實驗技術習題

1、分子生物學常用實驗技術課堂練習題 參考答案學號： 姓名： 一、填空題。1. 在用SDS分離DNA時，要注意SDS濃度，0.1%和1%的SDS作用是不同的，前者 ，后者 。2. SDS是一種提取DNA時常用的陰離子去污劑，它可以溶解膜蛋白和脂肪，使細胞膜和核膜破裂，使核小體和核糖體解聚，釋放出 。它還可以使蛋白質(zhì)變性沉淀，也能抑制 。3. 在分離DNA時，需要帶手套操作，是因為 。4. 用酚-氯仿抽提DNA時，通常在氯仿或酚-氯仿中加入少許異戊醇，這是因為有機溶劑異戊醇可以 。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白質(zhì)相和下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。5. 在分離DNA時，

2、要用金屬離子螯合劑，如EDTA和檸檬酸等，其目的是： 。6. 在DNA分離過程中，造成DNA分子斷裂的因素很多，主要有： 、 和 。7. 在分離DNA時，常用酸變性、堿變性、熱變性和 來去除蛋白質(zhì)。8. 用乙醇沉淀DNA的原理是： 。9. 用乙醇沉淀DNA時，通常在DNA溶液中加入單價陽離子，如氯化鈉和乙酸鈉，其目的是 。10. 通?？稍?種溫度下保存DNA：45、-20和-70，其中以 為好。11. 濃縮DNA的方法通常有：包埋吸水法、蒸發(fā)法、膜過濾法和 。12. 堿裂解法和清亮裂解法是分離質(zhì)粒的兩種常用方法，二者的原理不同，前者是根據(jù) ，后者是根據(jù) 。13. 在 技術中，DNA限制性酶切片

3、段經(jīng)凝膠電泳分離后，被轉移到硝酸纖維素薄膜上，然后與放射性標記的DNA探針雜交。14. SSC是氯化鈉和檸檬酸鈉組成的試劑，其中前者作用是： ，后者的作用是： 。15. 在southern雜交中，DNA轉移的速度取決于 、 和 。16. 在重蒸酚中加入1%的8-羥基喹啉及少量-巰基乙醇，不僅可以防止酚氧化，還可以抑制 活性以及 。17. RNA分子經(jīng)凝膠電泳后按大小不同分開，然后被轉移到一張硝酸纖維素膜（尼龍膜）上，同一放射性DNA探針雜交的技術稱 _ _。18. 根據(jù)Northern雜交結果可以說明 _ _。19. cDNA技術是進行真核基因克隆的一種通用方法，因為它可以用 為模板。20.

4、將含有一個mRNA的DNA拷貝的克隆稱為一個 ，源于同一批RNA制備物的克隆群則構建成了一個 。21. 受體細胞的感受態(tài)是 的生理狀態(tài)。22. 感受態(tài)細胞是可以誘導的，誘導方法有 、 和 等。23. 人工感受態(tài)細胞的大腸桿菌在溫度為 時吸附DNA，在 時攝入DNA。24. 為了提高重組DNA分子對E . coli的轉化效率，通?？刹扇?和 。25. 環(huán)狀質(zhì)粒的轉化效率很低，通常是線性雙鏈DNA轉化效率的 。26. Sal是識別6個核苷酸的酶，其識別切割的理論值是每 個堿基就有一個切點，但在哺乳動物中大約300Kb個堿基才有一個切點。27. 重組DNA技術常用的限制性內(nèi)切核酸酶可識別某些特異堿基

5、序列，具有 結構。28. 產(chǎn)生平末端的方法通常有： 、 和 。29. 在酶切反應管加完各種反應物后，要離心2秒，其目的是： 和 。30. 連接酶是一類用于核酸分子連接形成 的核酸合成酶，有DNA連接酶和RNA連接酶之分。31. 為了防止載體DNA自身環(huán)化，可用 脫去雙鏈DNA的 。32. 用于克隆的DNA片段，在質(zhì)量上要求：1）穩(wěn)定性，保持其分子構型；2）低蛋白質(zhì)含量；3）純度要高，不含 ；4）不含可透析的小分子，如酒精等。33. 構建基因組文庫時連接方法主要是 ；而構建cDNA 文庫，可用 或 。34. 克隆一個編碼某種蛋白質(zhì)的基因必須考慮其表達的三個基本條件： 、 和 。二、判斷題。1.

