冷凍電鏡技術(shù)

1、實用標準文案冷凍電鏡技術(shù)課程學(xué)習(xí)報告一、課程所講基礎(chǔ)知識回顧1、電子顯微鏡成像技術(shù)的發(fā)展歷史（1）上世紀 50 年代的負染技術(shù)（分辨率 2mm） ：該技術(shù)的原理為重金屬燃料與 h 結(jié)合， 特點為對電子散射強， 視野暗， 襯度大，易觀察到生物材料。但不足之處在于染料顆粒較大，不易進入分子內(nèi)部。此外，因樣品需要脫水處理，會造成結(jié)構(gòu)失真。（2）上世紀 60 年代的三維重構(gòu)技術(shù)三維重構(gòu)的數(shù)學(xué)原理為傅里葉變換， 其關(guān)鍵性質(zhì)為：三維函數(shù)投影的傅里葉變換等于該三維函數(shù)傅里葉變換在垂直于投影方向上的中央截面。因此，通過對待測立體物質(zhì)的多角度投影信息采集，可以借助數(shù)學(xué)的橋梁，重構(gòu)出該物質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。顯然，對待測

2、物質(zhì)投影采集的角度越多，越精確，重構(gòu)出的三維圖像越接近真實。在 60 年代，t4 噬菌體的結(jié)構(gòu)通過該方法被成功解析。（3）上世紀 70 年代的電子晶體學(xué)即根據(jù)電子衍射的花樣確定物質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。 被觀測的物體通過物鏡形成衍射圖樣， 而這些衍射光束的低散射角部分再通過透鏡而形成顯微像。該方法相當于對原物體進行兩次傅里葉變換，一為將物體轉(zhuǎn)換成衍射譜，二為逆傅里葉變換使衍射譜重構(gòu)成顯微圖像。在 70 年代，電子晶體學(xué)的發(fā)展使得第 1 個膜蛋白結(jié)構(gòu)被成功解析。（4）上世紀 80 年代的快速冷凍技術(shù)（分辨率達到 0.2nm）主要原理為將樣品快速冷凍在玻璃態(tài)的水中， 樣品不需脫水，結(jié)構(gòu)與在溶液精彩文檔實用標

3、準文案中相同，呈天然狀態(tài)。因此，電鏡成像得到的更接近原物質(zhì)的真實結(jié)構(gòu)，且分辨率高。2、冷凍電鏡技術(shù)介紹（1）關(guān)于玻璃態(tài)冰：冰的結(jié)構(gòu)多種多樣，包括六角形冰、立方體冰等，其物理狀態(tài)與冷凍速率有關(guān)。若要形成玻璃態(tài)（即無定形態(tài)）的冰，需要冷凍速率達到每秒鐘 10 攝氏度。4此時，冰的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)各向同性，不會因成像角度不同導(dǎo)致圖像產(chǎn)生偏差。（2）操作步驟概要：冷凍包埋轉(zhuǎn)移至液氮或液氦中觀測，圖像采集三維重構(gòu)（3）圖像采集的質(zhì)量要求：應(yīng)保證樣品在玻璃態(tài)冰中的分布均一，厚度一致切適當，避免污染。此外，特別應(yīng)注意的是，該方法對電子劑量很敏感，最適為10e/a，明顯超過最適劑2量即容易因受到過量電子輻射而破壞物理

4、結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致冰迅速汽化，出現(xiàn)氣泡，造成圖像采集不成功。因此，必須采用低劑量技術(shù)（20e/a） ，用 1k3k 倍的低倍鏡尋找，在目2標域的臨近區(qū)聚焦，使記錄區(qū)域僅在拍攝時（1s 左右）受到電子輻射，保證樣品不被損壞。二、課外補充學(xué)習(xí)：冷凍電鏡技術(shù)難點的擴展閱讀1、冰晶污染冰晶污染是冷凍電鏡的主要問題和最重要的難點， 可發(fā)生在冷凍電鏡的各個步驟。在每個步驟中，冰晶污染的形成的主要原因不同。精彩文檔實用標準文案在冷凍制樣階段，冰晶污染形成的原因主要有三點：（1）冷凍速率不夠；（2）冷卻劑的溫度未接近凝點；（3）容器邊緣的小冰晶墜入液氮中黏附在樣品上，或在樣品轉(zhuǎn)移過程，空氣中的水分子凝結(jié)在樣品表面。2

5、、電子輻射損傷電子輻射損傷的原因幾乎均可歸結(jié)為熱效應(yīng)， 被輻照區(qū)域的損傷大致可分為晶化、升華、起泡和漂移 4 種類型。（1）晶化與電子束的加速電壓和電子劑量有關(guān)，一般發(fā)生在樣品表面，玻璃態(tài)的冰晶化形成立方晶相，失去各向同性。（2）升華也發(fā)生在樣品表面，本身現(xiàn)象與電子劑量無關(guān)，但是升華速率與電子劑量有關(guān) 電子輻射會增加樣品表面分子的動能，從而增加樣品表面分子脫離樣品表面的幾率。（3）起泡對于較厚的含水樣品。非彈性散射將造成能量沉積，大部分發(fā)生在接近樣品表面的內(nèi)層，此外，水是熱的不良導(dǎo)體，因此會出現(xiàn)起泡現(xiàn)象。隨電子劑量的增加，起泡的范圍和形態(tài)也會有所不同。（4）漂移樣品的物理漂移來自于樣品本身的形

