考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定課件

1、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定紫菜可溶性蛋考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定紫菜可溶性蛋白含量白含量 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件提綱o前言o材料與方法o結(jié)果與分析o研究目的及意義考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件前言前言 1 紫菜的生物學(xué)特征紫菜的生物學(xué)特征 紫菜（Porphyra）屬于紅藻門(mén)（Rhodophyta）紅藻綱（Rhodophyceae）紅毛菜亞綱（Bangiophycidae）紅毛菜目（Bangiales）紅毛菜科（Bangiaceae）。目前報(bào)道的種類(lèi)約有130多種，廣泛分布在世界各地。東亞地區(qū)屬紫菜盛產(chǎn)區(qū)域，條斑紫菜（Porphyra yezoensis）是中、日、韓三國(guó)共同栽培品種，在我

2、國(guó)長(zhǎng)江以北廣泛栽培，而在長(zhǎng)江以南栽培的壇紫菜（P. haitanensis）屬我國(guó)特有。 條斑紫菜為北太平洋西部特有的種類(lèi)，自然界主要分布于我國(guó)東海北部和黃、渤海沿岸，以及日本列島和朝鮮半島沿岸。條斑紫菜藻體為葉片狀，葉形多為卵形或長(zhǎng)卵形，隨生長(zhǎng)環(huán)境有較大的變化。壇紫菜主要產(chǎn)于我國(guó)福建和浙江沿海，盛產(chǎn)于福建的平潭、莆田、惠安等縣，為我國(guó)特有的暖溫帶性種類(lèi)，藻體披針形、亞卵形或長(zhǎng)卵形。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件紫菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值紫菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值 紫菜（Porphyra）作為一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值巨大的栽培紅藻，以其營(yíng)養(yǎng)豐富、口感良好深受特別是東亞地區(qū)人民的喜愛(ài)。 紫菜中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、膳食纖維、

3、胡蘿卜素、維生素A、維生素B1、B2，維生素C、維生素B12和膽堿等多種有機(jī)物質(zhì)，同時(shí)還含有人體所需的Ca、P、Fe、Mg、I、Se、Zn和Mn等多種礦物質(zhì)。 劉興寬，郁建平(2008)在對(duì)沿海灘涂甘紫菜營(yíng)養(yǎng)成分分析中，檢測(cè)出15種游離氨基酸和16種水解氨基酸，必需氨基酸占游離氨基酸總量的2435，占水解氨基酸總量的39.81；維生素和微量元素種類(lèi)多、含量高，樣品中Vc含量為17.2mg100 g；微量元素中Na的含量最高為356.7 mg100 g，其次是Ca、Mg和K，Pb和Cu的含量遠(yuǎn)低于指標(biāo)值?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件o仲明等（2003）在對(duì)條斑紫菜不同采收期主要營(yíng)養(yǎng)成分變化情況中指

4、出條斑紫菜的鈣、鎂、鋅和碘含量較豐富，尤其是鈣和碘含量較多，鉛、鎘含量均低于食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。所含的維生素種類(lèi)多、含量高，明顯高于動(dòng)物性食品，胡蘿卜素、維生素E含量尤為突出。o蛋白質(zhì)的含量是衡量紫菜品質(zhì)優(yōu)劣的一項(xiàng)重要指標(biāo)。紫菜中的蛋白質(zhì)含量隨著藻的種類(lèi)及生長(zhǎng)時(shí)間、地點(diǎn)等而有所不同，通常蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)占紫菜干質(zhì)量的25%50% 。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件o牛建峰等（2006）利用 Bradford法，測(cè)得60恒溫干燥的帶形蜈蚣藻可溶性總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.33，帶形蜈蚣藻是紅藻門(mén)蜈蚣藻屬植物，其可溶性蛋白含量很少。o劉淑梅等（2009）對(duì)9份辣椒種子的可溶性蛋白含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明辣椒種子蛋白

5、含量為25.6529.22，遠(yuǎn)高于其他蔬菜類(lèi)作物的蛋白質(zhì)含量，辣椒種子蛋白質(zhì)含量是辣椒皮的20倍，辣椒種子蛋白質(zhì)僅低于大豆的蛋白含量(36.2349.26)。這表明辣椒種子具有較高的蛋白質(zhì)開(kāi)發(fā)價(jià)值。o粱月等（2010）通過(guò)對(duì)布澤烏區(qū)采集的不同品種漿果分析得出可溶性蛋白含量從22.3945.35，含量很高。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件蛋白質(zhì)的測(cè)定方法蛋白質(zhì)的測(cè)定方法o在許多蛋白質(zhì)研究的領(lǐng)域中，用一種快速準(zhǔn)確的方法來(lái)檢測(cè)蛋白濃度是必不可少的。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有多種，如凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、等電點(diǎn)沉淀法、考馬斯亮藍(lán)染色法等幾種方法，但就方法的準(zhǔn)確性和精密度以及應(yīng)用程度而言，國(guó)際經(jīng)典

