發(fā)酵分析—色譜分析概述

1、第一節(jié)第一節(jié) 色譜法概述色譜法概述 混合物最有效的分離、分析方法?；旌衔镒钣行У姆蛛x、分析方法。 俄國植物學(xué)家茨維特在俄國植物學(xué)家茨維特在19061906年使用的裝置：年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。色譜原型裝置，如圖。 色譜法是一種分離技術(shù)，色譜法是一種分離技術(shù)， 試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配過程。分配過程。 其中的一相固定不動，稱為其中的一相固定不動，稱為固定相固定相； 另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液

2、體），稱為體（氣體或液體），稱為流動相流動相。 碳酸鈣碳酸鈣（固定相）（固定相）色素混合液色素混合液石油醚石油醚 (流動相）流動相）1906年，年，Tsweet發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象色譜柱色譜柱植物色素分離圖示植物色素分離圖示（1）分離效率高分離效率高 復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2 2） 靈敏度高靈敏度高 可以檢測出g.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量。（3） 分析速度快分析速度快 一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。（4 4） 應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣 氣相色譜：沸點(diǎn)低于400的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。 液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不

3、穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。 不足之處：不足之處： 被分離組分的定性較為困難。1按兩相分子的聚集狀態(tài)分類按兩相分子的聚集狀態(tài)分類超臨界流體色譜法超臨界流體色譜法流動相為超臨界流體流動相為超臨界流體色譜法分類（續(xù)前）2按固定相的固定方式分類按固定相的固定方式分類3按分離機(jī)制分類按分離機(jī)制分類毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳色譜過程色譜過程指被分離組分在兩相中的指被分離組分在兩相中的“分配分配”平衡過平衡過程程以吸附色譜為例以吸附色譜為例見圖示見圖示 吸附吸附 解吸解吸再吸附再吸附 再解吸再解吸 反復(fù)多反復(fù)多次洗脫次洗脫被測組分分配系數(shù)不同被測組分分配系數(shù)不同 差速遷差速遷移移 分離分離l分配系數(shù)的微小差異分配

4、系數(shù)的微小差異吸附能力的微小差異吸附能力的微小差異l微小差異積累微小差異積累較大差異較大差異吸附能力弱的組分先吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強(qiáng)的組分后流出流出；吸附能力強(qiáng)的組分后流出back色譜分離原理色譜分離原理色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異平衡分配可以用分配系數(shù)和分配比來衡量平衡分配可以用分配系數(shù)和分配比來衡量色譜分離特點(diǎn)色譜分離特點(diǎn) 1不同組分通過色譜柱時(shí)的遷移速度不等不同組分通過色譜柱時(shí)的遷移速度不等 提供了分離的可能性提供了分離的可能性 2各組分沿柱子擴(kuò)散分布各組分沿柱子擴(kuò)散分布峰寬峰寬 不利于不同組分分離不利于不同組分分離三、

5、色譜流出曲線與術(shù)語三、色譜流出曲線與術(shù)語1.1.基線基線 無試樣通過檢測器時(shí)，無試樣通過檢測器時(shí)，檢測到的信號即為基線。檢測到的信號即為基線。2.2.保留值保留值 （1）時(shí)間表示的保留值）時(shí)間表示的保留值 保留時(shí)間（保留時(shí)間（tR）：）：組組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間；極大值時(shí)所需的時(shí)間； 死時(shí)間（死時(shí)間（tM）：）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時(shí)間；留時(shí)間； 調(diào)整保留時(shí)間（調(diào)整保留時(shí)間（tR ）：）：tR= tRtM （2）用體積表示的保留值）用體積表示的保留值 保留體積（保留體積（VR）：）： VR = tRF0

6、F0為柱出口處的載氣流量，為柱出口處的載氣流量，單位：單位：m L / min。 死體積（死體積（VM）：）： VM = tM F0 調(diào)整保留體積調(diào)整保留體積(VR)： V R = VR VM 3 3. . 區(qū)域?qū)挾葏^(qū)域?qū)挾?用來衡量色譜峰寬度的參用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有數(shù)，有三種表示方法三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差( )：即即0.607倍倍峰高處色譜峰寬度的一半。峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一色譜峰高一半處的寬度半處的寬度 Y1/2 =2.354 （3）峰底寬峰底寬(Wb)：Wb=4 分配系數(shù)和容量因子：相平衡參數(shù)分配系數(shù)和容量因子：相平衡參數(shù)

