龍膽瀉肝膠囊和軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)探究

1、龍膽瀉肝膠囊和軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)探究摘要：目的建立龍膽瀉肝膠囊及龍膽瀉肝軟膠囊的 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法對(duì)龍膽、柴胡、黃苓、梔 子、澤瀉、當(dāng)歸、地黃、甘草進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液 相色譜法測(cè)定龍膽中龍膽苦昔、梔子中梔子昔、黃苓中黃苓 昔的含量。結(jié)果 薄層色譜斑點(diǎn)清晰。龍膽苦昔在0. 066 1 0. 595 1 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(尸1.000 0),膠囊劑平均回收率為99.34% (rsd二1.50%),軟膠囊劑平均回收率為 96. 62% (rsd=1. 50%)；梔子昔在 0. 076 1 1. 369 8 mg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r二0.999 9),膠囊劑平均回收率

2、為 101. 32% (rsd二1.70%),軟膠囊劑平均回收率為100.59%(rsd二0.79%)；黃苓昔在0.214 41.608 mg范圍內(nèi)呈良好 的線性關(guān)系(1-1.000 0),膠囊劑平均回收率為101. 12%(rsd=1. 30%),軟膠囊劑平均回收率為98. 07%(rsd=2. 40%)。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便易行，重復(fù)性好，可用于龍膽瀉肝膠囊、 龍膽瀉肝軟膠囊的質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞：龍膽瀉肝膠囊；龍膽瀉肝軟膠囊；龍膽苦昔;梔子昔；黃苓昔；薄層色譜法；高效液相色譜法中圖分類號(hào)：r284. 1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a文章編號(hào):1005-5304 (2013) 10-0054-06龍膽瀉肝膠囊收載

3、于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn) 第62冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為ws3-343 （z-031） -2003 （z）及仿制生 產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（試行）ybz06152005,原標(biāo)準(zhǔn)收載了 龍膽苦昔的液相色譜鑒別，柴胡、黃苓、當(dāng)歸、甘草的薄層 色譜鑒別和高效液相色譜法（hplc）測(cè)定龍膽中龍膽苦昔、 梔子中梔子昔的含量1。龍膽瀉肝軟膠囊收載于衛(wèi)生部 藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第70冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為ws3-816（z-229） -2005 （z）,原標(biāo)準(zhǔn)收載了黃苓昔、龍膽苦昔、梔子昔、甘 草次酸的薄層色譜鑒別和hplc測(cè)定黃苓中黃苓昔的含量 2。為控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量及系列標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一，本研究對(duì) 處方中龍膽、柴胡、黃苓、梔子、

4、澤瀉、當(dāng)歸、地黃、甘草 進(jìn)行薄層色譜鑒別，并采用hplc測(cè)定制劑中1儀器與試藥島津lc-20a高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測(cè)器 （pda）型；硅膠g預(yù)制板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）；硅膠 g預(yù)制板（青島海洋化工廠分廠）。對(duì)照品黃苓昔（批號(hào)110715-200212）、龍膽苦昔（批號(hào) 110703-200322）、梔子昔（批號(hào) 110749-200714）、甘草昔（批 號(hào)111610-200604）.阿魏酸（批號(hào)0773-9910）,對(duì)照藥材 柴胡（批號(hào) 120992-200705）、澤瀉（批號(hào) 121081-200302）、 地黃（批號(hào)121180-200402）,均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究

5、 院。龍膽瀉肝膠囊樣品來自2家生產(chǎn)企業(yè)共7批：a （批號(hào)20090902. 20100603. 20100604), b (批號(hào) 100902、100903、101001. 101002)；龍膽瀉肝軟膠囊樣品來自1家生產(chǎn)企業(yè) 共 3 批:c (11112211、11112212. 11112213)。除 b 企業(yè)生 產(chǎn)的101001批次為0.5 g/粒,其他批次均為0. 25 g/粒。 甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。2薄層色譜鑒別2.1龍膽、梔子、甘草取龍膽瀉肝膠囊及軟膠囊內(nèi)容物各2 g,加甲醇20 ml,超聲處理10 min,濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試

6、品溶液。分別取不含龍膽、梔子、甘草的陰性 制劑各2 g,分別同法制成龍膽、梔子及甘草的陰性溶液。 另取龍膽苦昔對(duì)照品、梔子昔對(duì)照品、甘草昔對(duì)照品，分別 加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取 上述供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性溶液各2?l,分別點(diǎn)于 同一高效硅膠gf254薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(6 ： 6 ： 1)為展開劑，展開2次，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與龍膽苦昔對(duì)照品、 梔子昔對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；缺龍 膽、梔子的陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。再噴以10%硫酸乙醇溶液, 在105 °c加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，

