第三章酶化學(xué)

1、酶化學(xué)一、酶的化學(xué)本質(zhì)、組成及結(jié)構(gòu)一、酶的化學(xué)本質(zhì)、組成及結(jié)構(gòu)二、酶催化作用的特點(diǎn)二、酶催化作用的特點(diǎn) 酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的，具有催化生酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的，具有催化生物反應(yīng)功能的蛋白質(zhì)大分子及核酸。物反應(yīng)功能的蛋白質(zhì)大分子及核酸。 1、大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)：基本單位氨基酸基本單位氨基酸 化學(xué)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)；化學(xué)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)；理化性質(zhì)理化性質(zhì):兩性性質(zhì)；膠體性質(zhì)；兩性性質(zhì)；膠體性質(zhì)；變性失活；可被蛋白酶分解；具有蛋白質(zhì)的顯色應(yīng)。變性失活；可被蛋白酶分解；具有蛋白質(zhì)的顯色應(yīng)。2、某些某些RNA具有催化活性具有催化活性,將本質(zhì)為將本質(zhì)為RNA 的酶稱的酶稱核酶（核酶（ribozymes)。（

2、1）、單純酶）、單純酶（簡單蛋白質(zhì)）：（簡單蛋白質(zhì)）： 其活性僅取決于其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。其活性僅取決于其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 如：胃蛋白酶、淀粉酶等。如：胃蛋白酶、淀粉酶等。 輔助因子輔助因子(cofacter)：熱穩(wěn)定的非蛋白小分熱穩(wěn)定的非蛋白小分子。子。l按分子組成：按分子組成： 金屬離子金屬離子：Mg2+、Mn2+ 小分子有機(jī)物小分子有機(jī)物：NAD + 、NADP + 各種維生素各種維生素輔酶輔酶(coenzyme): 結(jié)合較結(jié)合較松松，可透析去除可透析去除； 輔基輔基(prosthetic grup)： 結(jié)合較結(jié)合較緊緊，透析不易除去透析不易除去。酶蛋白酶蛋白負(fù)責(zé)專一性；負(fù)責(zé)專一性；輔助因子輔助因

3、子負(fù)責(zé)電子、原子或基團(tuán)轉(zhuǎn)移。負(fù)責(zé)電子、原子或基團(tuán)轉(zhuǎn)移。 同一輔因子可與多種不同酶蛋白結(jié)同一輔因子可與多種不同酶蛋白結(jié)合，顯示不同催化活性。合，顯示不同催化活性。與一般化學(xué)催化劑相比，與一般化學(xué)催化劑相比，其共性有其共性有：1、酶易失活、酶易失活2、催化效率高；、催化效率高；3、酶的催化具有高度的專一性、酶的催化具有高度的專一性l凡使凡使pr變性的因素都可使酶破壞變性的因素都可使酶破壞,l酶在溫和條件下作用。酶在溫和條件下作用。 l通常要高出非生物催化劑催化活性的通常要高出非生物催化劑催化活性的1061013倍。倍。2H2O22H2O + O21mol過氧化氫酶過氧化氫酶 5106molH2O2

4、1molFe+2 610-4molH2O2l 一種酶只能催化一種酶只能催化一種一種或或一類一類十分相似的反應(yīng)。十分相似的反應(yīng)。l底物（底物（substrate ，S)：酶作用的物質(zhì)：酶作用的物質(zhì)。l絕對專一性絕對專一性：只作用：只作用一種一種底物。底物。l相對專一性相對專一性：作用于：作用于一類一類底物。底物。酶的專一性酶的專一性：一種酶僅能作用于一種：一種酶僅能作用于一種底物，或一類分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，底物，或一類分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，并催化某種類型的反應(yīng)。這種特性并催化某種類型的反應(yīng)。這種特性稱為酶的專一性，又叫做酶的特異稱為酶的專一性，又叫做酶的特異性或選擇性。性或選擇性。酶作用的酶作用的

5、專一性專一性非立體化學(xué)非立體化學(xué)專一性專一性立體化學(xué)專一性立體化學(xué)專一性基團(tuán)和鍵的專一性基團(tuán)和鍵的專一性絕對專一性絕對專一性族族（基團(tuán)）（基團(tuán)）專一性：可作用于一類或一些結(jié)構(gòu)很相似專一性：可作用于一類或一些結(jié)構(gòu)很相似的底物。的底物。RCOO- +R OH + H+酯酶酯酶：RCOR + H2OOOCH2OHOHOHOH15-葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶O R+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ ROH絕對專一性：只能作用于某一底物。絕對專一性：只能作用于某一底物。脲酶脲酶：H2NCNH2 + H2OO2NH3 + CO2胰蛋白酶的基團(tuán)專一性胰蛋白酶的基團(tuán)專一性l酶只能催化一種立體異構(gòu)體發(fā)生某種化

6、酶只能催化一種立體異構(gòu)體發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng)，而對另一種立體異構(gòu)體則無作學(xué)反應(yīng)，而對另一種立體異構(gòu)體則無作用。用。（一）（一）鎖鑰學(xué)說鎖鑰學(xué)說：1894年年E.Fischer 提出：提出：S分子或分子或其一部分像鑰匙其一部分像鑰匙一樣楔入一樣楔入E活性活性中心部位。中心部位。 此學(xué)說強(qiáng)調(diào)此學(xué)說強(qiáng)調(diào)E與與S結(jié)構(gòu)互相吻合結(jié)構(gòu)互相吻合(剛性模板剛性模板)。1958年年Koshland 提提出：當(dāng)出：當(dāng)E與與S接近時(shí)，接近時(shí)，E蛋白受蛋白受S分子的誘分子的誘導(dǎo)，其構(gòu)象發(fā)生有導(dǎo)，其構(gòu)象發(fā)生有利于利于S結(jié)合的變化結(jié)合的變化，E與與S在此基礎(chǔ)上互在此基礎(chǔ)上互補(bǔ)契合、進(jìn)行反應(yīng)。補(bǔ)契合、進(jìn)行反應(yīng)。（一）（一）酶的活

