細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)PPT課件

1、細(xì)胞室1.準(zhǔn)備室：用于進(jìn)行培養(yǎng)器皿的清晰、包裝、培養(yǎng)物質(zhì)的準(zhǔn)備和消毒以及供應(yīng)物品的保藏等.2.緩沖間：為了減少將外界污染源頭帶入培養(yǎng)室3.培養(yǎng)室：是專門(mén)用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和各種無(wú)菌操作的實(shí)驗(yàn)室。其基本條件是：清潔、無(wú)菌、干燥、不通風(fēng)，并具有適宜的光線。第1頁(yè)/共43頁(yè)體外培養(yǎng)的設(shè)備和器具1.超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮保存罐、離心機(jī)、水純化裝置、高壓蒸汽消毒裝置、酶標(biāo)儀2.過(guò)濾除菌裝置、手術(shù)器械、培養(yǎng)器皿、移液器第2頁(yè)/共43頁(yè)超凈工作臺(tái) 利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過(guò)高效空氣微粒濾層凈化后，徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，在操作區(qū)形成無(wú)菌環(huán)境。按氣流方向的不同分為：1.外流式，2.側(cè)流式第3頁(yè)/共43

2、頁(yè)CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題： 使用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒。 箱內(nèi)滅菌蒸餾水3升，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。第4頁(yè)/共43頁(yè)自動(dòng)雙重純水蒸餾器第5頁(yè)/共43頁(yè)培養(yǎng)器皿1.一次性培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板：一般朔料培養(yǎng)器皿的細(xì)胞生長(zhǎng)面帶負(fù)電荷，有利于大多數(shù)表面帶正電荷的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)2.玻璃培養(yǎng)瓶、溶液瓶、移液管第6頁(yè)/共43頁(yè)常用玻璃器皿清洗1.浸泡：在5%稀鹽酸溶液中浸泡12h以上，以達(dá)到軟化器皿表面所附著物質(zhì)，并中和器皿表面的堿性物質(zhì)。2.刷洗：用軟毛毛刷將浸泡后的其面在洗滌

3、劑水中反復(fù)刷洗，以除去表面雜質(zhì)。3.浸酸：利用強(qiáng)氧化作用清除器皿表面可能殘留的有機(jī)物,時(shí)間在6小時(shí)以上最好過(guò)夜。4.沖洗：反復(fù)注滿水、倒空達(dá)20次以上。最后用二次水浸洗23次，烘干后包裝。第7頁(yè)/共43頁(yè)清潔液的配制第8頁(yè)/共43頁(yè)膠塞和塑料用品的清洗 先在水中浸泡，然后用2%NaOH溶液煮沸10分鐘，自來(lái)水沖洗晾干后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘，最后分別用自來(lái)水和三次水各沖洗3次，烘干備用。第9頁(yè)/共43頁(yè)過(guò)濾除菌裝置1.不銹鋼板式濾器：2.微孔濾膜濾器：有可換膜式濾器和一次性濾器兩大類(lèi)。第10頁(yè)/共43頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)的概念原代培養(yǎng)：就是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)皿中就不再分割，任其生長(zhǎng)繁

4、殖而不更換生長(zhǎng)器皿。它包括：細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)、細(xì)胞分裂繁殖，細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度逐漸減慢甚至停止，在這種情況下，都需要將培養(yǎng)物分割成小的培養(yǎng)。第11頁(yè)/共43頁(yè)原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代培養(yǎng)期衰退期第12頁(yè)/共43頁(yè)體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)類(lèi)型貼附生長(zhǎng)：必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見(jiàn)于各種實(shí)體瘤細(xì)胞。懸浮生長(zhǎng)：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見(jiàn)于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。第13頁(yè)/共43頁(yè)每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。貼壁期：細(xì)胞附著于底

5、物上，游離期結(jié)束潛伏期：此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)話動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。其機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性。第14頁(yè)/共43頁(yè)第15頁(yè)/共43頁(yè)第16頁(yè)/共43頁(yè)傳代的方法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種。1. 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000 r/min）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2. 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞） 此類(lèi)細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁

6、不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3. 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶第17頁(yè)/共43頁(yè)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法1. 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS溶液清洗2-3次。2. 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10 min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。3. 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4. 用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5. 吸取1/101/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。6. 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。7. 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第18頁(yè)/共43頁(yè)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條

