廣州大學生物工程下游技術實驗(超氧化物歧化酶SOD)資料

1、生物工程下游技術實驗“超氧化物歧化酶SOD的分離純化技術”姓名： 學號：指導老師：柯德森； 同組者：； 時間: 摘要： 通過對綠豆種子的研磨破碎獲得SOD粗酶，經(jīng)過硫酸銨分級分離、透析除鹽和濃縮等過程，除去粗酶液中的雜質(zhì)及干擾蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝膠層析得到純化的SOD酶。跟蹤提純過程活性的分布，并評價提取過程各步驟的效率。實驗結(jié)果證實隨著不斷的分離提純，總活力不斷減小，比活力不斷上升，總純化倍數(shù)為1.03，活性得率為8.92%。一、 前言 超氧化物歧化酶(superoxide dsdismutase，SOD)是需氧化物中以超氧陰離子為底物的一種酶，廣泛存在于各種生

2、物中。SOD不僅在生物體內(nèi)對抗氧化、解毒起重要作用，也有延緩機體衰老、抗腫瘤及抗免疫性疾病等功能，因而受到極大關注。SOD屬于金屬酶，其理化性質(zhì)不僅取決于蛋白質(zhì)部分，而且還取決于結(jié)合到活性部位的金屬離子。按照結(jié)合的不同金屬離子，生物體中SOD有Cu、Zn-SOD、Mn-SOD和FesOD三種，但近幾年發(fā)現(xiàn)低等生物中尚存在含Ni的SOD。在已發(fā)現(xiàn)的酶中，超氧化物歧化酶 (SOD)是需氧生物和耐氧生物的體內(nèi)清除超氧化物自由基的酶超氧 自由基在體內(nèi)的過多積累將可能引發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷DNA，使脫水酶失活，使線粒體中的NADH脫氫酶NADH氧化酶磷酸腺苻酶 (ATPase)失活，從而易引起生物體發(fā)疾病或

3、衰老。自從1968年McCord與Fridovich發(fā)現(xiàn) SOD及其催化超氧化物自由基歧化為 O2 與H2O以來，SOD一直以來被認為是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶。根據(jù)近10年的研究報告表明，SOD具有清除超氧化物自由基，防止其對機體直接或間接的損傷；使O2成為細胞內(nèi)自由基的排污漕；調(diào)節(jié)機體內(nèi)O 的水平；調(diào)節(jié)機體內(nèi)NO水 和催化反應產(chǎn)物H2 O2等作用?，F(xiàn)在在日常生產(chǎn)應用中，多以動物血液中提取SOD。但是動物血液中的疾病很多，價格也比較昂貴。從植物中提取SOD就可以相應的解決上述問題，類似綠豆芽這種植物，其成本低廉，且SOD的含量豐富，又無污染，將其大量應用于生產(chǎn)有著很好的發(fā)展前景。本實驗以綠豆

4、為原料提取SOD，通過各步的分離提純，應測得酶總活力逐漸減小，比活逐漸升高.通過本實驗掌握物質(zhì)分離純化的實驗設計過程，以及硫酸銨分離、透析除鹽、濃縮和葡聚糖凝膠層析等物質(zhì)分離技術。二、實驗材料與方法：<一>材料:綠豆種子,市售新鮮綠豆種子浸泡蒸餾水24小時備用。<二>試劑:葡聚糖（sephadexG-100或G150）, NaCl（AP）, 磷酸氫二鈉（AP）, 磷酸二氫鈉（AP）, 三羥甲基氨基甲烷（Tris）, 鹽酸（濃鹽酸），硫酸銨（AP）, PEG6000, 考馬斯藍G250 , 磷酸 ，乙醇（AP） ， 牛血清蛋白BSA , 連苯三酚(焦性沒食子酸), 甲硫氨

5、酸( methionine) , NBT（氮蘭四唑 Nitroblue Tetrazdinna）, 核黃素 , EDTA(鈉鹽) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）, <三>儀器:離心機WFZ-UV2000 型紫外分光光度計201×7（717）強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂 勻漿機、各型號燒杯、試管、量筒、帶毛塞試管、漏斗、移液槍、移液管、玻璃棒等<四>實驗方法和步驟：1材料處理和取樣1）25g綠豆,洗滌，蒸餾水浸泡過夜，加入250 ml pH7 0.05 mol/L pb液，勻漿機勻漿，二層紗布過濾，離心（3000 rpm）得清液，取少量樣為樣，進行SOD活

6、性測量，計算材料中SOD總活性單位及比活性單位（units/mg Pr）2）實驗流程：1. 稱量25g 綠豆+250ml pH7 0.05 mol/L pb液，勻漿，兩層紗布過濾，離心（3000rpm）15Min 取清液，取少量樣為樣，測量SOD活性、蛋白質(zhì)含量測量，計算SOD總活性單位及活性單位。2. 所得清液測量總體積，緩慢40飽和（NH4）2SO4 至濃度為19.4g/100ml，4冰箱靜置分層。3. 離心（3000rpm） 取清液，取少量為樣，測量SOD活性、蛋白質(zhì)含量測量，計算SOD總活性單位及活性單位。4. 步驟3中的清液緩慢加入硫酸銨至75%飽和度（8.7g/100ml）（過程充