6、測(cè)定方法凱氏定氮法為首選?，F(xiàn)在盡管有很多先進(jìn)的自動(dòng)或半自動(dòng)凱氏定氮儀，但這些儀器不僅價(jià)格昂貴，且需專(zhuān)門(mén)試劑，目前尚難普及21。一種新建立的考馬斯亮藍(lán)法在許多實(shí)驗(yàn)中已成為首選方法用來(lái)定量的檢測(cè)蛋白濃度?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件o凱氏定氮法凱氏定氮法 測(cè)定蛋白質(zhì)最常用的方法是凱氏定氮法。凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過(guò)程。在催化劑作用下,試樣用濃硫酸消煮破壞有機(jī)物,使其中的蛋白質(zhì)氮及其他有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮,然后與硫酸結(jié)合生成硫酸銨,加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾使氨逸出,用硼酸吸收后,再用酸滴定,測(cè)出含氮量,將結(jié)果乘以換算系數(shù),計(jì)算出粗蛋白質(zhì)含量。然而該方法存在消化時(shí)間太長(zhǎng),會(huì)產(chǎn)生有毒有害

7、該方法存在消化時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生有毒有害氣體，因此必須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行的弊端。宗留香等人對(duì)這一傳統(tǒng)方法進(jìn)行了改進(jìn)，即用Se 粉作催化劑進(jìn)行消化，不用通風(fēng)櫥，即實(shí)現(xiàn)了環(huán)保消化，并提高了消化效率?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件o考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法 考馬斯亮藍(lán)G一250測(cè)定蛋白質(zhì)含量原理是屬于染料結(jié)合法的一種，存在紅色與藍(lán)色兩種不同的顏色形式。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合時(shí)變?yōu)樗{(lán)色。考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而且穩(wěn)定，反應(yīng)2 min 左右即達(dá)到平衡，其結(jié)合物可在室溫下1 h內(nèi)保持穩(wěn)定?？捡R斯亮藍(lán)G- 250 法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，其最低蛋白質(zhì)

8、檢測(cè)量可達(dá)1g，比Lowry法的靈敏度高約4 倍，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì) 染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry 法要大得多。該法方法簡(jiǎn)便，易于操作，所用試劑較少，顯色劑易于配制；干擾物質(zhì)少，如糖、緩沖液還原劑和絡(luò)合劑等均不影響顯色?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件結(jié)果與分析結(jié)果與分析o2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制測(cè)定波長(zhǎng)的選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取160ug/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液用LAMBDA 25 紫外/可見(jiàn)光光度計(jì)450750 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描 ,由掃描曲線可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的最大吸收波長(zhǎng)為 595 nm,，故本法選擇的測(cè)定波長(zhǎng)

9、為595nm。圖圖1 最大吸收峰的測(cè)定最大吸收峰的測(cè)定Fig.1 Analysia of the proper absorbing4505005506006507007500.00.20.40.60.81.0A595nm考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件2.2 顯色穩(wěn)定性考察顯色穩(wěn)定性考察 取1ml 200ug/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)加入5 ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻，放置 3 min 后倒入比色皿，在 595 nm 處，每隔30s 測(cè)定其吸收度，測(cè)定結(jié)果如下圖所示： 圖圖2 穩(wěn)定性考察穩(wěn)定性考察Fig.2 Investigation on the stability0123456780.00.20.

10、40.60.81.01.21.4A595m in考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件o陸建良等(2002)的研究表明，蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250 結(jié)合后，在25min即呈最大光吸收，至少穩(wěn)定1h。我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合，即使在5min 到20min后，在595nm處的光吸收值也不是很穩(wěn)定，總是在一定幅度內(nèi)擺動(dòng)，如果儀器的靈敏度高，這種擺動(dòng)誤差就更大。為了減少試驗(yàn)誤差，應(yīng)將儀器的狹縫調(diào)大些，以降低靈敏度，增加穩(wěn)定性。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件 2.3 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制圖圖3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 3 The standard curve of

11、the proteins 一月一月 二月二月040801201602000.20.40.60.81.01.2y=0.0049x+0.1398,r=0.9993A595蛋 白含量(ug)040801201602000.20.40.60.81.01.2y=0.005x+0.1262, r=0.9994A595蛋 白含量（ ug）考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件 三月 四月040801201602000.20.40.60.81.01.2y=0.0049x+0.1464,r=0.9993A595蛋 白 含量（ ug）040801201602000.20.40.60.81.01.2y=0.0048x+0.17

12、74,r=0.9992A595蛋 白 含量（ ug）考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件o1，2，3，4月采集樣品蛋白測(cè)定的回歸方程分別為：y = 0.0049x + 0.1398，r = 0.0093；y = 0.005x + 0.1262，r = 0.9994；y = 0.0049x + 0.1464，r=0.9993；y = 0.0048x + 0.2774，r=0.9992。各次測(cè)定的蛋白回歸方程式相關(guān)系數(shù)r在0.99920.9994之間，蛋白含量與595nm處吸光值線性關(guān)系良好?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件2.4不同紫菜可溶性蛋白含量隨生長(zhǎng)時(shí)期不同而變化不同紫菜可溶性蛋白含量隨生長(zhǎng)時(shí)期不同而變化