7、件1. 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2. 細(xì)胞的生存環(huán)境溫度: 37 O2CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-pH: 7.2-7.4滲透壓 3 無(wú)污染 4 無(wú)毒第19頁(yè)/共43頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)用液 水：新鮮配置的三蒸水或去離子水 平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.00g KCl 0.20g Na2HPO4H2O 1.56g KH2PO4 0.20g 加水至1000 ml PH值調(diào)至7.2-7.4第20頁(yè)/共43頁(yè) 消化液1. 胰蛋白酶：主要用的是0.25胰蛋白酶液，胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制，過(guò)濾除菌。它作用于與賴

8、氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。用含血清培養(yǎng)液終止其消化作用。2. EDTA：是一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的解離作用。毒性小、價(jià)格便宜、使用方便。3.膠原酶溶液：又稱羧肽酶，有膠原酶、型及肝細(xì)胞專用膠原酶5種，可根據(jù)制備不同組織細(xì)胞懸液選擇不同類(lèi)型的膠原酶第21頁(yè)/共43頁(yè)培養(yǎng)基 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。第22頁(yè)/共43頁(yè)1. 天然培養(yǎng)基：有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限，成分復(fù)雜，影響對(duì)

9、某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物 的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，易發(fā)生支原體污染 。2. 合成培養(yǎng)基：是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定，成本低 。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）第23頁(yè)/共43頁(yè) 常用血清有： 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)： 透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。第24頁(yè)/共43頁(yè)血清中含有：1.多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）2.多種金屬離子；

10、 3.激素；4.促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。5.各種生長(zhǎng)因子6.轉(zhuǎn)移蛋白7.不明成分第25頁(yè)/共43頁(yè)一般說(shuō)來(lái)含5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10血清對(duì)于血清支持細(xì)因生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同時(shí)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞第26頁(yè)/共43頁(yè)血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情

11、、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30分鐘血清的消毒：過(guò)濾除菌第27頁(yè)/共43頁(yè)抗菌素的使用在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定第28頁(yè)/共43頁(yè)完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80 95血清 520HEPES、碳酸氫鈉 按培養(yǎng)基的類(lèi)型添加青、鏈霉素 各100單位毫升第29頁(yè)/共43頁(yè)RPMI-1640培養(yǎng)基的配制：RPMI-164

12、0培養(yǎng)粉 1袋碳酸氫鈉 2.2 gHEPES 2.385 g青、鏈霉素 各100單位毫升加三蒸水 至 1000ml, 過(guò)濾除菌。 調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4加血清（終濃度 10）第30頁(yè)/共43頁(yè)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 冷凍保存就是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至超低溫條件，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。 復(fù)蘇是一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物回復(fù)到常溫的過(guò)程。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融

13、，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。第31頁(yè)/共43頁(yè)慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在-25 以上時(shí)， 12 /min 當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時(shí)， 510 /min 當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中簡(jiǎn)易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。第32頁(yè)/共43頁(yè)低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍

14、結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。第33頁(yè)/共43頁(yè)細(xì)胞凍存方法1. 凍存液配制：含20%血清培養(yǎng)基,10% DMSO 2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉? 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1106 5 106細(xì)胞/ml)3. 加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。4. 年后，存活率可達(dá)80以上。DMSO液用培養(yǎng)液配好，5. 避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。對(duì)人造血干細(xì)胞的研究證第34頁(yè)/共43頁(yè)細(xì)胞復(fù)蘇方法1. 從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分鐘左右）。2. 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以

15、上。3. 低速離心10分鐘。4. 去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。第35頁(yè)/共43頁(yè)培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定 任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。 1. 細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)2. 臺(tái)盼藍(lán)法3. 四唑鹽（MTT）比色法第36頁(yè)/共43頁(yè)1. 細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)： 單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見(jiàn)的克隆?？寺⌒纬勺溆脕?lái)表示細(xì)胞的增殖能力。 克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)缺點(diǎn)：操作繁瑣優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠第37頁(yè)/共43頁(yè)2.臺(tái)盼藍(lán)法 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞第38頁(yè)/共43頁(yè)3. 四唑鹽（MTT）比色法 MTT名為噻唑藍(lán)，其原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的藍(lán)紫色產(chǎn)物量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值 MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感