HPLC常見故障排除及維護(hù)

1、第一部分：色譜儀常見故障分析及排除色譜儀常見故障分析及排除lc-100液相系統(tǒng)示意圖友情提示：保持良好的色譜柱使用習(xí)慣友情提示：保持良好的色譜柱使用習(xí)慣l使用新鮮的水溶液，并考慮使用生物穩(wěn)定劑（如疊氮化鈉）l儲存色譜柱時，應(yīng)沖凈緩沖鹽，并用有機(jī)溶劑保護(hù)色譜柱（乙腈）l避免外力損傷色譜柱：彎曲、跌落或?qū)⒔宇^擰的過緊l完全潤濕在運輸中變干的色譜柱l對含有保留性較強(qiáng)的雜質(zhì)組分的樣品要進(jìn)行預(yù)處理l定期用強(qiáng)極性的溶劑清洗色譜柱l 清除柱填料的局限性l了解溶劑對樣品的溶解性及分離的影響l phl 溫度l 化學(xué)兼容性l在使用前過濾溶劑友情警示：友情警示：使用緩沖液的注意事項使用緩沖液的注意事項 緩沖液可以提

2、供離子平衡的反離子，并使流動相保持一定的離子緩沖液可以提供離子平衡的反離子，并使流動相保持一定的離子強(qiáng)度和強(qiáng)度和phph值，減少拖尾。但是使用緩沖液要注意幾點：值，減少拖尾。但是使用緩沖液要注意幾點： 1 1、避免使用鹽酸鹽，鹽酸鹽對鋼質(zhì)有腐蝕作用。、避免使用鹽酸鹽，鹽酸鹽對鋼質(zhì)有腐蝕作用。 2 2、緩沖液最好要現(xiàn)配現(xiàn)用，往往緩沖液是良好的菌類培養(yǎng)液，隔、緩沖液最好要現(xiàn)配現(xiàn)用，往往緩沖液是良好的菌類培養(yǎng)液，隔天或放置長時間實驗時會有很多怪現(xiàn)象發(fā)生。天或放置長時間實驗時會有很多怪現(xiàn)象發(fā)生。 3 3、實驗后不可用有機(jī)溶劑直接過度，有機(jī)溶劑會處使鹽類析出，、實驗后不可用有機(jī)溶劑直接過度，有機(jī)溶劑會處

3、使鹽類析出，造成液路或色譜柱堵塞，可用造成液路或色譜柱堵塞，可用9595：5 5的水甲醇沖洗。的水甲醇沖洗。 4 4、使用緩沖液要及時掌握、使用緩沖液要及時掌握phph范圍，做到胸中有數(shù)。范圍，做到胸中有數(shù)。 5 5、清洗液路和柱子時，有溫控可加熱到、清洗液路和柱子時，有溫控可加熱到3030攝氏度易于沖洗。攝氏度易于沖洗。 6 6、長時間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無析出，若有白色鹽類、長時間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無析出，若有白色鹽類析出，可考慮一定周期用析出，可考慮一定周期用10%10%硝酸沖洗一下液路（拆下柱子，走硝酸沖洗一下液路（拆下柱子，走30ml,30ml,再用再用5 5倍水沖

4、洗）可以避免液路的堵塞。倍水沖洗）可以避免液路的堵塞。 7 7、選擇緩沖液要用可靠的試劑，避免不純的鹽類造成不必要的麻、選擇緩沖液要用可靠的試劑，避免不純的鹽類造成不必要的麻煩。煩。lc-p100lc-p100高壓恒流泵高壓恒流泵泵 頭泵腔體吸入閥導(dǎo)通活塞向后運動泵 座寶石活塞桿密封圈排出閥關(guān)閉液流方向泵的工作原理：泵的工作原理： 吸液過程吸液過程泵 頭泵腔體吸入閥關(guān)閉活塞向前運動泵 座寶石活塞桿密封圈排出閥導(dǎo)通液流方向泵的工作原理：泵的工作原理： 排液過程排液過程柱塞桿密封圈出口單向閥進(jìn)口單向閥泵頭泵 頭吸入閥寶石吸入閥寶石球與球坐粘球與球坐粘連，吸入閥連，吸入閥不能導(dǎo)通不能導(dǎo)通活塞向后運動