6、氯霉素擴增DNA 時，加氯霉素的時間是重要的，因為加得太早，菌數(shù)不夠，加人時間過遲，菌齡過老，容易自溶。（ ）2. 在DNA 貯存液中加一滴三氯甲烷，可防止真茵的污染。（ ）3. DNA、RNA在pH8.5的TAE緩沖夜中電泳時，由正極向負極移動。（ ）4. 作為一個基因克隆的載體，主要由藥物抗性基因、供插入外源DNA片段的多克隆位點和外源片段插入篩選標志這3大部分構成。（ ）5. 用pUC質(zhì)粒作克隆載體克隆DNA時，人們用顯色法篩選重組質(zhì)粒，即在有IPTG和X-gal的平板上，顯示白色的菌落含有原始質(zhì)粒，而顯示藍色的菌落含有重組質(zhì)粒。（ ）6. 在克隆載體pUC系列中，完整的lacZ基因提供

7、了一個外源基因插入的篩選標記，藍色的轉化菌落通常表明克隆是失敗的。（ ）7. 在克隆載體pBSK質(zhì)粒中，利用完整的lacZ基因作為篩選標記，白色的轉化菌落表明重組質(zhì)?？隙ú迦胪庠雌?。（ ）8. X-gal顯色反應的基本原理是使載體與受體互補的失活。（ ）9. 堿法和煮沸法分離質(zhì)粒DNA的原理是不同的。（ ）10. 根據(jù)構建方法的不同，基因文庫分為基因組文庫、cDNA文庫等。（ ）11. 一旦有了一套已知序列的基因組克隆，通過從文庫中獲得覆蓋目的突變基因所在基因組區(qū)的所有克隆，就可以進行染色體步移。（ ）12. 核酸雜交的原理是根據(jù)分子間雜交。（ ）13. 在Northern雜交中，為了防止R

8、NA形成部分發(fā)夾結構，影響遷移率，所以要用變性緩沖液進行電泳。（ ）14. 用限制性內(nèi)切核酸酶Bgl（識別位點是AGATCT）酶切載體DNA，用BamH（識別位點是GGATCC）酶切供體DNA，可以直接通過粘性末端進行連接。（ ）15. 不匹配的粘性末端可以通過部分填補或補平后進行連接。（ ）16. 單克隆抗體是淋巴細胞和瘤細胞雜交后形成的單個雜交瘤細胞經(jīng)無性繁殖而生特異性抗體。（ ）17. 基因組學強調(diào)從基因組的整體而不是單個基因的角度把握生物體遺傳變異的規(guī)律。（ ）18. 利用足夠數(shù)量的STS標簽，可確定所有DNA大片段在染色體或基因組中的位置。（ ）19. clone contig法的原

9、理是首先用酸水解法把待測基因組降解為數(shù)10萬堿基對以上的片段，再分別對各片段進行測序。（ ）20. 靶標鳥槍法首先根據(jù)染色體上已知基因或遺傳標簽的位置來確定部分DNA片段的排列順序，再逐步確定各片段在染色體上的相對位置。（ ）三、單項選擇題。1. 乙醇沉淀DNA時，下列何種長度的核苷酸不能被沉淀？ _ A、10bp；B、100bp；C、200bp； D、1000bp。2. 用堿法分離質(zhì)粒DNA的基本原理是：_ A、染色體DNA斷裂成碎片； B、染色體DNA 分子量大，不能釋放； C、染色體DNA變性后來不及復性；D、染色體DNA未與蛋白質(zhì)分開而沉淀。3. Southern雜交可檢測_： A、目

10、的基因的表達豐度B、基因組中目的基因的存在 C、蛋白質(zhì)表達 D、目的基因是否表達4. 蛋白質(zhì)雙向電泳中，_決定了SDS-蛋白質(zhì)復合物在凝膠電泳中的遷移率。 A、等電點B、相對分子量C、空間結構D、電荷量5. 粘末端連接法，不僅操作簡單，而且 _ A、產(chǎn)生新切點；B、易于回收外源片段；C、載體不易環(huán)化；D、影響外源基因表達。6. 下面哪一種不是產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶星號活性的主要原因：_A、酶切反應體系中酶濃度過低；B、甘油含量過高；C、酶切反應體系中含有有機溶劑；D、含有非鎂離子的二價陽離子。7. 關于cDNA 的最正確的提法是：( ) A、同mRNA互補的單鏈DNA ； B、同mRNA 互補的雙鏈