7、置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與甘草昔對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯 相同顏色的熒光斑點(diǎn)；缺甘草陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。2.2柴胡取龍膽瀉肝膠囊及軟膠囊內(nèi)容物各5 g,加甲醇60 ml, 超聲處理30 min,濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0ml使溶解, 用乙瞇振搖提取3次，每次15 ml,合并乙瞇液備用。水液 用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次15 ml,合并正丁醇 液，用5%碳酸鈉溶液洗滌3次，每次10 ml,再用水10 ml 洗滌，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，加于 已處理好的d101型大孔吸附樹脂柱（柱高為10 cm,內(nèi)徑為 15 mm）上，用水50 ml洗滌，再

8、用70%乙醇60 ml洗脫，收 集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，加中性氧化鋁lg 拌勻，揮干，置中性氧化鋁柱（100200目，4 g,內(nèi)徑 15 mm）上，用甲醇-乙酸乙酯（1 : 1）的混合液10ml洗滌, 再用60%甲醇60 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?0.5 ml使溶解，作為供試品溶液。取不含柴胡的陰性制劑5 g,同法制成柴胡陰性溶液。另取柴胡對(duì)照藥材2 g,同法制 成對(duì)照藥材溶液。吸取上述供試品、對(duì)照藥材及陰性溶液各 10 ?l,分別點(diǎn)于同一硅膠g薄層板上，以三氯甲烷-正丁醇 -甲醇-水（30 ： 1 ： 10 ： 1）為展開劑，展開，取出，晾干， 噴以1%對(duì)二甲氨基

9、苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在105 °c加 熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng) 的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。缺柴胡陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。2.3黃苓取不含黃苓的陰性制劑2 g,加甲醇 20 ml,超聲處理10 min,濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状糹ml 使溶解，作為黃苓陰性溶液。另取黃苓昔對(duì)照品，加甲醇制 成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取對(duì)照品溶 液、陰性溶液及“2. 1”項(xiàng)下供試品溶液各3 ?l,以乙酸乙 酯-甲酸-水（7 ： 4 ： 3）的上層溶液為展開劑，展開，取出， 晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照 品色譜相應(yīng)的位置上，顯

10、相同顏色的斑點(diǎn)。缺黃苓陰性樣品 無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。2. 4澤瀉取龍膽瀉肝膠囊10 g,加石油瞇（6090 °c） 50 ml, 超聲處理30 min,濾過，濾液揮干，殘?jiān)邮筒[（6090 °c ） iml使溶解，作為膠囊劑供試品溶液。另取不含澤瀉的膠囊 劑陰性制劑10g,同法制成膠囊劑澤瀉陰性溶液。龍膽瀉肝 軟膠囊直接吸取“2.1”項(xiàng)下軟膠囊劑供試品溶液。另取不 含澤瀉的軟膠囊陰性制劑2 g,按“2. 1”項(xiàng)下制成軟膠囊澤 瀉陰性溶液。另取澤瀉對(duì)照藥材lg,加石油瞇（6090 °c） 50 ml,超聲處理30 min,濾過，濾液揮干，殘?jiān)邮筒[ （6090 

11、6;c） 1 ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。吸取上述 供試品、對(duì)照藥材及陰性溶液各10 ?l,分別點(diǎn)于同一硅膠 g薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（15 ： 2 ： 0.5）為展 開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 °c 加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的 熒光斑點(diǎn)。缺澤瀉陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。2. 5當(dāng)歸取“2.2”項(xiàng)下乙瞇液，用2%碳酸鈉溶液30 ml振搖提 取，分取水層，緩緩加入稀鹽酸，調(diào)節(jié)ph值至1,用乙瞇 30 ml振搖提取，分取乙醞液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶 解，作為供試

12、品溶液。另取不含當(dāng)歸的陰性制劑5 g,加甲 醇60 ml,超聲處理30 min,濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，用乙瞇振搖提取3次，每次15 ml,合并乙瞇液, 同法制成當(dāng)歸陰性溶液。再取阿魏酸對(duì)照品，加甲醇制成每 1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述供試品溶 液、對(duì)照品溶液及陰性溶液各10 ?l,分別點(diǎn)于同一硅膠g 薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-冰醋酸（6 ： 5 ： 1）為展開劑, 展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品 色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光 斑點(diǎn)。缺當(dāng)歸陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。2.6地黃取龍膽瀉肝膠囊內(nèi)容物10 g,加

13、乙酸乙酯50 ml,超聲 處理30 min,濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? ml使溶解，作為膠囊劑供試品溶液。取不含地黃的膠囊劑陰性制劑10 g,同法制成膠囊劑地黃陰性溶液。龍膽瀉肝軟膠囊直接吸取“2.1”項(xiàng)下軟膠囊劑供試品溶液。另取不含地黃的軟膠囊陰性制劑2 g,按"2.1"項(xiàng)下方法制成軟膠囊地黃陰性溶液。另取地黃對(duì)照藥材1 g,加乙酸乙酯50ml,超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? nil使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。吸取上述供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及 陰性溶液各10 ?l,分別點(diǎn)于同一硅膠g薄層板上，以二甲苯-乙酸乙酯（3 : 1）為展開劑，展開，取出，

