾病占據(jù)大多數(shù)，而現(xiàn)有的診斷方法不可能囊括所有的病毒。因此，從宏觀上把握致病性病毒的潛在數(shù)量種類以及致病機理變得尤為重要。第2頁/共24頁2021-11-16案例1：Electron micrographs of the human fecal sample. (a) Rod-shaped particles neg

2、atively stained with potassium phosphotungstate in 2003. (b) Icosahedral (open arrows)and short rod-shaped particles (filled arrow) recently stained with ammonium molybdate, from the second fraction of the sucrose gradient. Scale bars = 50 nm.2013年6月巴西圣保羅阿道夫魯茨研究所的西爾瓦娜等人利用病毒宏基因組學對人面部潛在微生物進行研究。案例2：200

3、2年Breitbart應用鳥槍測序法（shotgun sequencing）首次對美國加州海岸的2處海洋中病毒群體進行研究，發(fā)現(xiàn)374-7114個潛在的新病毒。遺憾的是無法對其進行歸類。兩個案例第3頁/共24頁病毒宏基因組學何以橫空出世四大瓶頸很多病毒缺乏特異的細胞系或者生長過程中觀察不到細胞病變(CPE)。用電鏡來觀察病毒其靈敏性相對較低。血清學反應，高效的特異性抗體很難獲得，有的出現(xiàn)交叉反應而影響結果。PCR法必須基于基因序列，對于未知序列的病 毒和變異性大的病毒此法難以實施。第4頁/共24頁宏基因組學 宏基因組學研究的對象是特定環(huán)境下所有生物遺傳物質的總和，它包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微

4、生物的基因總和。研究熱點：細菌和病毒宏基因組學。宏基因組學(Metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個整體, 自上而下地研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關系。宏基因組學(Metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個整體, 自上而下地研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關系。第5頁/共24頁2021-11-16病毒宏基因組學病毒宏基因組學：宏基因組學的一分支，指研究特定環(huán)境中的病毒群落一門學科。應用解釋未知病因挖掘新的活性物質分析特定環(huán)境中的病毒群落發(fā)掘潛在的新的病毒性疾病第6頁/共24頁病毒宏基因組學 2005年,Edwards首次提到病毒宏基因組學這

5、一概念，其描述的是環(huán)境中的病毒群落噬菌體。 2007 年, Delwart 再次提到病毒宏基因組學這一概念,并對宏基因組學挖掘新病毒的方法進行了闡述； 該文側重于人和動物機體中的真核病毒群落。 最早應用宏基因組學理論分析病毒群落的科學家是Breitbart教授，他于2002年應用鳥槍測序法（shotgun sequencing）首次對美國加州海岸的2處海洋中病毒群體進行研究，發(fā)現(xiàn)374-7114個潛在的新病毒。 2006年，Zhang等應用宏基因組學在人的糞便中發(fā)現(xiàn)了大量的植物病毒。 2010 年，Li 等分析了蝙蝠糞便中的病毒群落。該研究發(fā)現(xiàn)了大量新的哺乳動物病毒和昆蟲病毒。第7頁/共24頁

6、2021-11-16研究策略與技術路線樣品的處理遺傳物質的分離與富集構建文庫宏基因組學文庫的篩選序列分析第8頁/共24頁2021-11-16研究策略與技術路線解凍稀釋離心過濾消化樣品的處理VIS:Very Important Step第9頁/共24頁2021-11-16研究策略與技術路線PCR 產(chǎn)物的純化PCR 擴增反轉錄 雙鏈 cDNA 合成DNARNA遺傳物質的分離與富集第10頁/共24頁2021-11-16研究策略與技術路線文庫的構建基因組文庫部分基因文庫基因組cDNA文庫：cDNA文庫中的外源DNA片段，是互補DNA。cDNA是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內的mRNA經(jīng)體外反

7、轉錄后形成的雙鏈cDNA ?；蚪MDNA文庫：將生物體的全部基因組用限制性內切酶或機械力量切割成一定長度的DNA片段，與合適載體體外轉化至宿主細胞所獲得的陽性菌落?；蛭膸欤耗硞€生物的基因組DNA或cDNA片段與適當?shù)妮d體在體外通過重組后，轉化至宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落(或噬菌體),所有的菌落或噬菌體的集合。第11頁/共24頁2021-11-16基因組文庫和部分基因文庫的關系文庫的構建第12頁/共24頁2021-11-16研究策略與技術路線文庫的構建根據(jù)宏基因組學文庫篩選方法和研究目的的不同，構建宏基因組學文庫的載體和方法也各有不同。構建的宏基因組學文庫分為載體克

8、隆文庫和基于新一代測序技術的加接頭的文庫。常用構建文庫的載體為：大片段插入載體細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC）和粘粒（coamid）載體、表達載體(pBluescript SK+)、穿梭載體(Cosmid pOS700)及普通克隆T載體。第13頁/共24頁2021-11-16研究策略與技術路線 載體的制備。 高純度大分子量基因組 DNA的提取。 高質量大相對分子質量 DNA 的部分酶切與脈沖電泳分級分離。 載體與外源片段的連接與轉化或侵染宿主細胞。 重組克隆的挑取和保存。 基因組 DNA 文庫的構建程序：連接轉化篩選陽性克隆第14頁/共2