11、DNA；C、以mRNA為模板合成的雙鏈DNA； D、以上都正確。8. 在分離mRNA的溶液中，Mg2+離子的濃度不能低于0.5m mol/L，因為低了_A、mRNA會降解；B、mRNA會沉淀；C、核搪體解體； D、mRNA會變性。9. 關于類限制性內(nèi)切酶的作用，下列不正確的是：_A、識別序列長度一般為4-6bp； B、識別序列通常具有回文結構；C、識別和切割雙鏈DNA分子； D、只能切割非甲基化序列。10. 有關PCR的描述下列哪項不正確？_A、是一種酶促反應； B、引物決定了擴增的特異性；C、擴增的對象是DNA序列；D、擴增的對象可以是氨基酸。11. PCR試驗的特異性主要取決于：_A、DN

12、A聚合酶的種類； B、反應體系中模板DNA的量；C、引物序列的長度和結構； D、PCR buffer中的鎂離子濃度12. 藍白斑試驗篩選時，加入IPTG的作用是： _ A、誘導肽的合成； B、作為酶作用的底物； C、誘導肽的合成； D、作為顯色反應指示劑。13. 基因敲除（knock out）方法主要用來闡明： _ A、基因的結構；B、基因的調(diào)控；C、基因的表達；D、基因的功能。14. _利用單鏈小RNA高效、特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA，從而阻斷體內(nèi)靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。 A、RNA干擾技術；B、原位雜交技術； C、RACE技術； D、點突變技術。四、名詞解釋。1. 載體：

13、2. 限制性核酸內(nèi)切酶：3. cDNA：互補DNA，指以mRNA為模板反轉錄得到的DNA。4. 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）：5. RT-PCR (reverse transcription PCR)：以mRNA為模板先逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行聚合酶鏈式反應。6. Real-time PCR：7. cDNA文庫（cDNA library）：8. 基因文庫（gene library）：9. 定點突變技術（site-directed mutagensis）：10. 酵母單雜交系統(tǒng)（yeast one-hybrid system）：提

14、示：該系統(tǒng)目的：用于鑒定DNA和蛋白質(zhì)之間的相互作用。11. 酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system）：提示：該系統(tǒng)目的：鑒定反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉錄調(diào)控的影響。12. 凝膠阻滯試驗（electrophortic mobility shift assay, EMSA; gel retardation）：13. RACE（Rapid amplification of cDNA End）技術：14. RNA干擾（RNA interference，RNAi）：15. 核酸雜交，southern blotting，Northern blotting，wester

15、n blotting16. 轉化17. DNA芯片18. 基因組學19. 功能基因組學20. 比較基因組學（comparative genomics）21. 蛋白質(zhì)組學22. 轉錄譜（expression profiling）23. 表達序列標簽（expressed sequence tag, EST）五、簡答題：1. 在分離DNA過程中，為什么苯酚和氯仿聯(lián)合使用？即使不聯(lián)合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次？提示：原因是酚和水有一定程度的互溶，所以單獨使用酚抽提DNA，最終不能除去酚，殘留的酚會使限制性核酸內(nèi)切酶、Taq酶和連接酶變性，影響后續(xù)試驗。氯仿也是蛋白質(zhì)變性劑，它不與水互溶，但它

16、與苯酚互溶。這樣，兩者聯(lián)合使用，可讓DNA溶液中沒有殘留酚。2. 比較說明SDS-PAGE（SDS-聚丙烯胺凝膠電泳）與瓊脂糖凝膠電泳的分離原理和特點。提示：SDS-PAGE：1）SDS作用；2）分子篩；3）主要用于蛋白質(zhì)的定性分析、分離。瓊脂糖凝膠電泳：1）凝膠的孔徑；2）用于蛋白質(zhì)和核酸電泳，雙鏈DNA的電泳遷移率主要與其分子大小有關。3. 簡述PCR擴增的原理及過程。提示：PCR技術的基本原理：在模板、引物、4種dNTP和賴耐熱DNA聚合酶存在的條件下，按照堿基互補配對的原則，特異擴增DNA區(qū)段。PCR的過程：變性-退火-延伸，三個基本步驟循環(huán)。4. 什么是藍白斑篩選？為什么藍白斑篩選法

17、也會有假陽性？提示：該法是利用組織化學的方法，通過插入失活來篩選重組體。原因是：-半乳糖苷酶的N端不是必須的，對其修飾不會影響酶的活性或肽的互補性。如果插入的外源片斷引起肽ORF的移碼，或外源片斷含有終止密碼使得肽不表達，就會形成白色斑。如果插入的片斷不含終止密碼、是3的倍數(shù)，仍然會形成藍色斑。5. 酵母單雜交的原理。很多真核轉錄調(diào)控因子有兩個相互獨立的結構域組成：DNA結合域（DNA binding domain, BD）和轉錄激活域 (activation domain, AD)。BD能和特定的基因的啟動子區(qū)結合，但不能接獲基因的轉錄。 酵母單雜交是一種研究DNA和蛋白質(zhì)互相作用的系統(tǒng)，運