7、性中心酶的活性中心概念：概念：活性中心：活性中心：酶分子中能同底物結(jié)合并起催化作用酶分子中能同底物結(jié)合并起催化作用的空間部位。的空間部位。羧肽酶的活性中心羧肽酶的活性中心l實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)：酶蛋白經(jīng)酶蛋白經(jīng)水解切去部分肽水解切去部分肽鏈后，殘留部分鏈后，殘留部分仍有活性。仍有活性。l說明：說明：參與催化參與催化反應(yīng)的只是其中反應(yīng)的只是其中一小部分，即一小部分，即活活性中心。性中心?；钚灾行募疵阜肿踊钚灾行募疵阜肿又性谌S結(jié)構(gòu)上中在三維結(jié)構(gòu)上相互靠近的幾個(gè)相互靠近的幾個(gè)aa殘基或其上的殘基或其上的某些基團(tuán)。某些基團(tuán)?；钚灾行囊酝獾牟炕钚灾行囊酝獾牟糠謱γ复呋我謱γ复呋我珜钚灾行男蔚珜钚灾行?/p>

8、形成提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。成提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。胰凝乳蛋白酶的活性中心胰凝乳蛋白酶的活性中心1、僅為酶體積的很小部分；、僅為酶體積的很小部分；2、具有一定的空間構(gòu)象；、具有一定的空間構(gòu)象；3、是由特定空間構(gòu)象維持、是由特定空間構(gòu)象維持的一個(gè)的一個(gè)裂隙裂隙4、酶的活性中心具有可運(yùn)、酶的活性中心具有可運(yùn)動(dòng)性和柔性動(dòng)性和柔性5、酶的活性中心與酶作用、酶的活性中心與酶作用的專一性有關(guān)的專一性有關(guān)酶促反應(yīng)機(jī)理酶促反應(yīng)機(jī)理溶菌酶活性中心l酶的催化作用，過渡態(tài)，活化能酶的催化作用，過渡態(tài)，活化能l中間產(chǎn)物學(xué)說中間產(chǎn)物學(xué)說l過渡態(tài)互補(bǔ)過渡態(tài)互補(bǔ)l使酶具有高催化效率的因素使酶具有高催化效率的因素1、 酶的催化作用與分子活化能

9、酶的催化作用與分子活化能化學(xué)反應(yīng)自由能方程式化學(xué)反應(yīng)自由能方程式G =H -TS（ G是總自由能的變化，是總自由能的變化， H 是總熱能的變化，是總熱能的變化，S是熵是熵的變化）的變化）當(dāng)當(dāng)G0，反應(yīng)不能自發(fā)進(jìn)行。，反應(yīng)不能自發(fā)進(jìn)行。當(dāng)當(dāng)G0，反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行。，反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行?；罨芑罨埽悍肿佑沙B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)所需的能量。是指分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)所需的能量。是指在一定溫度下，在一定溫度下，1mol 反應(yīng)物全部進(jìn)入活化狀態(tài)所需的自反應(yīng)物全部進(jìn)入活化狀態(tài)所需的自由能。由能。促使化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的途徑：促使化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的途徑：1. 用加熱或光照給反應(yīng)體系提供能量。用加熱或光照給反應(yīng)體系提供能量。

10、2. 使用催化劑降低反應(yīng)活化能。使用催化劑降低反應(yīng)活化能。酶和一般催化劑的作用就是降低化學(xué)反應(yīng)所酶和一般催化劑的作用就是降低化學(xué)反應(yīng)所需的活化能，從而使活化分子數(shù)增多，反應(yīng)需的活化能，從而使活化分子數(shù)增多，反應(yīng)速度加快。速度加快。l活化能活化能(Activation energy)：l分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)所需的能量。在一分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)所需的能量。在一定溫度下定溫度下1mol 底物全部進(jìn)入活化態(tài)所需要的底物全部進(jìn)入活化態(tài)所需要的自由能。自由能。1、學(xué)說認(rèn)為：、學(xué)說認(rèn)為：當(dāng)酶催化一化學(xué)反應(yīng)時(shí)，首當(dāng)酶催化一化學(xué)反應(yīng)時(shí)，首先先 E和和 S結(jié)合形成中間產(chǎn)物結(jié)合形成中間產(chǎn)物 ES，然后它，然

11、后它再分解成產(chǎn)物再分解成產(chǎn)物P并釋放酶并釋放酶E。1）中間產(chǎn)物比底物需較少的活化能就可分）中間產(chǎn)物比底物需較少的活化能就可分解成產(chǎn)物并放出酶。解成產(chǎn)物并放出酶。2）ES 決定酶促反應(yīng)速度。決定酶促反應(yīng)速度。3）中間產(chǎn)物形成的實(shí)驗(yàn)依據(jù)：）中間產(chǎn)物形成的實(shí)驗(yàn)依據(jù)：1.同位素同位素32P標(biāo)記底物法（磷酸化酶與葡萄糖結(jié)合）；標(biāo)記底物法（磷酸化酶與葡萄糖結(jié)合）；2.吸收光譜法（過氧化物酶與過氧化氫結(jié)合）。吸收光譜法（過氧化物酶與過氧化氫結(jié)合）。A:未結(jié)合底物未結(jié)合底物B:E-S中間復(fù)合物中間復(fù)合物 S分子向分子向E活性中心靠近，且趨向活性中心靠近，且趨向E催化部位，催化部位，使活性中心這一局部區(qū)域使活性