9、4頁2021-11-16研究策略與技術路線連接目的基因載體載體的種類 可裝載的外源DNA質粒（plasmid） 10kb噬菌體（ phage） 0-23kb粘粒載體（cosmid） 45kb細菌人工染色體BAC 100kb酵母人工染色體YAC 300kb-1.2Mb 雖然載體種類眾多，但基于研究的目的基因大小以及相關文獻的報道，質粒載體和BAC的選用較為頻繁。第15頁/共24頁2021-11-16研究策略與技術路線宿主選擇-常用的宿主主要有大腸埃希菌以及鏈霉菌屬或假單胞菌屬。轉化宿主DH5 E. Coli陽性克隆的篩選涂布氨芐抗性平板37倒置培養(yǎng)菌液PCRAGE測序與序列分析：選取大小不等的片

10、段測序，分析測序的結果質量，將測序波峰良好的序列進行載體和引物的去除及拼接。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，應用blastn和blastx工具，分別進行核苷酸序列和6框架閱讀翻譯的氨基酸序列比對。第16頁/共24頁2021-11-16研究策略與技術路線基因組cDNA 文庫的構建： 第一，細胞總RNA的提取和mRNA分離；第二，第一鏈cDNA 合成；第三，第二鏈cDNA 合成；第四，雙鏈cDNA克隆進質?；蚴删w載體，并導入宿主中增殖。第17頁/共24頁2021-11-16總RNA Oligo(dt)纖維素柱或磁珠分離5AAAAOligo(dt)+reverse transcriptasemRNA5AAAA

11、DNA3TTTTRNase H5AAAADNA ploymeraseDAN ligase3TTTTTdT加尾5AAAA33TTTT55AAAACCCCCCCC5第一步：mRNA的分離。第二步：第一條cDNA鏈的合成。第三步：第二條cDNA鏈的合成。第四步：克隆雙鏈cDNA至載體并導入E.coli第18頁/共24頁2021-11-16研究策略與技術路線篩選宏基因組學文庫的技術功能性篩選法底物誘導基因表達法穩(wěn)定性同位素技術篩選法熒光原位雜交技術法能有效的篩選到具有活性的物質和新型抗生素。受限于表達型的宿主菌株、工作量大及效率低。直接測序法序列拼接-拼接的contigs或者單序列通過不同的數(shù)據(jù)庫進行

12、核苷酸和氨基酸的比對-篩選有用的目的信息。羅氏公司454焦磷酸測序技術和Illumina公司推出的Solexa測序技術高通量測序第19頁/共24頁2021-11-16研究成果與前景展望在我國腹瀉兒童糞便中首次發(fā)現(xiàn)HBoV2、HPeV、Aichi virus、Klassevirus/salivirus和Human cosavirus 等新發(fā)病毒（單同領，2011）。在美國豬群中發(fā)現(xiàn)了kubovirus,sapovirus,sapelvirus,豬腸道病毒9和豬腸道病毒10，星狀病毒，Teschovirus，PBoV3,環(huán)病毒，新的微小核酸RNA病毒等。其中星狀病毒和 PBoV3為新的種；環(huán)病毒、

13、Rosavirus1 和Rosavirus1 可能為的新的病毒屬或者新的病毒科（單同領，2011）。對患有腸道病毒性腸炎的火雞群，進行病毒宏基因組學分析，發(fā)現(xiàn)了大量的呼腸孤病毒、小病毒、星狀病毒等，系統(tǒng)描述了多種病毒共同感染火雞，導致火雞生產(chǎn)性能降低的可能性（Day，2010）。對采集北美的蝙蝠糞便進行病毒組學研究，結果發(fā)現(xiàn)蝙蝠體內攜帶的病毒種類十分豐富，不僅含有大量的動物病毒，而且還有植物和昆蟲病毒（Li，Donaldson，2010）。應用病毒宏基因組學技術結合高通量測序和生物信息學分析我國腹瀉仔豬糞便內的病毒群落，初步鑒定出此次腹瀉的主要病因為變異PEDV；分離和鑒定1 株變異PEDV（JS-2013），其可作為研發(fā)疫苗的候選毒株（單同領，童光志，2013）。第20頁/共24頁前景展望前景展望面臨的挑戰(zhàn) 運用病毒宏基因組學，已經(jīng)成功地從多種環(huán)境樣品中鑒定出多種病毒，使人們了解到不同環(huán)境的病毒構成，從而更科學地防制病毒的侵染。 描繪出一些中間宿主的病毒攜帶情況，這不僅豐富了病毒庫，而且增加了對病毒多樣性和分布的了解。 實時監(jiān)測一些致病性病毒和潛在致病性病