18、用基因重組技術將特定順式作用元件構建到基本啟動子上游，把報告基因連接到基本啟動子下游。將待測轉錄因子cDNA與已知酵母激活域（AD）融合表達載體轉入酵母，如果待測轉錄因子能和順式作用元件結合，就能激活基本啟動子，從而激活報告基因的表達。6. 現(xiàn)已知一種蛋白因子可以與DNA上的一段100bp的專一序列結合，請設計出克隆這種蛋白因子的cDNA的基本技術路線。提示：酵母單雜方法。7. 從GenBank中查到某一基因的cDNA序列，如何得到該基因的內(nèi)含子序列？提示：根據(jù)cDNA序列設計引物，以基因組DNA為模板PCR，產(chǎn)物測序后，序列比對。8. 從GenBank中查到某一基因的完整ORF序列，如何得知

19、其mRNA的加帽和加尾信息？提示：5-RACE和3-RACE。9. 轉錄因子一般具有轉錄激活域和DNA結合域，簡述它們的作用。DNA識別或結合域能和特定的基因的啟動子區(qū)結合，但不能接獲基因的轉錄。對各種轉錄因子的序列進行比較，可發(fā)現(xiàn)其基序(motif)的共同點是都與DNA結合。基序通常很短，僅為蛋白質(zhì)結構中的一小部分。在蛋白質(zhì)與轉錄裝置相互作用中，負責激活轉錄的基序可以被鑒定出來。轉錄激活結構域可以在適當?shù)目臻g激活轉錄。10. 簡述凝膠阻滯試驗（EMSA）的原理。EMSA 是體外分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術，用放射性同位素標記待測DNA片段，然后與提取物溫育，形成DNA-

20、蛋白質(zhì)復合物，電泳后用放射性自顯影技術可以確定DNA條帶的位置，從而確定它與蛋白質(zhì)是否結合?；驹恚旱鞍踪|(zhì)與DNA結合后，將大大增加DNA分子量，在凝膠電泳中，DNA朝正電極移動的距離與其相對分子量成正比。沒有結合蛋白質(zhì)的DNA移動較快，結合了蛋白質(zhì)的DNA由于受到阻滯移動較慢。11. 現(xiàn)在已知一個基因的啟動子序列（包括其順式作用元件和基本啟動子），如何找到調(diào)控該基因表達的反式作用因子？提示：有多種方案。EMSA是其一。12. 簡述sanger DNA測序法的原理和基本過程。 雙脫氧測序法原理：2',3'-ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們在脫氧核糖的3' 位置

21、缺少一個羥基，可以在DNA聚合酶作用下通過其5' 三磷酸基團摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于沒有3'羥基，它們不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鏈，因此，正在增長的DNA鏈不可能繼續(xù)延伸。核酸模板在核酸聚合酶、引物、4種單脫氧堿基存在條件下復制或轉錄時，如果在四管獨立的酶反應系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5端，以雙脫氧堿基為3端的一系列長度不等的核酸片段，其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離。反應終止后，分四個泳道進行電泳。

22、以分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個堿基)，根據(jù)片段3端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序?；具^程： 1）分離待測核酸模板，模板可是DNA，也可是RNA，可是雙鏈，也可是單鏈。 2）在4只試管中分別加入適當?shù)囊?、模板?種dNTP(包括放射性標記dATP，例如32P標記的dATP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉錄酶），再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddNTP(雙脫氧核苷酸)。 3）與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理)結合的引物，在DNA聚合酶作用下從5端向3端進行延伸反應，32P隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddNTP摻入時，由于它在3位置沒

23、有羥基，故不與下一個dNTP結合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產(chǎn)生一系列不同長度的新的DNA鏈。 4）用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同時分離4只反應管中的反應產(chǎn)物，由于每一反應管中只加一種ddNTP(如ddATP)，則該管中各種長度的DNA都終止于該種堿基(如A)處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA 3 末端都為同一種雙脫氧堿基。 5）放射自顯影。根據(jù)四泳道的編號和每個泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。13. 如何用PCR法獲得點突變DNA分子？指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿

24、基的添加、刪除、點突變等。采用具有互補末端的引物，使產(chǎn)物形成了重疊鏈從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。該技術主要包括以下幾步：設計引物，擴增基因兩端，回收兩端片段，兩端片段退火延伸，擴增全長基因。實驗步驟：1） 引物設計：引物F及R為基因兩端特異引物，其中Fm及Rm為中間引物。其中引物Fm及Rm中間共享一段序列（至少10bp完全匹配，否則后續(xù)實驗很難成功），突變點可以設計在Fm或Rm，也可以兩條引物上都有突變點；2）分別用引物F和Rm及Fm和R進行配對用pfu酶進行PCR；3）分別用膠準確回收第2步所得兩條目的PCR產(chǎn)物帶；4）將第3步所得兩份PCR產(chǎn)物

25、進行混合使其互為模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶進行5-10輪PCR。5）取第4步PCR產(chǎn)物做為模板，加入引物F及R進行PCR擴增出具有突變的全基因。14. 什么是RNAi？試述其應用和發(fā)展前景。RNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是由雙鏈RNA（dsRNA）介導的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達?；蚴荝NAi是有dsRNA參與指導的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標的轉基因沉默現(xiàn)象。應用：1）RNAi方法在植物遺傳及發(fā)育等研究領域得到廣泛的應用。通過基因敲除來調(diào)控某個代謝途徑的關鍵基因，篩選出目的性狀改良

26、的個體，如抗病或耐旱植株。Gutterson等敲除了康乃馨的一種激素，使花期延長。多聚半乳糖醛激酶在西紅柿成熟時消化細胞壁，Zenera實驗室將它敲除后，西紅柿可晚一些采摘，味道變得更為鮮美。2）RNAi是研究候選基因功能、信號轉導通路的新方法。從大規(guī)模數(shù)據(jù)庫中獲得全基因組序列，找到感興趣基因的序列，據(jù)此設計出使該基因沉默的dsRNA，研究該候選基因沉默或下調(diào)后的性狀表現(xiàn)，從而探討該候選基因的功能。Clemens等應用RNAi亦研究了果蠅細胞系中胰島素的信號轉導通路。15. 獲得一個功能未知的基因克隆后，怎樣才能闡述該基因的功能？提示：對此基因進行定位，運用基因敲除或RNAi技術封閉此基因，尋

27、找蛋白表達的差異和生物體遺傳表型的差異，通過研究熒光探針定位此蛋白的分布，通過研究蛋白與蛋白相互作用確定其在細胞中的功能。16. 如果知道某基因的功能及其相應得蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成，可以通過何種方法克隆該基因？提示：可以通過合成核苷酸探針或設計兼并PCR引物從基因組文庫（或cDNA）文庫中篩選。或者利用相應的抗體從cDNA表達文庫中篩選相應的克隆。17. 常用的基因表達研究技術有哪些？18. 什么是遺傳圖譜？答案1：遺傳圖又稱為連鎖圖，是指標志基因或DNA在染色體上的相對位置與遺傳距離，后者通常以基因或DNA 片段在染色體交換過程中的分離頻率（厘摩，cM ）來表示，cM 值越大，兩者之間距離

28、越遠。遺傳圖的繪制方法是以染色體上某一點為遺傳標記，以與之相伴的遺傳特征為對象，經(jīng)連鎖分析，測定遺傳距離，將編碼該特征的基因定位于染色體特定位置。連鎖分析的實質(zhì)是通過分析同一遺傳位點在不同個體中等位基因的不同來研究同一染色體上兩個位點之間的相互關系，科學上用減數(shù)分裂過程中這兩個位點之間的交換或重組頻率來表示其遺傳學距離。答案2：通過遺傳重組所得到的基因在具體染色體上線性排列圖稱為遺傳連鎖圖。它是通過計算連鎖的遺傳標志之間的重組頻率，確定他們的相對距離，一般用厘摩(cM，即每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%)來表示。繪制遺傳連鎖圖的方法有很多，但是在DNA多態(tài)性技術未開發(fā)時，鑒定的連鎖圖很少，隨著DNA多態(tài)性的開發(fā)，使得可利用的遺傳標志數(shù)目迅速擴增。早期使用的多態(tài)性標志有RFLP(限制性酶切片段長度多態(tài)性)、RAPD(隨機引物擴增多態(tài)性DNA)、AFLP(擴增片段長度多態(tài)性)；80年代后出現(xiàn)的有STR(短串聯(lián)重復序列，又稱微衛(wèi)星)DNA遺傳多態(tài)性分析和90年代發(fā)展的SNP（單個核苷酸的多態(tài)性）分析。 19. 什么是物理圖譜？答案1：物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標簽位點，即STS；或是一類