12、中心這一局部區(qū)域S增加，并使增加，并使S分子分子發(fā)生扭曲，易于斷裂，降低反應(yīng)所需活化能。發(fā)生扭曲，易于斷裂，降低反應(yīng)所需活化能。從而加快反應(yīng)速度。從而加快反應(yīng)速度。lX衍射證實(shí)：衍射證實(shí)：E使使S分子中敏感鍵中某分子中敏感鍵中某些基團(tuán)的電子密度些基團(tuán)的電子密度變化，產(chǎn)生電子張變化，產(chǎn)生電子張力力，使其發(fā)生變形，使其發(fā)生變形，更易于斷裂。更易于斷裂。酶高效的因素酶高效的因素A：S變形變形B：S和和E都變形都變形指指E分子上某分子上某些基團(tuán)作為質(zhì)些基團(tuán)作為質(zhì)子供體和質(zhì)子子供體和質(zhì)子受體對受體對S進(jìn)行進(jìn)行（廣義的）酸（廣義的）酸堿催化。堿催化。1、醛的水合作用2、肽的水解作用酶高效的因素酶高效的因素

13、 E分子中的親核基團(tuán)提分子中的親核基團(tuán)提供電子，對供電子，對S中親電子中親電子的碳原子進(jìn)行攻擊，的碳原子進(jìn)行攻擊，生成生成ES使反應(yīng)活化能使反應(yīng)活化能降低，降低，S可越過較低的可越過較低的能壘而形成產(chǎn)物。能壘而形成產(chǎn)物。酶高效的因素酶高效的因素二、酶原的激活二、酶原的激活沒有活性的酶的前體稱為沒有活性的酶的前體稱為酶原酶原。酶原轉(zhuǎn)變成有活。酶原轉(zhuǎn)變成有活性的酶的過程稱為性的酶的過程稱為酶原的激活酶原的激活。這個(gè)過程實(shí)質(zhì)上。這個(gè)過程實(shí)質(zhì)上是酶活性部位形成和暴露的過程。是酶活性部位形成和暴露的過程。在組織細(xì)胞中，某些酶以酶原的形式存在，可在組織細(xì)胞中，某些酶以酶原的形式存在，可保護(hù)分泌這種酶的組織

14、細(xì)胞不被水解破壞保護(hù)分泌這種酶的組織細(xì)胞不被水解破壞。纈纈 天天 天天天天天天賴賴?yán)i纈 甘甘組組纈纈 天天 天天天天天天賴賴甘甘 組組SS纈纈SS一：酶活力的測定：一：酶活力的測定： 1. 酶活力（酶活性酶活力（酶活性enzyme activity): ： 指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。 用酶所催化的某一用酶所催化的某一化學(xué)反應(yīng)速度化學(xué)反應(yīng)速度的快的快慢來表示酶的含量和存在。慢來表示酶的含量和存在。酶促反應(yīng)速度的測定：酶促反應(yīng)速度的測定：（1）測定單位時(shí)間底物的消耗量）測定單位時(shí)間底物的消耗量（2）測定單位時(shí)間產(chǎn)物的生成量）測定單位時(shí)間產(chǎn)物的生成量（1）、酶活力單位（

15、）、酶活力單位（active unit, U，I.U）：）： 特定條件下（特定條件下（25 ），在），在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化化1微摩爾底物的酶量。微摩爾底物的酶量。（2）、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（）、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（katal，kat）：）： 在最適條件下（在最適條件下（30 ）,每秒鐘可使每秒鐘可使1mol底物轉(zhuǎn)化的酶量。底物轉(zhuǎn)化的酶量。 1 kat = 6107 I.U 指每指每mg酶蛋白所具有的酶活力，一般用酶蛋白所具有的酶活力，一般用 U/ mg蛋白表示。蛋白表示。 （4）、）、用反應(yīng)用反應(yīng)初速度初速度（ v ） 來表示來表示：l 測單位時(shí)間內(nèi)、單測單位時(shí)間內(nèi)、單 位體積中底物減少位體積中底物減少

16、 或產(chǎn)物增加量來表示或產(chǎn)物增加量來表示 濃度濃度/單位時(shí)間單位時(shí)間.酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速是研究酶促反應(yīng)的速度及影響此速度的各種因素的科學(xué)。度及影響此速度的各種因素的科學(xué)。1.酶濃度對酶作用的影響酶濃度對酶作用的影響 在底物足夠過量，不含抑制酶活性的在底物足夠過量，不含抑制酶活性的物質(zhì)及其他不利于酶發(fā)揮作用的因素物質(zhì)及其他不利于酶發(fā)揮作用的因素時(shí)時(shí) V=k E （二）酶濃度對酶作用的影響（二）酶濃度對酶作用的影響在有足夠底物足夠底物和其他條件不變的情況下： v = k E 本人認(rèn)為不完善本人認(rèn)為不完善 v0 = k E原因：原因：1.逆反應(yīng)速度增加逆反應(yīng)速度增加2.底物