14、晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 °c加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜 相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。缺地黃陰性樣品無(wú) 相應(yīng)斑點(diǎn)。3含量測(cè)定 3. 1色譜條件色譜柱：phenomenex luna c18 （5 u m, 4. 6 mmx250 mm）； 流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相a,以0. 1%磷酸溶液為流動(dòng)相b, 按表1、表2進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為30 °c 4；龍膽苦昔檢 測(cè)波長(zhǎng)為270 nm,梔子昔檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm,黃苓昔檢測(cè) 波長(zhǎng)為280 nmo理論板數(shù)按龍膽苦昔、梔子昔和黃苓昔峰計(jì) 算均應(yīng)不低于30

15、005-1 lo3. 2對(duì)照品溶液的制備取龍膽苦昔對(duì)照品、梔子昔對(duì)照品和黃苓昔對(duì)照品適 量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 nil含龍膽苦昔30 ?g. 梔子昔35?,黃苓65 ?g的溶液，即得（膠囊劑測(cè)定用）。分別加甲醇制成每1 nil含龍膽苦昔20 ?g、梔子昔20 ?g、 黃苓昔65 ?8的溶液，即得（軟膠囊劑測(cè)定用）。3.3供試品溶液的制備龍膽瀉肝膠囊劑內(nèi)容物混勻,取約0.5 g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml,密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 w,頻率50 khz） 40 min,放冷， 再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取 續(xù)濾液，即得。

16、龍膽瀉肝軟膠囊劑內(nèi)容物混勻，取約0.3g, 精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml,密塞， 稱定質(zhì)量，加熱回流60 min,放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。3.4陰性對(duì)照溶液的制備分別按處方比例及制劑制備工藝制備不含龍膽苦昔、梔 子、黃苓昔的陰性樣品，再按“3.3”項(xiàng)下方法制備，即得。3.5專屬性試驗(yàn)取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 ?l, 分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定，結(jié)果龍膽苦昔、梔子、黃 苓昔陰性樣品分別在龍膽苦昔、梔子昔、黃苓昔相應(yīng)保留時(shí) 間處未見色譜峰，表明陰性樣品對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾。見圖1圖3.6線性關(guān)系考察分別精密吸取龍膽苦昔對(duì)

17、照品溶液（濃度為0.033 06mg/ml)2、3、4、6、8、9、10、12、15、18 ?l,梔子昔對(duì)照品溶液(濃度為 0. 076 1 mg/ml) 1、2、3、4、5、6、8、 9、10、12、15、18 ?l,黃苓昔對(duì)照品溶液(濃度為0. 107 2 mg/ml) 2、4、6、8、12、15 ?l,注入高效液相色譜儀，以 進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。龍膽苦 昔為 y二 1 320 942. 996 28x+942. 533 52 (r二 1.000 0),表明 其在0. 066 120. 595 1 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；梔子昔 為 y=1 554 982. 04

18、1 17x+537. 38788 (r=0. 999 9),表明其 在0.076 11.369 8 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；黃苓昔為y二3 595 816. 662 38x+14494. 72138 (r二 1. 000 0),表明其在 0. 21441.608 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。3.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液(膠囊劑批號(hào)100902,軟膠囊劑批號(hào)11112211),按含量測(cè)定方法，分別在膠囊劑制備后0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定，軟膠囊劑在配置后0、2、 4、6、10、14 h進(jìn)樣測(cè)定。膠囊劑峰面積rsd龍膽苦昔為 0. 84%,梔子昔為0. 50%,黃苓昔為0.

19、68%,表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。軟膠囊劑峰面積rsd龍膽苦昔為0. 84%, 梔子昔為0.51%,黃苓昔為0. 49%,表明供試品溶液在14 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。3.8重復(fù)性試驗(yàn)分別取膠囊劑內(nèi)容物約05 g及軟膠囊劑內(nèi)容物約0. 3g,精密稱定，依法測(cè)定。膠囊劑含量rsd龍膽苦昔為0. 56%, 梔子昔為0. 29%,黃苓昔為0. 11%,方法重復(fù)性良好。軟膠 囊劑含量rsd龍膽苦昔為0. 16%,梔子昔為0. 64%,黃苓昔 為0. 56%,方法重復(fù)性良好。3.9龍膽瀉肝膠囊加樣回收率試驗(yàn)采用加樣回收法，設(shè)計(jì)3個(gè)濃度，每個(gè)濃度各制備3份供試品溶液。精密稱取已知含量同一批樣品（批號(hào)100