5、泵 座排出閥關(guān)閉液流方向 泵吸液過程有故障情況：泵吸液過程有故障情況：吸入閥寶石球粘連吸入閥寶石球粘連泵腔體內(nèi)泵腔體內(nèi)沒有液體沒有液體流入流入寶石活塞桿密封圈排出閥導(dǎo)通泵 座寶石活塞桿密封圈吸入閥寶石吸入閥寶石球與球座之球與球座之間有雜質(zhì)，間有雜質(zhì)，液體反向泄液體反向泄漏漏液流方向 泵排液過程有故障情況：泵排液過程有故障情況：寶石球與球座之間有雜質(zhì)寶石球與球座之間有雜質(zhì)反向泄漏反向泄漏液流方向液流方向反向漏液方向反向漏液方向活塞向前運動寶石球?qū)毷虿荒芟虿荒芟蛏线\動上運動液流方向（正向）液流方向（正向）無液流流出無液流流出u 寶石球與球座粘連寶石球與球座粘連 不能向上運動不能向上運動u 使正向

6、流動的液流使正向流動的液流 寶石球與球坐粘連寶石球與球坐粘連 單向閥有故障情況：單向閥有故障情況：不能通過不能通過接觸面接觸面處有雜處有雜質(zhì)質(zhì)u 寶石球與球座之間寶石球與球座之間u 寶石球與球座不能寶石球與球座不能u 形成了液體的反向形成了液體的反向 寶石球與球座之間有雜質(zhì)寶石球與球座之間有雜質(zhì) 單向閥有故障情況：單向閥有故障情況：液流方向（反向）液流方向（反向）緊密接觸緊密接觸有雜質(zhì)有雜質(zhì)泄漏泄漏如何減少單向閥的故障如何減少單向閥的故障流動相一定要用流動相一定要用0.45m m的濾膜過濾。的濾膜過濾。 避免使泵長期不工作，使流動相干枯。避免使泵長期不工作，使流動相干枯。避免使用高粘度的流動相

7、。避免使用高粘度的流動相。使用帶緩沖鹽的流動相后，一定要充分清洗。使用帶緩沖鹽的流動相后，一定要充分清洗。定期對流動相過濾頭進(jìn)行清洗。定期對流動相過濾頭進(jìn)行清洗。 吸入單向閥故障的排除吸入單向閥故障的排除單向閥的故障現(xiàn)象，極大多數(shù)出現(xiàn)在吸單向閥的故障現(xiàn)象，極大多數(shù)出現(xiàn)在吸入單向閥上?？梢詫⑽雴蜗蜷y從泵頭入單向閥上?？梢詫⑽雴蜗蜷y從泵頭上拆下，接上專用針頭，用蒸餾水沖洗上拆下，接上專用針頭，用蒸餾水沖洗即可（沖水時注意手指要按住吸入閥頭即可（沖水時注意手指要按住吸入閥頭部白色墊圈，防止內(nèi)部零件沖出）。部白色墊圈，防止內(nèi)部零件沖出）。泵 頭吸入閥關(guān)閉泵 座寶石活塞桿密封圈排出閥導(dǎo)通液流方向液流

8、方向（壓力下降）（壓力下降） 密封圈泄漏產(chǎn)生的故障現(xiàn)象：密封圈泄漏產(chǎn)生的故障現(xiàn)象：密封圈與寶石桿之密封圈與寶石桿之間存在間隙，導(dǎo)致間存在間隙，導(dǎo)致漏液和壓力下降漏液和壓力下降泵腔體活塞向前運動如何減少密封圈的磨損如何減少密封圈的磨損要用優(yōu)質(zhì)的流動相。色譜柱的壓力不要太高。即不要使用受污染、老化的色譜柱。使用帶緩沖鹽的流動相后一定要用純水充分清洗。避免使用高粘度的流動相。避免在沒有流動相時運行泵（建議：在泵進(jìn)行檢測工作時設(shè)定最小壓力）。右泵頭左泵頭壓力傳感器廢液x詳情請參考rheodyne公司網(wǎng)站：www. 廢液輸出流動相輸入高壓恒流泵高壓恒流泵色譜柱高壓恒流輸出液晶顯示器鍵 盤主主 機(jī)機(jī) 板板

