熒光光度分析法測定維生素B2的含量

1、.熒光光度分析法測定維生素B2 的含量引言熒光分光光度法簡介有些物質(zhì)，當(dāng)用紫外光照射時(shí)， 它吸收某種波長之后還會發(fā)射出各種顏色和強(qiáng)度不同的光； 而當(dāng)紫外光停止照射后， 這種光線也隨之消失， 這種光線稱為熒光。熒光的波長比吸收的紫外光波長要長。由于物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同，所吸收的紫外光波長和發(fā)射的熒光波長也有所不同。利用物質(zhì)的這個(gè)特性，可以對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。同一種分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，用同一種波長的紫外光照射， 可發(fā)射相同波長的熒光； 若該物質(zhì)的濃度不同， 所發(fā)射的熒光強(qiáng)度也不同， 利用這個(gè)性質(zhì)可以對物質(zhì)進(jìn)行定量分析。 這種定量方法稱為熒光分析法， 簡稱熒光法。 測量熒光的儀器有濾光片熒光計(jì)， 濾光片單色

2、器熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)。熒光法的選擇性好，靈敏度比紫外- 可見分光光度法高 23 數(shù)量級，檢出限低，可以達(dá)到1012g m1，線性范圍寬?，F(xiàn)在主要應(yīng)用的是熒光分光光度計(jì)。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 學(xué)習(xí)熒光光度法測定維生素 B2 的含量的基本原理和方法。2. 熟悉熒光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)及使用方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】在經(jīng)過紫外光或波長較短的可見光照射后，一些物質(zhì)會發(fā)射出比入射光波長更長的熒光。在稀溶液中，熒光強(qiáng)度IF 與物質(zhì)的濃度 c 有以下關(guān)系：I F2.303 I 0 bc當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系：I FKc這種以測量熒光的強(qiáng)度和波長為基礎(chǔ)的分析方法叫做熒光光度分析法。熒光強(qiáng)度與激發(fā)

3、光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度，可成倍提高熒光強(qiáng)度。同時(shí)，提高儀器靈敏度， 可提高熒光光度法的靈敏度。而吸收光度法， 無論是提高激發(fā)光強(qiáng)度還是提高儀器靈敏度，入射光和出射光同時(shí)增大，其靈敏度不變。因此，熒光光度法比吸收光度法靈敏度高。1 / 4.VB2( 即核黃素 ) 在 430440nm 藍(lán)光照射下，發(fā)出綠色熒光，其峰值波長為535nm。VB2 的熒光強(qiáng)度在 pH67 時(shí)，在 pH=11時(shí)基本消失。維生素 B2（又叫核黃素， VB2 ）是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為：VB2 易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定， 光照易分解，對熱穩(wěn)定。維生素 B2 溶液在 430440

4、nm藍(lán)光的照射下， 發(fā)出綠色熒光， 熒光峰在 535 nm。維生素 B2 的熒光強(qiáng)度在 pH=6 7 時(shí)最強(qiáng)，在 pH=11的堿性溶液中熒光消失，所以可以用熒光光度法測定維生素 B2 的含量。維生素 B2 在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多，故測定維生素 B2 的熒光時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行?！緝x器與試劑】1. 儀器熒光光度計(jì)；容量瓶 (50 、1000mL)；吸量管 (5mL)；棕色試劑瓶；洗瓶2. 試劑VB2 對照品；市售 VB2 片； 1HAc溶液【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制(1) 10.0mg L VB2 標(biāo)準(zhǔn)溶

5、液的配制準(zhǔn)確稱取 10.0mgVB2，將其溶解于少量的1HAc溶液中，轉(zhuǎn)移至 1000mL容量瓶中，用 1HAc溶液稀釋至刻度，搖勻。該溶液應(yīng)裝于棕色試劑瓶中，置陰涼處保存。(2) 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制2 / 4.準(zhǔn)確移取 1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL 和 5.00mL 的標(biāo)準(zhǔn) VB2溶液，分別加入 5 個(gè)干凈的 50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。2. 待測樣品液的配制取市售 VB2 一片，用 1 HAc溶液溶解，定容成1000mL，貯存于棕色試劑瓶中，置陰涼處保存。3. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定開啟儀器，預(yù)熱。用蒸餾水作空白，合上樣品室蓋，接通電源，調(diào)讀數(shù)至“ 0”。

6、用標(biāo)準(zhǔn)溶液中最濃的溶液， 調(diào)節(jié)“滿度”旋鈕使其熒光讀數(shù)為滿刻度， 用此作為熒光測量的基準(zhǔn)；然后，從稀至濃的順序分別測量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。4. 未知試樣的測定取待測樣品液 2.50mL 置于 50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度， 搖勻。用與測定標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的條件， 測量待測樣品液的熒光強(qiáng)度， 平行測量其熒光強(qiáng)度3 次?！緮?shù)據(jù)記錄和結(jié)果處理】1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。2標(biāo)準(zhǔn)溶液蒸餾水2I （熒光強(qiáng)度）VBVB 濃度管號（mL）（mL）（mg/mL）1050021490.000232.0480.000443.0470.000654.0460.000865.0450.0012. 根據(jù)待測樣品液的熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得樣品液的濃度。樣品編號123平均值I （熒光強(qiáng)度）樣品液的濃度3. 計(jì)算藥片中 VB2 的含量： _ mg片?！咀⒁馐马?xiàng)】3 / 4.1. 在測量熒光強(qiáng)度時(shí)，最好用同一個(gè)熒光皿，以避免由于熒光皿之間的差異而引起的測量誤差。2. 取熒光皿時(shí)，手指拿住棱角出，切不可碰光