13、 圖圖4 不同紫菜中蛋白含量不同紫菜中蛋白含量Fig.4. The dissolvable protein contents of different Porphyramg/gSTDEV1月2月3月4月1月2月3月4月對(duì)照241.734.29 247.31 231.69 219.35 3.76 2.12 3.35 Y-L0601220.92 231.67 187.50 154.56 4.58 2.88 3.62 7.70 Y-L0602205.00 227.36 175.30 148.62 4.62 4.87 3.14 1.50 Y-06DO206.21 230.51 185.34 170.2

14、0 7.01 4.01 6.39 3.77 Y-gr282.37 290.77 208.96 192.93 12.54 5.90 5.18 1.80 壇紫菜190.60 194.91 172.72 142.11 3.23 2.41 2.75 4.43 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件o一月Y-gr組測(cè)得的蛋白含量最高，為282.37 + 12.54；對(duì)照組測(cè)得的蛋白含量為241.73 + 4.29，居第二；其次是Y-L0601含量為220.92 + 4.58；Y-06DO含量為206.21 + 4.01；Y-L0602含量為205.00 + 4.62；最低的是壇紫菜含量為190.60 + 3.23。

15、o二月所有組的蛋白含量同一三四月比都是最高的，蛋白質(zhì)的含量是衡量紫菜品質(zhì)優(yōu)劣的一項(xiàng)重要指標(biāo)，所以一二三四月中二月可能是采收的最好季節(jié)?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件o三月蛋白含量和二月相比普遍下降，下降最明顯的是Y-gr，從二月的290.77 + 5.90 mg/g下降到三月的208.96 + 5.18 mg/g；其次為Y-L0602從二月的227.36 + 4.87 mg/g下降到三月的175.30 + 3.14 mg/g；最低的是對(duì)照組從二月的247.13 + 3.76下降到三月的231.69 + 2.12 mg/g。o四月采集的各樣品中蛋白含量是各生長(zhǎng)時(shí)期最低的，各紫菜樣品中含量存在較大差異

16、。對(duì)照組蛋白含量最高，壇紫菜最低。蛋白含量從高到低順序?yàn)椋簩?duì)照 Y-gr Y-06DO Y-L0601 Y-L0602 壇紫菜?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件圖圖5 紫菜中蛋白含量隨生長(zhǎng)時(shí)間的變化紫菜中蛋白含量隨生長(zhǎng)時(shí)間的變化Fig.5 The dissolvable protein contents of different stage of Porphyra對(duì) 照 Y-L0601 Y-L0602Y-06DOY-gr 壇 紫菜050100150200250300含量（ mg/g） 1月 2月 3月 4月考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件o一月二月，Y-gr樣品的蛋白含量高于其他5個(gè)組，三月四月僅次于對(duì)照

17、組。壇紫菜的蛋白含量始終最低。蛋白含量隨生長(zhǎng)時(shí)間的變化呈明顯的規(guī)律，1，2月采集樣品中蛋白含量較高，隨后其蛋白含量均出現(xiàn)一定程度的下降。Y-gr下降程度最高，下降了28.13%，其次為Y-L0602下降了 22.90%，接著是Y-06DO下降了19.60%，Y-L0601下降了19.07%，壇紫菜下降了11.38%，最低的是對(duì)照組下降了6.32%?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件o以上結(jié)果均說(shuō)明，紫菜中可溶性蛋白含量不僅與藻的種類(lèi)及其品系密切相關(guān)，而且同一紫菜蛋白含量隨生長(zhǎng)時(shí)期的變化有所差異。姚興存等（2002）對(duì)連云港沿海條斑紫菜一般營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了測(cè)定及研究與分析了隨季節(jié)變化的規(guī)律，結(jié)果表明幾種營(yíng)

18、養(yǎng)成分中，含量變動(dòng)最為明顯的是蛋白質(zhì)和碳水化合物，二者之間呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。在紫菜生長(zhǎng)的前期蛋白質(zhì)含量高，之后隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸減少，而碳水化合物則恰恰相反。分析原因是由于處在生長(zhǎng)初期的紫菜細(xì)胞不斷地進(jìn)行分裂，以蛋白質(zhì)為中心的代謝十分旺盛。相反到了生長(zhǎng)末期，細(xì)胞分裂能力下降，碳水化合物的代謝變得旺盛，使得細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙物質(zhì)增厚增多起來(lái)。由此，生長(zhǎng)初期的紫菜加工出來(lái)的紫菜制品，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，色、香、味也達(dá)到較高水平，生長(zhǎng)末期的加工產(chǎn)品則品質(zhì)出現(xiàn)一定程度的下降?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定PPT課件o目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有多種 , 如凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、等電點(diǎn)沉淀法、考馬斯亮藍(lán)染色法等幾種方法 , 但就方法的準(zhǔn)確性和