9、串行接口板usb接口rs232接口rs485接口樣品注入氘燈電源氘 燈透 鏡反光鏡組件流通池光敏二極管與前置放大器樣品輸出紫外檢測器紫外檢測器進(jìn)樣器定量環(huán)光 柵模擬信號輸出xx流通池體積流通池體積:8l 光程光程:8mm正品密封圈非正品密封圈第二部分：色譜柱常見故障診斷及維護(hù)1. 常見問題常見問題 基線噪音基線噪音可能的原因：可能的原因：流動池臟檢測器燈有問題如果是周期性的，則起源于泵的脈沖溫度對檢測器的影響氣泡經(jīng)過檢測器time (min.)基線漂移基線漂移 梯度洗脫 溫度不穩(wěn)定 (示差檢測器） 流動相中有污染物 柱中的流動相沒有平衡 體系中有污染物流出可能的原因：可能的原因：鬼鬼 峰峰 鬼

10、峰即使不進(jìn)樣也會出現(xiàn)的峰20% - 100% meoh沒有進(jìn)樣601530150371517問題1- 流動相臟問題2- 樣品過量(也可能是回收率太差)峰峰 型型雙 峰柱 塌 陷正 常 峰 雙 峰柱中有死體積 過濾片部分堵塞只有一個雙峰組分的共洗脫可能原因：可能原因：樣品與溶劑不匹配峰峰 型型所有的峰都展寬柱效降低柱死體積大進(jìn)樣量 / 質(zhì)量高粘度流動相 部分峰展寬 前次進(jìn)樣后流出的組分 大分子量樣品蛋白或聚合物 峰展寬樣品與流動相不匹配峰峰 型型拖尾峰對稱性 1.2normaltailingnormaltailing原因：原因：部分峰拖尾二次保留效應(yīng)殘留硅醇基的反應(yīng)小峰緊跟在大峰的后面流出柱頭有

11、污染金屬所有峰拖尾額外的柱效應(yīng)柱損壞不適當(dāng)?shù)臉悠妨?溶劑峰峰 型型正常峰伸舌峰前伸峰不對稱性 強(qiáng)有機(jī)溶劑) 通常最有效l低 ph 流動相, 如 0.1% tfa or 0.01m h3po4, 也是有效的l升高溫度（60-80）l6m鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白質(zhì)的沉積。lxdb, 有機(jī)聚合物等填料可使用高ph 水溶液 /有機(jī)溶液，如： 0.01m naoh 50% 異丙醇 /水溶液，硅膠基質(zhì)應(yīng)盡量減少接觸時間 (15-30 min)。色譜柱的修復(fù)和再生色譜柱的修復(fù)和再生 化學(xué)變化化學(xué)變化 -2example: 4.6 mm id x 15 cm zorbax 300sb-c1

12、8flow rate: 1 ml / min; temp: 80a: 0.1% tfa in water b: 0.1% tfa in acetonitrile100% a for 30 min.; 0-100% b over 30 min.; hold 100% b for 30 min., return to 100% a in 5 min.repeat 3 times. 總總 結(jié)結(jié) 如果使用時加以注意，大部分的液相色譜柱的問題是可以預(yù)防的- 流動相必須是互溶的，無顆粒- 使用保護(hù)柱和在線過濾器，并定期更換- 使用恰當(dāng)?shù)臉悠分苽浞椒? 使用恰當(dāng)?shù)纳V柱清洗程序- 不同類型的色譜柱，請選擇不

13、同的操作條件 (如： sb: ph 1-6, xdb: ph 3-11)- 保存柱反壓及重要的色譜參數(shù)的記錄 (如： r, n, as, k)- 色譜柱需保存在有機(jī)溶劑中 (乙腈)關(guān)于保留時間漂移的專題討論保留時間不重現(xiàn)保留時間不重現(xiàn)保留時間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：保留時間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：1、保留時間漂移：保留時間僅沿單方向發(fā)生、保留時間漂移：保留時間僅沿單方向發(fā)生變化。變化。2、保留時間波動：保留時間無固定規(guī)律的波、保留時間波動：保留時間無固定規(guī)律的波動。動。 保留時間不重現(xiàn)的原因分析保留時間不重現(xiàn)的原因分析將上述兩種情況區(qū)分開來對找到問題的原因?qū)⑸鲜鰞煞N情況區(qū)分開來對找到問題的原因