17、底物濃度下降濃度下降3.酶會(huì)因環(huán)境因素的影響而失活酶會(huì)因環(huán)境因素的影響而失活4.產(chǎn)物成為酶的產(chǎn)物成為酶的抑制劑抑制劑SvVmax一級(jí)反應(yīng) v = k S零級(jí)反應(yīng) v = k E Michaelis & Menten根據(jù)中間產(chǎn)根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說推導(dǎo)出表示酶促反應(yīng)中底物學(xué)說推導(dǎo)出表示酶促反應(yīng)中底物濃度與反應(yīng)速度關(guān)系的公式稱物濃度與反應(yīng)速度關(guān)系的公式稱 。米氏方程：米氏方程：Km + SV S=根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說：根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說： 式中K1,K2,K3分別為各反應(yīng)常數(shù)，可知： ES形成速度= K1 E S ES分解速度=(K2, + K3 ) ES當(dāng)反應(yīng)達(dá)恒穩(wěn)態(tài)時(shí),二速度相等,即: K1 E

18、S =(K2, + K3 ) ESK1K2K3整理并令：由于E 與ES之和為總的酶濃度Et ,即: Et= E + ES E = EtES將代入:ESK1= =E S (K2, + K3 )KmES=(EtES) SKm整理得:酶促反應(yīng)速度由ES決定,而= K3 ES ES=將代入整理得:ES=EtSKm+SK3=EtSKm+SK3此時(shí)達(dá)到最大反應(yīng)速度Vmax: Vmax= K3 Et 將代入,得米氏方程:=SKm+SVmaxa、 Km S 時(shí)時(shí)： =VS/ Km 初速度與初速度與S成正比的成正比的一級(jí)反應(yīng)。一級(jí)反應(yīng)。b、若若SKm 時(shí)時(shí)： =V 零級(jí)反應(yīng)零級(jí)反應(yīng)c、若若S = Km 時(shí)時(shí)：

19、=1/2V 酶反應(yīng)速度與酶反應(yīng)速度與S的關(guān)系的關(guān)系a、概念概念： 反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底 物濃度物濃度。b、單位單位： mol/L 或或 mmol/L c、意義意義： Km是酶的特征性物理常數(shù)。是酶的特征性物理常數(shù)。 只與只與E性質(zhì)有關(guān)，與性質(zhì)有關(guān)，與E無關(guān)；測無關(guān)；測Km可鑒別酶?？设b別酶。 在一定條件下某酶對某一底物有一定的在一定條件下某酶對某一底物有一定的Km值。值。 因此，測某酶的因此，測某酶的Km數(shù)值，可鑒別酶數(shù)值，可鑒別酶。同一同一E有幾個(gè)有幾個(gè)S就有幾個(gè)就有幾個(gè)Km， Km最小的為最適最小的為最適S或天然或天然S。Km大，大，E與與S親和

20、力弱；親和力弱； Km小，小， E與與S親和力強(qiáng)親和力強(qiáng)。d、實(shí)際用途：、實(shí)際用途： 1）可由所要求的）可由所要求的V求求S；例：求反應(yīng)速度達(dá)最大反應(yīng)速度例：求反應(yīng)速度達(dá)最大反應(yīng)速度99%時(shí)的底物濃時(shí)的底物濃度度 2）根據(jù)已知）根據(jù)已知S求該反應(yīng)求該反應(yīng)V。99%V=VSKm +S=S99Km將米氏方程兩側(cè)取倒數(shù)，以將米氏方程兩側(cè)取倒數(shù)，以1/對對1/S作圖得直線作圖得直線,得得Lineweaver-Burk方程：方程：Lineweaver-Burk作圖法作圖法（雙倒數(shù)作圖法）（雙倒數(shù)作圖法）Km求法求法: 1、量截距；、量截距； 2、量一個(gè)截距求斜率、量一個(gè)截距求斜率l在一定范圍內(nèi)（在一定范

21、圍內(nèi)（0-40） E活性隨溫度上升而加快；活性隨溫度上升而加快；l溫度達(dá)到一定高度（溫度達(dá)到一定高度（60 以上）以上）E活性不再增高，活性不再增高，反而下降。反而下降。酶的影響因素酶的影響因素 因因E種、種、E源不同而異。源不同而異。 (2)、溫度影響酶促反應(yīng)的機(jī)理：、溫度影響酶促反應(yīng)的機(jī)理：1）低于低于最適溫度：反應(yīng)最適溫度：反應(yīng)速度隨溫度上升速度隨溫度上升而而加快；加快；2）高于高于最適溫度：最適溫度：E蛋白蛋白隨溫度上升而變隨溫度上升而變性失活。性失活。酶的影響因素酶的影響因素l例例1、 蔬菜干制蔬菜干制 (霸王花、黃花菜霸王花、黃花菜) l酶促褐變條件：酚酶、酚類底物、酶促褐變條件：

22、酚酶、酚類底物、O2l例例2、 加工豆奶加工豆奶 l豆腥味產(chǎn)生條件：脂氧化酶、油脂、豆腥味產(chǎn)生條件：脂氧化酶、油脂、O2l例例3、 加工綠茶加工綠茶 l工藝：鮮葉工藝：鮮葉 殺青殺青 揉捻揉捻 干燥干燥l紅茶加工工藝：鮮葉紅茶加工工藝：鮮葉 萎雕萎雕 揉捻揉捻 發(fā)酵發(fā)酵 干燥干燥(1)、最適、最適pH： 超出則酶活下降。超出則酶活下降。 植物、微生物：植物、微生物： 最適最適pH： 4-6.5 ； 動(dòng)物動(dòng)物： 最適最適pH：6.5 -8l為酶特性之一、受各種為酶特性之一、受各種因素影響。因素影響。酶的影響因素酶的影響因素1）pH影響影響E活性中心及附近有關(guān)基團(tuán)的解活性中心及附近有關(guān)基團(tuán)的解 離

