微衛(wèi)星位點篩選方法綜述(共10頁)

1、論文綜述微衛(wèi)星分子標(biāo)記篩選方法綜述摘要：微衛(wèi)星是一種短的串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)或簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR)。它作為一種重要的分子遺傳標(biāo)記，能較好地反映物種的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性變化，被廣泛應(yīng)用于實驗動物的研究。本文概述了獲得和富集微衛(wèi)星位點的常用方法。最簡便、最省時的方法是從從公共數(shù)據(jù)庫（如Genbank、EMBL、EST數(shù)據(jù)庫等）或已發(fā)表的文獻(xiàn)中查找到微衛(wèi)星位點，但只限于已經(jīng)有序列數(shù)據(jù)發(fā)布的物種；第二種方法是種間轉(zhuǎn)移擴(kuò)增，即從相近物種的數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點，或使用已有數(shù)據(jù)發(fā)表的遺傳距離相近物種的微衛(wèi)星標(biāo)

2、記。第三種方法是從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點，其中用于富集微衛(wèi)星的方法有引物法、磁珠雜交法、尼龍膜雜交法以及分子標(biāo)記技術(shù)法。關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星；分子標(biāo)記；實驗動物 微衛(wèi)星（Microsatellite），又稱為簡單序列重復(fù)（Simple Sequence Repeat , SSR），短串聯(lián)重復(fù)（Short Tandem Repeat STR），是以少數(shù)幾個核苷酸（一般16個）為重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù) DNA序列。微衛(wèi)星位點廣泛分布于真核生物的基因組中1，在植物基因組中平均每33 Kb存在一個20 bp長的微衛(wèi)星位點，而在哺乳動物中每 6 Kb存在一個20 bp長的微衛(wèi)星位點2。并且SSR的重復(fù)次數(shù)不

3、同和重復(fù)程度不同，使其呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。微衛(wèi)星標(biāo)記共顯性的特點使它能夠用于研究等位基因，區(qū)分二倍體（或多倍體）的純合體或雜合體，這是 AFLP、RAPD等顯性標(biāo)記所無法做到的。另外，微衛(wèi)星的特異性引物擴(kuò)增具有良好的重復(fù)性和保真性，方便各實驗室間的交流。目前，微衛(wèi)星標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用到基因連鎖與遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究、譜系和發(fā)育研究、疾病檢測以及品種鑒定、親本分析與個體、純系檢驗上。 隨著微衛(wèi)星標(biāo)記在圖譜上的豐富,將顯現(xiàn)出更大的優(yōu)勢。但微衛(wèi)星分析中引物的獲得需要預(yù)先獲知核酸序列,其廣泛應(yīng)用受限于從特定的物種中分離微衛(wèi)星位點的難度和花費。微衛(wèi)星標(biāo)記分離最大的困難是引物的獲得。同RAPD、AFL

4、P等遺傳標(biāo)記不同，微衛(wèi)星研究首先需要獲知位點的序列信息，以便從重復(fù)序列兩端側(cè)翼的保守序列中設(shè)計引物。因而微衛(wèi)星引物的開發(fā)是應(yīng)用該技術(shù)的關(guān)鍵。目前已知微衛(wèi)星位點的物種很有限，這是因為微衛(wèi)星位點的獲得需經(jīng)過克隆、雜交篩選、測序等步驟，因此需花費一定的人力、金錢，這限制了微衛(wèi)星標(biāo)記的大量使用。但近年來發(fā)展起來的各種微衛(wèi)星位點富集技術(shù)已在一定程度上解決了這個問題。已有的最常用的獲得微衛(wèi)星位點的方法包括：1.從公共數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點；2.遺傳距離相近物種間引物轉(zhuǎn)移擴(kuò)增；3.從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點。其中，最方便、最經(jīng)濟(jì)的方法就是從已發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得微衛(wèi)星引物，但該法在使用對象上，只限于已有引物