7、分攪拌），5至分層，離心（3000rpm） 取沉淀，取樣，計算SOD總活性單位及活性單位。5. 裝入透析袋中，于蒸餾水中5透析過夜。6. 透析后溶液用濾紙過濾得清液，重新裝入透析袋中用PEG濃縮。7. 裝柱：1）排氣泡 加蒸餾水 留15體積水2）100mL G100 一次裝完 3）靜置10min 打開出液口 排過量洗脫劑 4）保留離膠面23cm 接洗脫瓶 平衡30min 理想流速注意 膠面始終保持水層 洗脫瓶：pH7, 0.02MPb8. 層析過程樣品：濃縮液 離心 過濾 體積31mL 取樣上樣：5上樣量23mol洗脫:1mL/min,3mL/支，共收100120mL *測（1）A280值 （

8、2）SOD活性（粗略） 20支管 每支3mL （3）搜集活性峰并測酶活性2植物超氧化物歧化酶（SOD）活性測量1）連苯三酚法測定SOD活性： 溶液配制：1， 連苯三酚：630 mg-®100 ml 10 mmol/L HCl (0.085 ml 36%的濃HCl ，用蒸餾水配成100 ml)。共配500ml.2， pH 8.30 50 mmol/L Tric-HCl： A) 0.1 mol/L Tris: 12.114g-1000 ml (儲備液)B) 0.1 mol/L HCL: 濃鹽酸稀釋得到（8.5 ml 36%的濃HCl ，用蒸餾水配成1000 ml）(儲備液)0.05mol

9、/L pH 8.3: 500ml A+199ml B-定容到1000ml.操作：25°C，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL 緩沖液，加入10 ml 50 mmol/L 連苯三酚（具體加入量應每次測量前校正，加入的原則是使下面的A325變化控制在0.07 min左右），迅速搖勻，倒入光徑1 cm的比色杯(應該用石英杯)中，每秒測一次值，自氧化速率的變化（D）控制在0.07 min左右，加入酶液后再測連苯三酚自氧化速率的變化（D），酶量的加入控制在使加樣后的D在0.035/min左右。（以上DD的變化值不需特別嚴格，D只要控制在0.1以下0.04以上，D變化

10、在D的約一半左右即可）3考馬斯藍G-250測蛋白的方法：實驗器材:分光光度計,試管及試管架,比色皿,移液管;移液槍實驗材料與試劑:l 考馬斯亮藍G-250 (0.01%, W/V): 100mg 考馬斯亮藍G250溶于50ml 95%的乙醇中,加入100ml 85% 的磷酸,將溶液用水定容到1000 ml,過濾得清液于棕色瓶中備用.l 標準蛋白質(zhì)溶液:牛血清蛋白(BSA)用蒸餾水配成0.1mg/mll 待測樣品液:S1,S2 (3顆綠豆10ml水-研磨-離心2500rpm得清液),S3,S4為原液稀釋10倍（S1S2S3S4均為樣品體積，S3和S4不一定做，在未知樣品蛋白含量時可先設計一個濃度

11、梯度以保證測量值在標準曲線的線性范圍內(nèi)）操作方法:1. 牛血清蛋白標準曲線的制作:按下表加入試劑,混勻靜置2分鐘,以1號管為空白調(diào)零點,測下各管的A595值,以吸光值(A595)為縱坐標,每管蛋白質(zhì)含量為橫坐標作出標準曲線.試管號123456S1S2S3S4標準蛋白/µl0100200300400500樣品體積/µl5010050100每管中蛋白含量/(µg)01020304050水/ul5004003002001000450400450400G-250染色液/ml3333333333室溫靜置2minA5952. 樣品蛋白質(zhì)含量測定:取未知濃度的蛋白質(zhì)(通過適當稀

12、釋使其濃度控制在測量有有效范圍內(nèi)),加到試管內(nèi),再加入G250染色液3ml混勻,測其595nm下的吸光度,對照標準曲線求出蛋白質(zhì)含量,計算其濃度.（表示為mgPr/g材料） 4比活力、得率及純化倍數(shù)計算：SOD的比活力為=總活力（units）/總蛋白量（mg）SOD總得率為：總得率=最后樣品活率/樣1活率*100%純化倍數(shù)=比活2/比活1三、結(jié)果與討論：<一> SOD活性及蛋白質(zhì)測定結(jié)果：1蛋白質(zhì)含量測定：表1. 牛血清制作蛋白質(zhì)標準曲線（蛋白質(zhì)含量/ ug）蛋白質(zhì)含量/ug010203040506070OD值00.1740.2690.3420.4290.5480.6900.767