23、離，使之，使之易易或或不易不易與與S 結(jié)合；結(jié)合；2）pH影響影響S的極性基團(tuán)的極性基團(tuán)，從而影響這些基，從而影響這些基 團(tuán)與團(tuán)與E的結(jié)合；的結(jié)合；3）過酸、過堿可）過酸、過堿可使酶變性失活使酶變性失活。酶的影響因素酶的影響因素(1)、概念、概念：凡能提高酶活力的物質(zhì)稱激活劑。凡能提高酶活力的物質(zhì)稱激活劑。 (2)、種類：、種類：1）無機(jī)離子的激活作用：）無機(jī)離子的激活作用： 作為作為活性部位的組分活性部位的組分； 作為作為輔助因子的組分輔助因子的組分； 由由無機(jī)離子無機(jī)離子與與E、S或或ES結(jié)合引起。結(jié)合引起。 如：如：Mg2+、Ca2+、Co2+、Mn2+等。等。酶的影響因素酶的影響因素

24、包括還原劑（使二硫鍵還原）、包括還原劑（使二硫鍵還原）、 EDTA（去除重金屬雜質(zhì)）等。（去除重金屬雜質(zhì)）等。 激活酶原激活酶原、解除抑制劑的抑制作用解除抑制劑的抑制作用。如：如：pr與重金屬離子結(jié)合，解除抑制劑的與重金屬離子結(jié)合，解除抑制劑的 抑制。抑制。酶的影響因素酶的影響因素(1)、概念：、概念：l抑制劑（抑制劑（inhibitor, I ) ： 凡與凡與E結(jié)合后，使結(jié)合后，使E的活性部位結(jié)構(gòu)和的活性部位結(jié)構(gòu)和性質(zhì)改變而引起性質(zhì)改變而引起 E活性降低或喪失的物活性降低或喪失的物質(zhì)，叫質(zhì)，叫 。l抑制作用抑制作用(inhibition)： 任何使任何使E活性降低或喪失的作用統(tǒng)稱為活性降低或

25、喪失的作用統(tǒng)稱為.酶的影響因素酶的影響因素1）不可逆抑制：）不可逆抑制： 通常通常 I 以較牢固的共價(jià)鍵與以較牢固的共價(jià)鍵與E蛋白中的基蛋白中的基團(tuán)結(jié)合團(tuán)結(jié)合，引起，引起E失活。失活。l透析、超濾不能除去透析、超濾不能除去 I 。酶的影響因素酶的影響因素l有機(jī)磷、烷化劑：作用于有機(jī)磷、烷化劑：作用于Ser、Thr的的-OH； 如：有機(jī)磷農(nóng)藥、二戰(zhàn)毒氣等作用于催如：有機(jī)磷農(nóng)藥、二戰(zhàn)毒氣等作用于催 化乙酰膽堿水解的膽堿酯酶，引起化乙酰膽堿水解的膽堿酯酶，引起 一系列神經(jīng)中毒癥狀；一系列神經(jīng)中毒癥狀； 臨床用羥肟酸緩解癥狀。臨床用羥肟酸緩解癥狀。常用農(nóng)藥常用農(nóng)藥:有機(jī)磷農(nóng)藥、有機(jī)氯農(nóng)藥、有機(jī)汞農(nóng)藥有

26、機(jī)磷農(nóng)藥、有機(jī)氯農(nóng)藥、有機(jī)汞農(nóng)藥抗菌素抗菌素: 酶的影響因素酶的影響因素lI與與E的結(jié)合往往是非共價(jià)鍵結(jié)合的結(jié)合往往是非共價(jià)鍵結(jié)合，是可，是可逆結(jié)合，可用透析法除去逆結(jié)合，可用透析法除去I。l可逆抑制根據(jù)可逆抑制根據(jù)I與與S的關(guān)系分三類：的關(guān)系分三類： 競爭性抑制：競爭性抑制： 非競爭性抑制：非競爭性抑制： 反競爭性抑制：反競爭性抑制：酶的影響因素酶的影響因素 I 在在分子結(jié)構(gòu)上與分子結(jié)構(gòu)上與S類似類似， I與與S競爭性競爭性與與E結(jié)合，使酶促反應(yīng)速度下降。結(jié)合，使酶促反應(yīng)速度下降。 但，若但，若S高，則此效應(yīng)減小高，則此效應(yīng)減小。酶的影響因素酶的影響因素 E + S S E E+P + I

27、EI特點(diǎn)：特點(diǎn)：I與與S結(jié)構(gòu)類似；抑制程度取決于結(jié)構(gòu)類似；抑制程度取決于 I和和S以及與以及與E的親和力；可通過增加的親和力；可通過增加S來減輕或解除抑制。來減輕或解除抑制。lI占了占了S的位子；的位子；l E與與I或或S結(jié)合后構(gòu)結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化，象發(fā)生變化，l產(chǎn)生不利于另一個(gè)產(chǎn)生不利于另一個(gè)結(jié)合的構(gòu)象。結(jié)合的構(gòu)象。藥物設(shè)計(jì)的依據(jù)。藥物設(shè)計(jì)的依據(jù)。如磺胺、如磺胺、對氨基苯甲酸(PABA)對氨基苯磺酰胺lS與與I可可同時(shí)結(jié)合同時(shí)結(jié)合在在酶的不同部位上，酶的不同部位上，形成形成ESI，因此酶，因此酶活性降低?；钚越档?。l此類此類 I 與與E活性中活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合，心以外的基團(tuán)結(jié)合，其結(jié)構(gòu)可