5、開發(fā)出的物種，而且引物的數(shù)量不會有所增加，只能停留在原有基礎(chǔ)上。對于近緣種引物的應(yīng)用，其適用范圍究竟有多大；原物種的微衛(wèi)星基因座在其他物種間轉(zhuǎn)移擴(kuò)增時，其多態(tài)性如何。這些問題使得在不同物種間共用微衛(wèi)星引物時，盲目性較大，可指導(dǎo)操作的理論依據(jù)不足。最好的途徑就是從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點并進(jìn)行引物的開發(fā)。1 從數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點 在上述三種方法中,最簡便最省時的就是從公共數(shù)據(jù)庫或已發(fā)表的文獻(xiàn)中查找到微衛(wèi)星位點。許多微衛(wèi)星研究的出發(fā)點都是公共數(shù)據(jù)庫，比如從EMBL、Genbank或EST數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點。從這些數(shù)據(jù)庫中，可通過電子查詢方式方便地獲得所需要的序列或?qū)ふ乙汛嬖诘奈⑿l(wèi)星引物

6、。研究者對大量序列進(jìn)行處理，利用Clustal W等程序，根據(jù)相似性程度，剔除冗余的EST，再剔除過短的序列（小于100bp）和過長的序列（大于1000bp），再利用SSRHunter等軟件搜索獲得含有微衛(wèi)星的序列，并根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計引物。何蔚3等選用前人分離得到的42對大熊貓微衛(wèi)星引物，分別用圈養(yǎng)大熊貓的血液 DNA和野生大熊貓的糞便DNA對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明不同標(biāo)記的多態(tài)性差異較大，并篩選出13對能較好地應(yīng)用于大熊貓遺傳多樣性研究的微衛(wèi)星引物?？飫倶?等利用生物信息學(xué)方法從公開發(fā)表的鱖魚 GenBank數(shù)據(jù)庫中尋找多態(tài)信息含量豐富的微衛(wèi)星位點中共搜索到304條鱖魚核酸序列，經(jīng)計算

7、機(jī)篩選和人工選擇 , 最終獲得 22 條含微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列，利用SSRHunter軟件在此 22條含有微衛(wèi)星的序列中發(fā)現(xiàn)30個微衛(wèi)星位點，設(shè)計出17對引物，其余位點兩端序列短無法設(shè)計引物。其中13對引物擴(kuò)增條帶清晰，經(jīng)過多態(tài)性分析，最終篩選獲得6對多態(tài)性微衛(wèi)星引物。徐玲玲5等從資料和GenBank中選取擴(kuò)增效果好、等位基因多、均勻分布于小型豬18條常染色體和X染色體上的100個微衛(wèi)星位點合成引物，對封閉群小型豬基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增及條件優(yōu)化，篩選出32個分布于不同染色體且等位基因多的微衛(wèi)星位點。近年來隨著數(shù)據(jù)庫中EST序列的增加，通過數(shù)據(jù)庫搜尋法獲得EST微衛(wèi)星位點的報道越來越多。在此基礎(chǔ)

8、上進(jìn)行SSR引物開發(fā)也就成了一種既經(jīng)濟(jì)又有效的方法。許新6等從雜色鮑cDNA文庫中用SSRHunter軟件搜索獲得173個重復(fù)序列，從中設(shè)計93對引物，有78對可以擴(kuò)增，占合成總引物的83.9%，用深圳、汕尾等3個群體中挑選出多態(tài)性引物19對，多態(tài)性微衛(wèi)星比例24.36%。石耀華7等從馬氏珠母貝cDNA文庫查找到了268個重復(fù)序列，含微衛(wèi)星的EST數(shù)占EST總數(shù)的3.48%，設(shè)計151對微衛(wèi)星引物，有130對可以擴(kuò)增，占合成引物總數(shù)的86.09%，其中多態(tài)性引物45對，占微衛(wèi)星總數(shù)的34.6%。EST微衛(wèi)星位于編碼區(qū)，由于基因序列的保守性，EST微衛(wèi)星序列比從基因組中篩選的微衛(wèi)星多態(tài)性低。Eu

9、jayl8 比較了小麥 EST的微衛(wèi)星和基因組微衛(wèi)星多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因組微衛(wèi)星多態(tài)性（53%）遠(yuǎn)高于EST微衛(wèi)星（25%）。 從數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星最大的缺點是只限于已經(jīng)有序列數(shù)據(jù)發(fā)布的物種。一個替代方法是從相近的物種數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點，或使用已發(fā)表的遺傳距離相近物種的微衛(wèi)星標(biāo)記。2 近緣物種交叉擴(kuò)增獲得微衛(wèi)星引物由于微衛(wèi)星重復(fù)序列和包含引物位點的側(cè)翼序列在物種間具有保守性，所以某一個物種的微衛(wèi)星引物可以在其相近的物種中使用，用來檢測相近物種同源位點的多態(tài)性。這樣就大大地減少了檢測微衛(wèi)星位點的工作量。微衛(wèi)星在近緣種之間的通用性已有研究,但在屬間應(yīng)用還不多。根據(jù)M. Rossetto9對近年