13、圖1. 牛血清制作蛋白質(zhì)標準曲線（蛋白質(zhì)含量/ ug）<二 >硫酸銨分級分離、透析除鹽和濃縮過程表2. 連苯三酚自氧化速率(A325)連苯三酚/ulA樣100.070樣120.071樣150.075樣100.073表3. 連苯三酚測樣品SOD活性(A325)連苯三酚/ul酶/ulA樣101000.031樣12800.036樣151100.039樣10400.038表4. 考馬斯藍G-250測樣品蛋白含量(A595)：樣品體積/ulOD平均值（nm）樣300.347樣500.681樣600.839樣50 0.868 根據(jù)蛋白質(zhì)標準曲線求出蛋白質(zhì)含量：樣 29.651ug樣 61.16

14、0 ug樣 76.066 ug樣 78.802ug<三 >葡聚糖凝膠層析分離純化SOD實驗結(jié)果表4. 葡聚糖G100凝膠層析洗脫曲線（以A280吸收作為蛋白質(zhì)含量的相對值）試管號（1）（2）（3）（4）（5）吸光值(nm)0.0791.1450.5910.1840.082試管號(6)(7)(8)(9)(10)吸光值(nm)0.0550.0490.0490.0480.048圖2. 葡聚糖Sephadex G100凝膠層析分蛋白質(zhì)洗脫曲線經(jīng)連苯三酚粗測，（3）號管顏色最淺，而根據(jù)蛋白質(zhì)洗脫曲線看出（3）號管位于蛋白質(zhì)含量峰上，所以選取（3）號管作為目的試管收集SOD，測量其準確SOD活

15、力和蛋白含量，計算SOD比活力。連苯三酚自氧化速率:連苯三酚=12ul; A=0.075表6. 連苯三酚測樣品SOD活性(A325)試管號連苯三酚/ul樣品/ulA101500.038 101500.042101500.045101500.042101500.046101500.051 101500.041101500.045101500.049101500.050考馬斯藍G-250測樣品蛋白含量: 樣品體積=50ul OD平均值=0.366nm則根據(jù)蛋白質(zhì)標準曲線求出蛋白質(zhì)含量=31.443ug計算得：1.比活力的計算加入酶量相當?shù)拿富盍挝?unit)=（A-A）/A*2樣 (0.070-

16、0.031)/0.07*2=1.11樣 (0.071-0.036)/0.071*2=0.99樣 (0.075-0.039)/0.075*2=0.96樣 (0.073-0.038)/0.073*2=0.96試管（3） (0.075-0.038)/0.075*2=0.99提取液的總活力(unit)=加入酶量相當?shù)拿富盍挝?（反應液總體積/取樣液體積）*稀釋倍數(shù)樣 1.11*（200/0.100）=2220樣 0.99*（170/0.080）=2103.75樣 0.96*（150/0.110）=1309.1樣 0.96*（50/0.040）=1200試管（3） 0.99*（20/0.100）=19

17、8總蛋白量（mg）=（反應液總體積/取樣液體積）*取樣液蛋白含量樣 （200/0.030）*0.029651=197.67樣 （170/0.050）*0.061160=207.94樣 （150/0.060）*0.076066=190.165樣 （50/0.050）*0.078802=78.802試管（3） （20/0.050）*0.031443=12.58SOD的比活力為=總活力（units）/總蛋白量（mg）樣 2220/197.67=11.23樣 2103.75/207.94=10.12樣 1309.1/190.165=6.88樣 1200/78.802=15.23試管（3）198/12.

18、58=15.732.得率的計算得率=本次總活力/上次總活力*100%（1）2103.75/2220*100%=94.76%（2）1309.1/2103.75*100%=62.23%（3）1200/1309.1*100%=91.67%（4）198/1200*100%=16.5%SOD總得率=最后樣品活力/樣1活力*100% =198/2220*100% =8.92%3.純化倍數(shù)的計算純化倍數(shù)=比活2/比活1（1） 10.12/11.23=0.90（2） 6.88/10.12=0.67（3） 15.23/6.88=2.21（4） 15.73/15.23=1.03圖3.各純化步驟中SOD總酶活變化趨

19、勢 圖4.各純化步驟中SOD總蛋白含量變化趨勢圖5. 各純化步驟中SOD比活變化趨勢1.可以看出，在25g綠豆中隨著不斷的分離提純，總活力不斷減小，比活力先下降后上升，最后總純化倍數(shù)為1.03，活性得率為8.92%，達到預期效果。2. 為什么要從植物中提取SOD？初步驗證階段。國外SOD主要應用于醫(yī)療、保健方面，有以動物血液及內(nèi)臟為原料制取SOD的報導，但存在著成本高、含有致熱因子等缺陷，因此，適用范圍極為有限。尤其是近年來受“瘋牛病”的影響，許多國家和地區(qū)抵制以動物血液及內(nèi)臟為原料制取的超氧化物歧化酶，使得超氧化物歧化酶在國際市場上極為緊缺。從植物，特別是人們?nèi)粘＝?jīng)常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及糧食中提取SOD，使用安全性非常高，避免了可能發(fā)生的交叉感染。利用全新的生物技術從植物中提取SOD，具有明顯的社會和經(jīng)濟效益，市場前景廣