6、變，而樣品的象漂移原因為電子在樣品內(nèi)的沉積，對電子束的偏轉(zhuǎn)方向產(chǎn)生影響。一般來說， 使用盡可能低的電子劑量和盡可能小的照明光斑是避免上述四種輻射損傷的最佳方法。精彩文檔實用標準文案3、圖像去噪由于冷凍電鏡特殊的低電子劑量和低襯度成像技術(shù)， 使得圖像反差弱， 信噪比低，不易提取有效的結(jié)構(gòu)信息。而濾波是圖像去噪的主要方法。其原理為將信號和噪聲都視為隨機信號，利用它們不同的統(tǒng)計特征， 通過最小方差估計某點的最似信號類型，若為噪點則予以除去。此外， 圖像增強和圖像復(fù)原也可相對地減輕噪點對信號圖像的影響，其中圖像增強是將人們主觀感興趣的部分亮度提高，而圖像復(fù)原則是針對圖像中客觀存在，但受到了噪點干擾（稱

7、為退化）的樣品信號，將它們的結(jié)構(gòu)性信息予以恢復(fù)。對于圖像增強，一般會綜合采用濾波、掩模、灰度變換、直方圖均衡化等方法對感興趣區(qū)域的信息進行增強；而圖像復(fù)原的典型方法是根據(jù)先前的樣品經(jīng)驗，建立一個退化模型，以此模型為基礎(chǔ)采用濾波等手段處理，使得復(fù)原后的圖像符合一定的準則， 達到改善圖像質(zhì)量的目的。其中信嗓比是評價圖像復(fù)原程度的主要標準之一。三、我國冷凍電鏡技術(shù)的新應(yīng)用2011 年 1 月，中科院生物物理所利用冷凍電鏡平臺，獲得了呼腸孤病毒科的質(zhì)型多角體病毒近原子分辨率的三維結(jié)構(gòu)，并獨立構(gòu)建了全原子模型。這是我國首次利用冷凍電鏡技術(shù)解析生物大分子原子結(jié)構(gòu)模型， 也是世界上首次利用冷凍電鏡圖像獲得的

8、生物大分子復(fù)合體的全原子模型。該研究確認了呼腸孤病毒mrna 的流出通道，定位了該病毒的兩個甲基轉(zhuǎn)移酶，并揭示了該流出通道是如何引導(dǎo) mrna 依次經(jīng)過這兩個甲基轉(zhuǎn)移酶以完成“加帽”過程的。在論文atomic model of a cypovirus built from cryo-em structure精彩文檔實用標準文案provides insight into the mechanism of mrna capping中，研究人員通過冷凍電鏡技術(shù)，得出以下結(jié)論： （1）cpv 與其他呼腸孤病毒科相比，其主要衣殼蛋白缺乏特異的氨基酸序列，但它具有結(jié)構(gòu)保守的酶蛋白 vp3 和衣殼蛋白vp1

9、，表明具 turret 蛋白的呼腸孤病毒科的 mrna 轉(zhuǎn)錄機制和衣殼組裝機制有共性。 （2） cpv 五聚體 turret 蛋白頂部獨特的結(jié)構(gòu)組織區(qū)是其指導(dǎo) mrna 完成“加帽”過程的關(guān)鍵區(qū)域。 （3）cpv 的 vp5 蛋白由 rna 第 7 節(jié)段編碼，是由p50 蛋白在轉(zhuǎn)譯后分裂產(chǎn)生的。四、冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用前景隨生物成像技術(shù)的發(fā)展， 電鏡技術(shù)已不再限于單純的形態(tài)結(jié)構(gòu)研究，而發(fā)展為不同水平上的顯微學(xué)技術(shù)綜合應(yīng)用。同時，顯微學(xué)技術(shù)與細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等其他生命科學(xué)技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用正在成為研究熱點。例如，免疫細胞化學(xué)與電鏡技術(shù)相結(jié)合，使原位雜交技術(shù)已從理論走向?qū)嶋H，得到相當普遍的應(yīng)用。因此， 冷凍電鏡技術(shù)在對物質(zhì)細微結(jié)構(gòu)與功能的分析上必將極大地推動生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展。參考資料：1 尹長城老師現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)選修課內(nèi)容冷凍電鏡技術(shù)與冷凍電鏡圖像去噪研究d.中山大學(xué).20052 李鯤鵬atomic model of a cypovirus built from cryo-em structure3 cheng l, sun j. et vides insig