10、來發(fā)表文獻(xiàn)的總結(jié)，微衛(wèi)星位點可在物種間擴(kuò)增，其多態(tài)性也相當(dāng)高。Zucoloto10等利用密西西比鱷和寬吻凱門鱷的微衛(wèi)星在其他3種鱷魚中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增率均在85%以上。Küpper11等使用的環(huán)頸鸻微衛(wèi)星成功地在 4種鸻科鳥類中獲得擴(kuò)增，平均擴(kuò)增率為75%。蔡清秀12等從從非洲象31個微衛(wèi)星位點和5個已知亞洲象微衛(wèi)星位點中篩選出14個勐養(yǎng)亞洲象的微衛(wèi)星位點，其中 9個多態(tài)位點能在 185份糞便樣品DNA中穩(wěn)定擴(kuò)增。孫濤13等利用138條人類微衛(wèi)星引物在黑葉猴中進(jìn)行篩選，得到了23個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點。其中有7個位點偏離Hardy-Weinberg 平衡，9個位點存在無效等位基因現(xiàn)象

11、，但是各位點之間均未檢測到連鎖不平衡現(xiàn)象，這些位點將在黑葉猴種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)揮重要作用。洪艷云14等選用10對非洲糜羚微衛(wèi)星引物和10對綿羊微衛(wèi)星引物作為篩選普氏原羚基因組 DNA微衛(wèi)星位點的引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20對引物中有8對引物在普氏原羚基因組DNA中擴(kuò)增出了多態(tài)性位點。譚元卿15等利用小鼠微衛(wèi)星位點引物536對，對長爪沙鼠基因組DNA擴(kuò)增出了313個陽性條帶，經(jīng)測序分析確定130個長爪沙鼠的微衛(wèi)星位點，與小鼠同源性為24.3%。引物跨物種共用的有效程度除與其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近有關(guān)外。Primmer16等對大量鳥類微衛(wèi)星交叉擴(kuò)增研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)后提出，交叉擴(kuò)增中微衛(wèi)星在來源物種中的完全重復(fù)

12、單元數(shù)目(perfect repeat units)與交叉擴(kuò)增所獲得的同源微衛(wèi)星位點的多態(tài)性呈正相關(guān)。微衛(wèi)星位點的重復(fù)單元數(shù)目越多，其多態(tài)性也就越高，這表明微衛(wèi)星位點的高重復(fù)單元數(shù)目在其近緣物種仍有所保持。這意味著即使由于較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系使物種間交叉擴(kuò)增率較低，具有較高重復(fù)單元數(shù)目的原始微衛(wèi)星位點仍有可能獲得有價值的擴(kuò)增產(chǎn)物。值得注意的是，僅從產(chǎn)物片斷大小和變化上不是總能很好地確定微衛(wèi)星的存在，通過改變擴(kuò)增條件用微衛(wèi)星引物在物種間擴(kuò)增得到產(chǎn)物后，仍需要通過雜交、測序等方法確定所擴(kuò)增出的條帶就是所期望的產(chǎn)物。3 從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點對于無法從上面兩種方法獲得微衛(wèi)星引物的物種，可以從基因組

13、DNA中篩選微衛(wèi)星位點。 絕大多數(shù)微衛(wèi)星位點是從100-1000 bp的小插入片段基因組文庫中通過寡核苷酸探針雜交獲得的。標(biāo)準(zhǔn)的分離微衛(wèi)星位點的方法有如下步驟：提取基因組DNA；用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切割成小片段；凝膠電泳,回收大小100-1000 bp的片段；將回收片段克隆，使用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交；篩選出含有重復(fù)序列的克??；測序證實重復(fù)序列片段的存在；根據(jù)重復(fù)序列片段兩端保守序列設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢驗引物的有效性；對小量樣本進(jìn)行預(yù)試驗,挑選出重復(fù)性好，具多態(tài)性的微衛(wèi)星位點。按以上步驟，Srikwan17和Munshi-South18利用尼龍膜菌落原位雜交法分離出6個泰國樹鼩(Tu

