第2章基因工程PPT課件

1、基因工程的常規(guī)技術(shù)一、生物芯片1. 基因芯片2. 蛋白芯片二、基因文庫(kù)構(gòu)建1. 基因組文庫(kù)構(gòu)建2. cDNA文庫(kù)構(gòu)建三、酵母雙雜交系統(tǒng)1. 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理2. 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用四、DNA測(cè)序第1頁/共56頁一、生物芯片第2頁/共56頁生物芯片生物芯片：生物芯片是20世紀(jì)80年代，隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)行而誕生的一項(xiàng)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的技術(shù)。它是將細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA或其他生物組分，通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)點(diǎn)在一個(gè)小的固體芯片表面，以實(shí)現(xiàn)對(duì)它們的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)分析。其包括基因芯片、蛋白芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等。第3頁/共56頁“The use of bi

2、ochips in scientific research and drug discovery has become so widespread that its almost impossible now to imagine how we got along without them. ”第4頁/共56頁1. 基因芯片基因芯片，也稱為DNA芯片，DNA陣列（DNA array），就是在玻片、硅片和薄膜大呢感載體的基質(zhì)表面上有序地、高密度地排列、固定了大量的靶DNA片段或寡核苷酸片段。這些被固定的DNA分子在基質(zhì)上形成了高密度的DNA陣列，因此也叫基因微陣列（microarray）。橫跨：

3、生命科學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、微電子技術(shù)、光電技術(shù)、材料科學(xué)等現(xiàn)代高科技。第5頁/共56頁1. 基因芯片基因芯片根據(jù)固定在玻片上的DNA類型，可分為3種：cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因組芯片。樣品核酸分子經(jīng)過標(biāo)記（熒光或同位素）作為探針，與固定在載體上的DNA同時(shí)進(jìn)行雜交，雜交信號(hào)通過掃描儀輸入計(jì)算機(jī)，用特定的軟件分析雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，判斷分子的數(shù)量和與探針的同源性，進(jìn)而獲得樣品的序列信息而對(duì)基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模、高通量地研究。雜交屬于固-液雜交，高度集約化和平行處理。第6頁/共56頁1. 基因芯片基因芯片的圖象第7頁/共56頁6400點(diǎn)的基因芯片的圖象（12X14mm）1. 基因芯片第8

4、頁/共56頁1. 基因芯片基因芯片數(shù)據(jù)分析第9頁/共56頁（1）直接將核酸片段“點(diǎn)”至包被過的芯片表面做探針片段；（2）預(yù)先合成寡核苷酸，再將其固定至芯片表面作為探針片段；（3）原位合成寡核苷酸探針片段。1. 基因芯片基因芯片的制備方法第10頁/共56頁基因芯片點(diǎn)樣儀第11頁/共56頁運(yùn)用基因芯片技術(shù)研究腫瘤相關(guān)基因第12頁/共56頁基因芯片DNA分子的相互作用1. 基因芯片第13頁/共56頁1. 基因芯片基因芯片DNA分子的相互作用第14頁/共56頁2. 蛋白芯片蛋白芯片以蛋白質(zhì)代替DNA作為檢測(cè)對(duì)象，在基因表達(dá)研究中有著更加直接的應(yīng)用前景。將各種蛋白質(zhì)有序地固定于載玻片等各種介質(zhì)載體上成為

5、檢測(cè)的芯片，然后用標(biāo)記了有特定熒光的抗體與芯片作用，結(jié)合后熒光將指示對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)其其表達(dá)數(shù)量。必須通過一定的方法將蛋白質(zhì)固定在合適的載體上，同時(shí)能夠維持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。第15頁/共56頁Functional protein microarrays are consi-dered critical to progress in proteomics research. And, not surprisingly, academic and industrial researchers alike are expending considerable time and energy to com

6、e up with an operable system. Trends in Biotechnology2. 蛋白芯片第16頁/共56頁基因芯片和蛋白芯片第17頁/共56頁2. 蛋白芯片第18頁/共56頁二、基因文庫(kù)的構(gòu)建第19頁/共56頁1. 基因組文庫(kù)構(gòu)建基因庫(kù)與基因文庫(kù)第20頁/共56頁1. 基因組文庫(kù)構(gòu)建基因文庫(kù)構(gòu)建的基本戰(zhàn)略第21頁/共56頁1. 基因組文庫(kù)構(gòu)建基因文庫(kù)的完備性第22頁/共56頁1. 基因組文庫(kù)構(gòu)建基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第23頁/共56頁1. 基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組DNA的制備第24頁/共56頁1. 基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組DNA的切割第25頁/共56頁1. 基因組文庫(kù)構(gòu)建載

7、體和受體的選擇第26頁/共56頁2. cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA文庫(kù)：將生物某一組織細(xì)胞中的總 mRNA分離出來作為模板，在體外用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA，然后連接到合適的載體上，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后形成的所有克隆就叫cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)能否構(gòu)建成功的關(guān)鍵是高質(zhì)量的mRNA的獲得一個(gè)好的cDNA文庫(kù)的特征。包含有足夠大量的獨(dú)立克隆，代表最初的mRNA樣品中的所有轉(zhuǎn)錄本; 克隆中包含接近全長(zhǎng)的mRNA.第27頁/共56頁2. cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA第一鏈的合成第28頁/共56頁2. cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA第二鏈的合成之一第29頁/共56頁2. cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA第二鏈的合成