14、往往很有幫助。往往很有幫助。保留時間的漂移往往由柱老化引起；而柱老保留時間的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動?；豢赡芤鸨Ａ魰r間的無規(guī)律波動。事實上，保留時間漂移的多半原因是不同機(jī)事實上，保留時間漂移的多半原因是不同機(jī)理的色譜柱老化理的色譜柱老化，如固定相流失（例如通過，如固定相流失（例如通過水解），色譜柱污染（由樣品或流動相所致）水解），色譜柱污染（由樣品或流動相所致）等。等。 保留時間不重現(xiàn)的因素保留時間不重現(xiàn)的因素保留時間漂移的幾種最常見的原因如下：保留時間漂移的幾種最常見的原因如下：一一 、色譜柱的平衡、色譜柱的平衡二二 、固定相穩(wěn)定性、固定相穩(wěn)定性三三

15、、色譜柱污染、色譜柱污染四四 、流動相的組成、流動相的組成五五 、疏水坍塌、疏水坍塌保留時間不重現(xiàn)的因素與排除保留時間不重現(xiàn)的因素與排除 一、色譜柱的平衡一、色譜柱的平衡如果我們觀察到保留時間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱如果我們觀察到保留時間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10-20個個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑（如離子對試劑）則需要相當(dāng)長的時間來平衡色劑（如離子對試劑）則需要相當(dāng)長的時間來平衡色譜柱。譜柱。流動相污染也可能是原因之一。溶于流動相中的少流動相污染也可能是原因之

16、一。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。時間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動相成應(yīng)注意：水是很容易污染的流動相成分。分。保留時間不重現(xiàn)的因素與排除保留時間不重現(xiàn)的因素與排除 二二 、固定相穩(wěn)定性、固定相穩(wěn)定性固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的ph范范圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。例：硅膠基質(zhì)圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。例：硅膠基質(zhì)在在ph4時水解穩(wěn)定性最好。時水解穩(wěn)定性最好。水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能

17、團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定；長鏈鍵合相要比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合定；長鏈鍵合相要比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。如經(jīng)常清洗色譜柱會加速色譜柱固定相的水解。如經(jīng)常清洗色譜柱會加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。水解，如氨基鍵合相等。 保留時間不重現(xiàn)的因素與排除保留時間不重現(xiàn)的因素與排除 三三 、色譜柱污染、色譜柱污染保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。hplc色譜

18、柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動相本身，吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器、儀器密封墊以及樣品流動相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器、儀器密封墊以及樣品等。通常通過實驗可判斷污染的來源。等。通常通過實驗可判斷污染的來源。樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能是使保樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)。如：留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)。如：配藥中的賦形劑，生化樣品（如血清）中的蛋白及

19、類脂類配藥中的賦形劑，生化樣品（如血清）中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等?；衔?，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等。 保留時間不重現(xiàn)的因素與排除保留時間不重現(xiàn)的因素與排除通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其后會有反壓的增加?？梢酝ㄟ^使用固相其后會有反壓的增加?？梢酝ㄟ^使用固相提取（提?。╯pe）等樣品前處理方法來去除樣）等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響。品基質(zhì)的影響。避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然。然。

20、 保留時間不重現(xiàn)的因素與排除保留時間不重現(xiàn)的因素與排除相比之下，找到問題的所在并設(shè)計有效的清相比之下，找到問題的所在并設(shè)計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。如染物都可以在流動相中溶解。如thf可去除可去除反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在thf中就不能溶解。中就不能溶解。dmso常常用于去除反相色常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。譜柱中的蛋白。使用保護(hù)柱是個非常有效的方法。使用保護(hù)柱是個非常有效的方法。反沖色譜反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。柱僅是不得已時采用的辦法。 保留時間