14、paia glis)和5個馬來西亞樹鼩（Tupaia spp.）的微衛(wèi)星位點。魏東旺19等從鯉魚基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點，用探針(CA)n 對質(zhì)粒pGEM-3Zf(+)構(gòu)建的基因文庫進(jìn)行雜交篩選，從2000個白色菌落中共獲得陽性克隆45個，其中32 個克隆中共得到 22個微衛(wèi)星。 從基因組文庫中分離微衛(wèi)星位點的傳統(tǒng)方法在微衛(wèi)星富集程度上效率很低，為了提高微衛(wèi)星位點分離的效率，在文庫構(gòu)建前或構(gòu)建后發(fā)展了一些富集方法。3.1 雜交法富集微衛(wèi)星雜交富集法根據(jù)所使用的介質(zhì)不同可分為三種：磁珠法、尼龍膜法和親和素超濾離心法。3.1.1 磁珠富集法磁珠富集法的基本原理是用生物素標(biāo)記重復(fù)序列寡核酸探針并

15、與基因組DNA酶切片段雜交，再利用生物素與親和性強的特性，使兩者相互作用的穩(wěn)定性和強度即使在變性、雜交、洗脫等操作過程中也不產(chǎn)生分離，從而完成對重復(fù)序列目標(biāo)片段的富集，建立微衛(wèi)星富集文庫。經(jīng)過磁珠富集后使獲得的具有重復(fù)序列片段的效率大幅度提高。目前，鏈親和素包埋的磁珠已被廣泛應(yīng)用到各種微衛(wèi)星富集方法中。磁珠雜交的微衛(wèi)星富集過程是在文庫構(gòu)建前，一般步驟如下：限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，酶切后的DNA片段1000 bp；接頭連接酶切DNA片段；酶切位點和接頭作為引物結(jié)合位點，進(jìn)行擴(kuò)增，增加DNA片段量；生物素標(biāo)記的互補微衛(wèi)星寡核酸探針同PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交；鏈霉素包埋的磁珠雜交篩選目的片段；目的片

16、段洗脫、擴(kuò)增、純化、克隆；陽性克隆進(jìn)行DNA測序，設(shè)計引物進(jìn)行PCR 分析；多態(tài)性鑒定。于穎20等通過磁珠富集法構(gòu)建了藏雞基因組微衛(wèi)星富集文庫，從1200個轉(zhuǎn)化子中獲得了353個陽性克隆，隨機(jī)挑選53個測序，根據(jù)測序結(jié)果成功設(shè)計了18對藏雞微衛(wèi)星引物，最終篩選出6個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記。袁慧21等用磁珠富集法構(gòu)建了巖原鯉AC重復(fù)和GATA重復(fù)的微衛(wèi)星富集文庫，陽性克隆率分別為30%和7%左右。對40個AC重復(fù)的陽性克隆和30個GATA重復(fù)的陽性克隆測序，共獲得61個微衛(wèi)星序列。朱亮22等法應(yīng)用磁珠和生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星探針與豚鼠基因組酶切片段雜交，捕獲200- 1000bp含有微衛(wèi)星序列的DN

17、A片段，克隆構(gòu)建富集微衛(wèi)星序列的小片段插入文庫 然后用PCR法進(jìn)行篩選，結(jié)果從約2000個轉(zhuǎn)化子中獲得240個陽性克隆對其中98個進(jìn)行了測序，并成功設(shè)計豚鼠微衛(wèi)星引物17對。WANG23等采用磁珠富集法建立黑斑狗魚微衛(wèi)星富集文庫，然后利用-32P標(biāo)記的放射性同位素探針進(jìn)行第二次雜交，得到的陽性克隆為1300個，占87.25%，從中挑出196 個進(jìn)行測序，192（97.96%）個含有微衛(wèi)星序列。趙亮24等為促進(jìn)大銀魚保護(hù)遺傳學(xué)的開展，采用磁珠富集微衛(wèi)星序列技術(shù)，提高了微衛(wèi)星位點的篩選效率，成功獲得6個具有多態(tài)性的(CA) n重復(fù)序列的大銀魚微衛(wèi)星位點。李齊發(fā)25等用鏈親和素磁珠親和捕捉與生物素標(biāo)