20、902, 龍膽苦昔含量為3. 584 4 mg/g,梔子昔含量為6. 480 6 mg/g, 黃苓昔含量為7.764 6 mg/g）：（低濃度）取0. 125 g, 精密加入對(duì)照品混合溶液（含龍膽苦昔0. 007 065 mg/ml, 梔子昔 0. 008 965 mg/ml,黃苓昔 0. 016 355 mg/ml） 50 ml； （中濃度）取0. 25 g,精密加入對(duì)照品混合溶液（含龍膽 苦0. 014 13 mg/ml,梔子0. 017 93 mg/ml,黃苓昔 0. 032 71 mg/ml） 50 ml；（高濃度）取0.5 g,精密加入對(duì)照品 混合溶液（含龍膽苦昔0. 028 26

21、mg/ml,梔子昔0. 035 86 mg/ml,黃苓昔 0. 065 42 mg/ml） 50 mlo 分別按 “3.3” 項(xiàng) 下方法制備并測(cè)定。結(jié)果龍膽苦昔平均回收率為99.34%, rsd二1.50%；梔子昔平均回收率為101. 32%, rsd二1.70%；黃苓昔平均回收率為101.12%, rsd=1. 30%o見表3表5。3. 10龍膽瀉肝軟膠囊加樣回收率試驗(yàn)采用加樣回收法，設(shè)計(jì)3個(gè)濃度，各制備3份供試品溶 液。精密稱取已知含量的同一批樣品（批號(hào)11112212,龍膽 苦昔 4. 842 4 mg/g,梔子昔 4. 435 5 mg/g,黃苓昔 11. 601 1 mg/g）：（低

22、濃度）取本品約0. 075 g,精密加入對(duì)照品混 合溶液（含龍膽苦昔0. 007 495 mg/ml,梔子昔0. 006 945 mg/ml,黃苓昔 0.016 605 mg/ml） 50 ml；（中濃度）取 本品約0. 15 g精密加入對(duì)照品混合溶液（含龍膽苦昔0.014 99 mg/ml,梔子昔 0. 013 89 mg/ml,黃苓昔 0. 033 21 mg/ml）50 ml；（高濃度）取約0.30 g精密加入對(duì)照品混合溶液 （含龍膽苦昔 0. 029 98 mg/ml,梔子昔 0. 027 78 mg/ml,黃苓 0. 06642 mg/ml） 50 ml按供試品溶液同法制備，測(cè) 定。

23、結(jié)果見表6表8。3. 11樣品測(cè)定按上述測(cè)定方法，測(cè)定7批龍膽瀉肝膠囊和3批龍膽瀉肝軟膠囊樣品，結(jié)果見表9。4討論龍膽瀉肝膠囊及龍膽瀉肝軟膠囊處方由10味藥構(gòu)成，本研究共進(jìn)行了 8味藥的薄層色譜鑒別研究，僅木通及車前子未能購(gòu)買到中國(guó)藥品生物制品檢定所提供對(duì)照藥材，故未 進(jìn)行研究。龍膽苦昔、梔子昔、甘草昔的薄層鑒別中，由于3種成分較難分離，經(jīng)過大量試驗(yàn)，最終確定用高效薄層板，以同 一展開劑展開2次的方法進(jìn)行分離，得到了較理想的結(jié)果。本研究的6個(gè)薄層色譜耐用性考察結(jié)果表明，采用不同 薄層板，在不同溫度和濕度條件下，均獲得較好的薄層色譜分離o本研究采用同一樣品，分別在其最大吸收波長(zhǎng)下，同時(shí) 測(cè)定3種

24、成分的含量，前處理簡(jiǎn)單，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，可較大 節(jié)省試驗(yàn)中的人力及物力消耗。本研究選用甲醇、80%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、無(wú)水 乙醇、80%乙醇、稀乙醇、30%乙醇共8種溶劑對(duì)各成分的提 取效率進(jìn)行了比較，龍膽苦昔、梔子昔、黃苓昔在50%甲醇 中均有較好的提取效率，故選擇50%甲醇作為測(cè)定樣品的提 取溶劑。采用超聲提取10、20、30、40、50 min及加熱回 流提取20、40、60、90 min共9種方法對(duì)提取效率進(jìn)行了 考察，結(jié)果認(rèn)為選擇超聲處理40 min為宜。分別采用不同品牌色譜柱phenomenex luna c18 (5 ?m, 250 mmx4. 6 nun)、techmate c18 (5 ?m, 250 mmx4. 6 mm)、 kromasil 100-5c18(5 ?m, 250 mmx4. 6 mm)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果龍膽苦昔、梔子昔、黃苓昔峰分別在各種色譜柱均