28、能與其結(jié)構(gòu)可能與S無無關(guān)。關(guān)。酶的影響因素酶的影響因素l改變酶結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；改變酶結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；lVmax減?。粶p?。籰抑制取決于抑制取決于 I。非競爭抑制的通式反競爭性抑制作用反競爭性抑制作用：抑制劑必須在酶與底物結(jié)抑制劑必須在酶與底物結(jié)合后才能進(jìn)一步形成合后才能進(jìn)一步形成ESI復(fù)合物。復(fù)合物。S + EESE + P + IESIE+Pv = V1 + Iki Skm1+ Iki+ SSvkmkml競爭性抑制：競爭性抑制：Vmax不變；不變；Km增大，增大， 增加增加S可克服?？煽朔?。l非競爭性抑制：非競爭性抑制： Km 不變；不變； Vmax減小，減小， 增加增加S不可克服。不可克服。 反競

29、爭性抑制反競爭性抑制: Vmax減小減小;Km減小減小(1)、概念：、概念： 亦稱亦稱變構(gòu)酶變構(gòu)酶，是一類重，是一類重要的調(diào)節(jié)酶。要的調(diào)節(jié)酶。 一般為寡聚酶（兩個(gè)以一般為寡聚酶（兩個(gè)以上亞基組成），易發(fā)生構(gòu)上亞基組成），易發(fā)生構(gòu)象改變。其上有二個(gè)重要象改變。其上有二個(gè)重要部位：部位： 活性部位活性部位和和別構(gòu)部位別構(gòu)部位Asp轉(zhuǎn)氨甲酰酶1）活性部位：）活性部位： 負(fù)責(zé)負(fù)責(zé)E對對S的結(jié)合與的結(jié)合與催化；催化；2）別構(gòu)部位：）別構(gòu)部位： 可結(jié)合調(diào)節(jié)物，負(fù)可結(jié)合調(diào)節(jié)物，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)酶反應(yīng)速度責(zé)調(diào)節(jié)酶反應(yīng)速度 。 這兩部位可在不同亞基這兩部位可在不同亞基或同一亞基不同部位上或同一亞基不同部位上。1）概念：

30、）概念： 當(dāng)當(dāng)S或或S以外的物質(zhì)與以外的物質(zhì)與E的別構(gòu)部位非共價(jià)的別構(gòu)部位非共價(jià) 結(jié)合后，通過結(jié)合后，通過E分子構(gòu)象的變化影響分子構(gòu)象的變化影響E催化催化 活性的效應(yīng)稱活性的效應(yīng)稱 。 引起別構(gòu)效應(yīng)的物質(zhì)。分兩種：引起別構(gòu)效應(yīng)的物質(zhì)。分兩種：l別構(gòu)激活劑別構(gòu)激活劑： 正協(xié)同，加快反應(yīng)速度的，多為正協(xié)同，加快反應(yīng)速度的，多為S 。 如：如：ATP對對ATCase(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶)。l別構(gòu)抑制劑：別構(gòu)抑制劑： 負(fù)協(xié)同，減慢反應(yīng)速度，多為代謝終產(chǎn)物。負(fù)協(xié)同，減慢反應(yīng)速度，多為代謝終產(chǎn)物。 如：如：CTP對對ATCase。大多數(shù)別構(gòu)酶不大多數(shù)別構(gòu)酶不符合米氏方程。符合米氏方程。1

31、、非調(diào)節(jié)酶曲線、非調(diào)節(jié)酶曲線2、正協(xié)同別構(gòu)酶、正協(xié)同別構(gòu)酶3、負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶、負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶曲線2中S的變化所引起的速度變化的反應(yīng)幾乎是“全”或“無”l分離純化分離純化l酶的應(yīng)用酶的應(yīng)用（一）目的：（一）目的： 1、為了研究酶的理化性質(zhì)或鑒定酶；、為了研究酶的理化性質(zhì)或鑒定酶； 2、作為生化試劑或藥物。、作為生化試劑或藥物。（二）根據(jù)酶在體內(nèi)作用的部位分：（二）根據(jù)酶在體內(nèi)作用的部位分： 胞外酶、胞內(nèi)酶；胞外酶、胞內(nèi)酶；（三）步驟：（三）步驟： 選材選材破碎破碎抽提抽提分離純化分離純化保存保存酶在細(xì)胞中的分布：酶在細(xì)胞中的分布： 胞外酶：水解酶類，易收集，不必破碎細(xì)胞，胞外酶：水解酶類，易收集，不

32、必破碎細(xì)胞，緩沖液或水浸泡細(xì)胞或發(fā)酵液離心得到上清液緩沖液或水浸泡細(xì)胞或發(fā)酵液離心得到上清液即為含酶液。即為含酶液。 胞內(nèi)酶：除水解酶類外的其它酶類，需破碎胞內(nèi)酶：除水解酶類外的其它酶類，需破碎細(xì)胞，不同的酶分布部位不同，最好先將酶存細(xì)胞，不同的酶分布部位不同，最好先將酶存在的細(xì)胞器分離后再破碎該細(xì)胞器，然后將酶在的細(xì)胞器分離后再破碎該細(xì)胞器，然后將酶用適當(dāng)?shù)木彌_溶液或水抽提。用適當(dāng)?shù)木彌_溶液或水抽提。 原則：原則： 在增加酶得率和純度的同時(shí)，盡可能避免高溫、過酸、在增加酶得率和純度的同時(shí)，盡可能避免高溫、過酸、過堿、劇烈的震蕩及其它可能使酶喪失活力的一切操作過過堿、劇烈的震蕩及其它可能使酶喪