18、記的微衛(wèi)星寡核苷酸探針(CA) 12、(CCG) 8、(CAG) 8、(TTTC) 8退火結(jié)合的含有接頭和牦牛微衛(wèi)星序列的單鏈限制性酶切片段，首次成功構(gòu)建牦牛基因組微衛(wèi)星富集文庫。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性克隆率為77 %(37/48)，說明構(gòu)建的牦?；蚪M微衛(wèi)星富集文庫是一個高質(zhì)量的文庫。閆守慶26等將貉基因組DNA酶切片段與Mbo I連接頭連接，連接產(chǎn)物與生素物標(biāo)記的(AC) n微衛(wèi)星探針變性及退火，再通過鏈親和素偶聯(lián)磁珠親和捕捉，經(jīng)吸附、洗滌、洗脫、PCR擴(kuò)增，連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫，經(jīng)測序分析表明該文庫含重組克隆約2800個，陽性克隆71.4%。李新國27等以日本扁柏4個種源的DNA樣品為

19、材料，與含有生物素標(biāo)記的(CT) 15探針雜交，再用磁珠富集雜交產(chǎn)物，成功地實現(xiàn)了日本扁柏核基因組微衛(wèi)星的高效分離，共獲得2200多個陽性克隆，發(fā)現(xiàn)含有微衛(wèi)星的克隆比例高達(dá)65.6 %。3.1.2 尼龍膜富集法尼龍膜法的主要步驟包括限制性內(nèi)切酶酶切基因組 DNA；接頭連接；通過吸附在尼龍膜上的許多微衛(wèi)星探針來富集基因組中的微衛(wèi)星片段；洗脫結(jié)合片段，用接頭作為引物進(jìn)行；目的片段連接到質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆測序。戰(zhàn)愛斌28等應(yīng)用微衛(wèi)星富集文庫一菌落原位雜交法，用固定了(AG)15和(AC)15探針的尼龍膜( Hybond N+ )捕捉含有微衛(wèi)星 DNA的片段，經(jīng)洗脫、 PCR擴(kuò)增和TA克

20、隆，構(gòu)建櫛孔扇貝的微衛(wèi)星富集文庫。富集文庫中1200個重組克隆經(jīng)過菌落原位雜交后，532個( 44.3)為陽性克隆。任意挑選100個克隆測序，結(jié)果顯示所有的克隆都至少含有一個微衛(wèi)星位點。 3.1.2 親和素和超濾離心富集法親和素超濾離心法的一般過程如下：限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，酶切后的DNA片段1000 bp；接頭連接酶切DNA片段；酶切位點和接頭作為引物結(jié)合位點，進(jìn)行擴(kuò)增，增加DNA片段量；生物素標(biāo)記的互補微衛(wèi)星寡核酸探針同PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交；用親合素捕獲并超濾離心濃縮富集雜交的目的片段；以富集的核酸作為模板，反應(yīng)體系和程序同前進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物再次雜交、捕獲、濃縮富集和擴(kuò)增；

21、擴(kuò)增產(chǎn)物克隆；陽性克隆進(jìn)行DNA測序，設(shè)計引物進(jìn)行PCR 分析；多態(tài)性鑒定。李石柱29等應(yīng)用湖北釘螺基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交, 親合素捕獲并超濾離心濃縮富集、克隆并測序，獲得湖北釘螺微衛(wèi)星DNA序列205條，GenBank注冊登記號 GU204044-GU204248。張麗30等應(yīng)用中華白蛉基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴(kuò)增放大后克隆并測序，獲得118條微衛(wèi)星序列，重組克隆陽性率為78.6%。樊勇31等應(yīng)用中華按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交,親合素富集和超濾離心濃縮目的片段,擴(kuò)增放大

22、,克隆并測序, 獲得252條序列，GenBank注冊登記號為EF620047-EF620298。馬雅軍32等對雷氏按蚊的微衛(wèi)星DNA序列進(jìn)行了分離，應(yīng)用雷氏按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交, 親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴(kuò)增放大后克隆并測序, 獲得雷氏按蚊微衛(wèi)星DNA58條，GenBank注冊登記號為EF620299- EF620356。3.2 引物法富集微衛(wèi)星引物法富集微衛(wèi)星一般是使用同目的微衛(wèi)星重復(fù)互補的寡核苷酸作為引物，通過PCR 反應(yīng)在文庫構(gòu)建前或構(gòu)建后富集微衛(wèi)星位點。根據(jù)所使用引物類型的不同可分為兩類：引物序列同微衛(wèi)星寡核苷酸互補以及簡并性寡核苷酸引物。