8、之二第30頁/共56頁2. cDNA文庫(kù)的構(gòu)建雙鏈平頭cDNA的克隆第31頁/共56頁2. cDNA文庫(kù)的構(gòu)建第32頁/共56頁三、酵母雙雜交系統(tǒng)第33頁/共56頁1. 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理酵母雙雜交系統(tǒng)是由Fields和song 在20世紀(jì)90年代建立起來研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)手段?；驹恚赫婧松锏霓D(zhuǎn)錄激活子一般是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上分開的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成，即一個(gè)DNA結(jié)合域（BD）和一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域（AD）。BD為識(shí)別位于靶基因上游的一個(gè)特定區(qū)段，并與之激活；AD則同其他成分結(jié)合來啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。一般情況下它們是同一種蛋白質(zhì)的兩個(gè)組成部分，是激活基因轉(zhuǎn)錄的必要條件，分開單獨(dú)

9、存在時(shí)仍具有其原來的功能，但不能其始轉(zhuǎn)錄。第34頁/共56頁1. 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理這個(gè)方法主要由4個(gè)部分組成：AD、BD、報(bào)告基因和誘惑基因組成。AD和BD可來自同一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，也可來自兩種不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的不同部分，但在體內(nèi)其他蛋白質(zhì)相互作用下都可以重新連接成轉(zhuǎn)錄因子，并具有轉(zhuǎn)錄功能，激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。常見的AD和BD來自于Gal4和LexA，下游報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物一般會(huì)引起熒光或顯色反應(yīng)，易于檢測(cè)。第35頁/共56頁1. 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理第36頁/共56頁1. 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理第37頁/共56頁1. 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理第38頁/共56頁1

10、. 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理兩種載體在構(gòu)建融合基因時(shí)，測(cè)試蛋白基因與結(jié)構(gòu)基因必須在閱讀框內(nèi)融合，融合基因的表達(dá)產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。Gal4-BD具有核定位信號(hào)；Gal4-AD無，故在其氨端或羧端克隆有來自SV40的T抗原一段序列作為核定位序列。常用的BD基因有：LexA和Gal4的BD編碼序列；常見的AD基因有：VP-16和Gal4。第39頁/共56頁2. 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用（1）鑒定已知蛋白質(zhì)之間是否相互作用將兩個(gè)待測(cè)蛋白的基因分別同BD或AD結(jié)構(gòu)域融合，共轉(zhuǎn)酵母后，如果兩個(gè)蛋白能相互作用，那么它們的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，從而啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。第40頁/共56

11、頁（2）篩選與已知蛋白質(zhì)相互作用的克隆從cDNA文庫(kù)中篩選編碼與已知靶蛋白特異作用的克隆，發(fā)現(xiàn)與已知蛋白相互作用的蛋白或提示其功能。利用酵母雙雜交系統(tǒng)，已經(jīng)從許多cDNA文庫(kù)中篩選出了很多編碼蛋白質(zhì)的新基因。2. 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用第41頁/共56頁2. 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用（3）用于藥物的篩選如利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了同人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Rb蛋白結(jié)合的肽類物質(zhì)。對(duì)于引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白質(zhì)相互作用可以采用藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。第42頁/共56頁2. 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用（4）鑒定不同突變子與靶蛋白的反應(yīng)能力許多P53蛋白突變后喪失了與SV40 T細(xì)胞的抗原結(jié)合

12、能力。其基因的改變與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，某些序列的變化會(huì)導(dǎo)致抑癌功能的完全喪失。第43頁/共56頁2. 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用（5）在細(xì)胞內(nèi)研究抗原和抗體的作用酶聯(lián)反應(yīng)和免疫沉淀技術(shù)是利用細(xì)胞外環(huán)境下抗原和抗體的免疫反應(yīng)研究抗原和抗體的相互作用，在細(xì)胞內(nèi)抗原和抗體的反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)。第44頁/共56頁3. 酵母雙雜交系統(tǒng)存在的問題（1）雙雜交分析蛋白相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白質(zhì)的相互作用依賴于翻譯后修飾如磷酸化和二硫鍵的形成等，而這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行；（2）有些蛋白本身具有轉(zhuǎn)錄激活作用，容易產(chǎn)生假陽性。第45頁/共56頁四、DNA測(cè)序第46頁/共56頁雙脫氧末端終止測(cè)序法的

13、基本原理1. Sanger雙脫氧鏈終止法第47頁/共56頁1. Sanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本操作第48頁/共56頁1. Sanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本反應(yīng)第49頁/共56頁2. Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法1977年，美國(guó)哈佛大學(xué)的Maxam和Gilbert發(fā)展出了一種以化學(xué)切割為基礎(chǔ)的DNA序列分析方法，稱為Maxam-Gilbert DNA序列分析法?；驹恚河锰厥獾幕瘜W(xué)試劑處理具有末端放射標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產(chǎn)生一組不同長(zhǎng)度的DNA片段，然后用電泳分離分析斷裂片段的大小，放射自顯影，讀膠確定DNA序列。第50頁/共56頁2. Ma