33、失活力的一切操作過程。程。盡最大可能保存酶的活力。盡最大可能保存酶的活力。分離提純：分離提純：1.1.酶的抽提：將酶溶解出來就稱為抽提。酶的抽提：將酶溶解出來就稱為抽提。 胞外酶：固體培養(yǎng)的菌體加水或適當(dāng)緩沖溶液浸泡過濾即可。胞外酶：固體培養(yǎng)的菌體加水或適當(dāng)緩沖溶液浸泡過濾即可。液體培養(yǎng)的菌體將發(fā)酵液離心分離除去菌體收集離心液即液體培養(yǎng)的菌體將發(fā)酵液離心分離除去菌體收集離心液即可?？?。 胞內(nèi)酶：先破碎細(xì)胞，再用水或適當(dāng)?shù)木彌_溶液抽提。胞內(nèi)酶：先破碎細(xì)胞，再用水或適當(dāng)?shù)木彌_溶液抽提。 2. 2.酶的純化：酶的純化： 純化的關(guān)鍵是維持酶的活性，因?yàn)殡S著酶的逐漸提純，一些天純化的關(guān)鍵是維持酶的活性，

34、因?yàn)殡S著酶的逐漸提純，一些天然的可保持酶活力的其它成分逐漸減少，酶的穩(wěn)定性變差，所以然的可保持酶活力的其它成分逐漸減少，酶的穩(wěn)定性變差，所以整個(gè)純化過程應(yīng)維持低溫。整個(gè)純化過程應(yīng)維持低溫。（1 1）酶的沉淀方法：與蛋白質(zhì)的沉淀方法相同，常用：）酶的沉淀方法：與蛋白質(zhì)的沉淀方法相同，常用：A A鹽析法：常用硫酸銨鹽析，有分段鹽析和一次性鹽析兩種方法。鹽析法：常用硫酸銨鹽析，有分段鹽析和一次性鹽析兩種方法。B B有機(jī)溶劑沉淀法：用乙醇、丙酮等。應(yīng)低溫操作，溶劑少量分有機(jī)溶劑沉淀法：用乙醇、丙酮等。應(yīng)低溫操作，溶劑少量分批加入。批加入。（2 2）酶的純化方法：）酶的純化方法：有吸附層析、離子交換層析

35、、凝膠過濾層析、親和層析等。有吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。3.3.酶的結(jié)晶：酶的結(jié)晶：純化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。純化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。4.酶的保存：酶的保存：一般在一般在-20以下低溫保存。以下低溫保存。 注意：注意：l 低溫；低溫；0-5，有機(jī)溶劑在，有機(jī)溶劑在-15 -20；l 加加EDTA，防止金屬離子使酶失活；，防止金屬離子使酶失活；l 加巰基乙醇，避免酶蛋白巰基氧化失活；加巰基乙醇，避免酶蛋白巰基氧化失活；l 不要過度攪拌。應(yīng)常測酶活。不要過度攪拌。應(yīng)常測酶活。 酶的應(yīng)用酶的應(yīng)用工業(yè)上酶應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)：工業(yè)上酶應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)：1. 專一性高，

36、副反應(yīng)很少，后處理容易。專一性高，副反應(yīng)很少，后處理容易。2. 催化效率高，酶用量少。催化效率高，酶用量少。3. 反應(yīng)條件溫和，可以在近中性的水溶液中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件溫和，可以在近中性的水溶液中進(jìn)行反應(yīng)。4.酶的催化活性可以進(jìn)行人工控制。酶的催化活性可以進(jìn)行人工控制。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：1.酶易失活，酶反應(yīng)的溫度、酶易失活，酶反應(yīng)的溫度、PH、離子強(qiáng)度等要、離子強(qiáng)度等要很好控制。很好控制。2.酶不易得到，價(jià)格昂貴。酶不易得到，價(jià)格昂貴。3.酶不易保存。酶不易保存。l1 1、酶在工業(yè)中的應(yīng)用不斷擴(kuò)大。、酶在工業(yè)中的應(yīng)用不斷擴(kuò)大。l酶在食品工業(yè)的應(yīng)用：酶在食品工業(yè)的應(yīng)用： l1)1)、釀造米酒、釀造米酒

37、 浸米浸米蒸飯蒸飯拌曲拌曲裝缸裝缸糖化發(fā)酵糖化發(fā)酵壓榨壓榨成品成品l l 酒曲酒曲l2)2)、果葡糖漿酶法生產(chǎn)：、果葡糖漿酶法生產(chǎn)：l 液化酶液化酶 糖化酶糖化酶 葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶 l 淀粉乳淀粉乳-糊精糊精-葡萄糖葡萄糖-果葡糖漿果葡糖漿l3)3)、果汁澄清：、果汁澄清：l 果膠酶果膠酶l 果汁果汁-澄清果汁澄清果汁l酶在輕工、化工領(lǐng)域的應(yīng)用：酶在輕工、化工領(lǐng)域的應(yīng)用：l1)1)、蛋白酶用于皮革工業(yè)的脫毛。、蛋白酶用于皮革工業(yè)的脫毛。l2)2)、-淀粉酶、纖維素酶用了牛仔服的生產(chǎn)。淀粉酶、纖維素酶用了牛仔服的生產(chǎn)。l3)3)、堿性蛋白酶、堿性脂肪酶應(yīng)用于洗滌劑的生產(chǎn)。、堿性蛋白酶、堿