23、 Paetgkau33用生物素標(biāo)記的同微衛(wèi)星互補的引物進(jìn)行擴(kuò)增克隆，單鏈延伸后用鏈親和素包埋的磁珠特異性選擇親和吸附。洗脫后的單鏈反應(yīng)形成雙鏈并轉(zhuǎn)化噬菌體。用微衛(wèi)星引物和一個通用測序引物來檢驗噬菌斑中是否存在微衛(wèi)星片段。在 24個陽性克隆中，全部存在微衛(wèi)星序列。Fisher34用簡并性引物5-KKVRVRV(CT)6-3富集微衛(wèi)星位點。引物5端的兩個堿基V被設(shè)計成可結(jié)合到任意的核苷酸，下面5個核苷VRVRV不同微衛(wèi)星序列互補，但具有最大的簡并性但不能與GA配對，因此在PCR過程中就不會在（GA）n重復(fù)區(qū)滑動，增加了擴(kuò)增的特異性。擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物被連接到質(zhì)粒載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，15個陽性克隆被

24、分離，其中13 個具有微衛(wèi)星位點。3.3 與分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合3.3.1 RAPD 富集法Uedo 等35通過RAPD法篩選微衛(wèi)星，首先在基因組DNA中進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，然后在瓊脂糖凝膠上電泳分離，片段通過Southern雜交轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與標(biāo)記的微衛(wèi)星探針進(jìn)行雜交，陽性帶純化克隆后測序。結(jié)果表明30個克隆中，21個包含微衛(wèi)星。該技術(shù)程序不需要建立和篩選基因組文庫。Lunt 等36也采用RAPD篩選微衛(wèi)星,方法是先進(jìn)行 RAPD擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用2套引物進(jìn)行菌落PCR，一套是M13正向和反向引物，另一套是M13引物和一個微衛(wèi)星特殊性引物，將在微衛(wèi)星特殊性

25、引物擴(kuò)增中產(chǎn)生一條小帶的克隆測序。測序結(jié)果表明分離微衛(wèi)星位點的效率是傳統(tǒng)方法的兩倍。3.3.2 AFLP富集法用鏈親和素磁珠來富集AFLP片段中含微衛(wèi)星的片段,是基于磁珠表面的鏈親和素與標(biāo)記于微衛(wèi)星探針上的生物素之間的強且穩(wěn)定的共價結(jié)合。Hakki 等37用AFLP從小麥中分離微衛(wèi)星位點，方法是先進(jìn)行AFLP預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物與用生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星探針進(jìn)行雜交和吸附，洗滌非微衛(wèi)星片段后，用相應(yīng)AFLP引物擴(kuò)增收集到的DNA片段克隆測序后設(shè)計引物進(jìn)行微衛(wèi)星擴(kuò)增。4 小結(jié)在文中敘述的三種方法中，通過公共數(shù)據(jù)庫或者已公開發(fā)表的文獻(xiàn)獲得微衛(wèi)星標(biāo)記是最簡便易行的，但對大部分物種而言，其數(shù)量有限，且引物多

26、態(tài)性表現(xiàn)不高。近緣物種間交叉擴(kuò)增，有時盲目性較大，針對性較差。但對于沒有可利用序列信息的物種，只有通過雜交等方法從物種DNA中篩選微衛(wèi)星位點。通過基因組文庫獲得微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，效率低，工作量大。在此基礎(chǔ)上發(fā)展而成的微衛(wèi)星富集法在很大程度上改善了這一缺點，但對實驗室設(shè)備有較高的要求。利用RAPD和AFLP的方法開發(fā)微衛(wèi)星引物，需要雜交來富集微衛(wèi)星序列，效率較低。對于要應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行遺傳研究的科研人員，首要面對的問題就是選擇何種方法獲得微衛(wèi)星位點。如果是為了遺傳作圖，那么就需要獲得更多的微衛(wèi)星位點；如果是用來進(jìn)行種群遺傳研究，少量的微衛(wèi)星位點就可以滿足需要。另外，技術(shù)設(shè)備也限制了對富集方法的

27、選擇，一些實驗室可能沒有相關(guān)的設(shè)備進(jìn)行雜交、富集、檢測。同時，分離微衛(wèi)星的費用也是一個考慮因素。參考文獻(xiàn)：1 Hamada H, Petrino M G，Kakunaga T. A novel repeated element with Z-DNA forming potential is widely found in evolutionarily diverse eukaryotic genomesJ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1982,79(21): 6

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