38、性脂肪酶應(yīng)用于洗滌劑的生產(chǎn)。l2 2、酶在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用、酶在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用l1)1)、酶在疾病診斷中的地位越來越重要。、酶在疾病診斷中的地位越來越重要。l2)2)、酶作為治療疾病的藥物在臨床上的應(yīng)用不斷擴(kuò)大。、酶作為治療疾病的藥物在臨床上的應(yīng)用不斷擴(kuò)大。 l 某些作為藥物使用的酶某些作為藥物使用的酶l 酶酶 臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用l 淀粉酶淀粉酶 治療消化不良治療消化不良l 菠蘿蛋白酶菠蘿蛋白酶 治療手術(shù)后的浮腫、炎癥、傷口化膿、消化不良治療手術(shù)后的浮腫、炎癥、傷口化膿、消化不良l 尿激酶尿激酶 溶解血栓溶解血栓l 左旋糖酐酶左旋糖酐酶 預(yù)防齲齒預(yù)防齲齒l 天冬酰胺酶天冬酰胺酶 治遼癌癥治遼癌癥l3. 3

39、. 工具酶在生物學(xué)研究中的應(yīng)用工具酶在生物學(xué)研究中的應(yīng)用l 利用酶的專一性催化作用，可以進(jìn)行生物大分子的分析、改造和利用酶的專一性催化作用，可以進(jìn)行生物大分子的分析、改造和l生物物質(zhì)的處理。用于這樣目的酶稱為生物物質(zhì)的處理。用于這樣目的酶稱為-。l例如：各種例如：各種 蛋白酶蛋白酶 已用于蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析。已用于蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析。l DNADNA聚合酶聚合酶 已用于已用于DNADNA一級(jí)傳結(jié)構(gòu)分析。一級(jí)傳結(jié)構(gòu)分析。l 各種各種 DNADNA限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 能將地?cái)嗔涯軐⒌財(cái)嗔袲NADNA成為片斷，這是基因工程能夠?qū)嵆蔀槠瑪啵@是基因工程能夠?qū)崿F(xiàn)的重要前提之一?，F(xiàn)的重要

40、前提之一。l 在處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，可以用在處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，可以用 溶菌酶、纖維素酶溶菌酶、纖維素酶 等破碎細(xì)胞。等破碎細(xì)胞。酶工程：酶工程：指酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)指酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。和應(yīng)用。1、化學(xué)酶工程：、化學(xué)酶工程： 由酶學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)相結(jié)合而形成。由酶學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)相結(jié)合而形成。 通過化學(xué)修飾、固定化處理、甚至化學(xué)通過化學(xué)修飾、固定化處理、甚至化學(xué) 合成法等手段改善酶的性質(zhì)，以提高催合成法等手段改善酶的性質(zhì)，以提高催 化效率及降低成本?；始敖档统杀?。概念：概念：將分離純化得到的水溶性酶用物理或化學(xué)將分離純化得到的水溶性酶用物理或化學(xué)的方法處理，使酶與載體（瓊脂

41、糖、聚丙烯酰的方法處理，使酶與載體（瓊脂糖、聚丙烯酰胺等）連接，作成具催化活性的水不溶的酶。胺等）連接，作成具催化活性的水不溶的酶。應(yīng)用：應(yīng)用：此技術(shù)可提高酶的穩(wěn)定性和使用壽命；使此技術(shù)可提高酶的穩(wěn)定性和使用壽命；使反應(yīng)過程連續(xù)化、自動(dòng)化，簡化工藝；提高產(chǎn)反應(yīng)過程連續(xù)化、自動(dòng)化，簡化工藝；提高產(chǎn)品質(zhì)量。品質(zhì)量。 此技術(shù)以廣泛用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥衛(wèi)生、此技術(shù)以廣泛用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、生物化工等方面。環(huán)境保護(hù)、生物化工等方面。l 某些作為藥物使用的酶某些作為藥物使用的酶：l1)1)、重復(fù)使用、重復(fù)使用l2)2)、不污染產(chǎn)物、不污染產(chǎn)物 l3)3)、有利于連續(xù)化和自動(dòng)化生產(chǎn)、有利于連續(xù)化和自動(dòng)化生產(chǎn) l4) 4) 、節(jié)約能源和設(shè)備投資、節(jié)約能源和設(shè)備投資 ：1)1)、酶經(jīng)固定化后活力降低、酶經(jīng)固定化后活力降低 2)2)、對、對大分子底物和氣體底物不利大分子底物和氣體底物不利. .l酶固定化方法：酶固定化方法： 1)1)、吸附法、吸附法 2)2)、共價(jià)偶聯(lián)、共價(jià)偶聯(lián)法法 3)3)、包埋法、包埋法 4)4)、交聯(lián)法固定化、交聯(lián)法固定化l酶的應(yīng)用：酶的應(yīng)用：1)1)、固定化葡萄糖異構(gòu)酶將葡萄糖轉(zhuǎn)、固定化葡萄糖異構(gòu)酶將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楣亲優(yōu)楣?l 2)2)、固定化木瓜蛋白酶澄清啤酒、固定化