7、分配系數(shù)分配系數(shù)K(平衡常數(shù)平衡常數(shù))：指在一定溫度和壓力下，指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達(dá)分配平衡后，在固定相與流動組分在色譜柱中達(dá)分配平衡后，在固定相與流動相中的濃度比（色譜過程的相平衡參數(shù)）相中的濃度比（色譜過程的相平衡參數(shù)）mSCCK (1) (1) 利用保留值及其規(guī)律定性利用保留值及其規(guī)律定性 各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此因此保留值可作為定性指標(biāo)保留值可作為定性指標(biāo)。 利用純物質(zhì)對照定性利用純物質(zhì)對照定性 利用文獻(xiàn)值對照定性利用文獻(xiàn)值對照定性l實(shí)現(xiàn)方法實(shí)現(xiàn)方法利用保留時(shí)間定性利用保留時(shí)間定性 用相對保留值定性

8、用相對保留值定性 用已知物增加峰高法定性用已知物增加峰高法定性 122,1ttl 實(shí)現(xiàn)方法實(shí)現(xiàn)方法測定保留指數(shù)測定保留指數(shù)I I l 優(yōu)點(diǎn)：無需純物質(zhì)；保留指數(shù)具有較好的重現(xiàn)優(yōu)點(diǎn)：無需純物質(zhì)；保留指數(shù)具有較好的重現(xiàn)性和精密度；只與固定相和柱溫有關(guān)。性和精密度；只與固定相和柱溫有關(guān)。l 缺點(diǎn)：對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物質(zhì)，缺乏數(shù)據(jù)。缺點(diǎn)：對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物質(zhì)，缺乏數(shù)據(jù)。l 適用范圍：適用于簡單混合物，無需純物質(zhì)。適用范圍：適用于簡單混合物，無需純物質(zhì)。（2）與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法SampleSampleGas Chromatograph (GC)Mass Spectrometer (MS)Separati

9、onIdentificationl 色質(zhì)譜聯(lián)用儀（色質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MSGC-MS；LC-MSLC-MS）l 色譜色譜- -紅外光譜儀聯(lián)用儀；紅外光譜儀聯(lián)用儀；組分的結(jié)構(gòu)鑒定組分的結(jié)構(gòu)鑒定: :n 外標(biāo)法外標(biāo)法外標(biāo)法也稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線法外標(biāo)法也稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線法。特點(diǎn)及要求：特點(diǎn)及要求： 外標(biāo)法不使用校正因子，準(zhǔn)確性較高外標(biāo)法不使用校正因子，準(zhǔn)確性較高 操作條件變化對結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大操作條件變化對結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大 對進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高，適用于大批對進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析量試樣的快速分析n 內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法原理：原理：利用被測物與內(nèi)標(biāo)物校正因子的比值不變來進(jìn)行定

10、量的。首先用被測物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，求得校正因子比值： 然后，樣品中加入內(nèi)標(biāo)物，再由它和樣品的峰面積來計(jì)算： fisfi/fs 內(nèi)標(biāo)物與被測組份校正因子的比值； mi被測組份i的含量； ms加入內(nèi)標(biāo)物的量； As內(nèi)標(biāo)物的峰面積； Ai組份i的峰面積；issisiAmAmffisfsississiAAmisAAmffifm(a) (a) 內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高，操作條件和進(jìn)樣量的稍許內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高，操作條件和進(jìn)樣量的稍許變動對定量結(jié)果的影響不大。變動對定量結(jié)果的影響不大。(b) (b) 每個(gè)試樣的分析，都要進(jìn)行兩次稱量，不適合大每個(gè)試樣的分析，都要進(jìn)行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分

11、析。批量試樣的快速分析。內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求：內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求：（a a）試樣中不含有該物質(zhì)；試樣中不含有該物質(zhì)；（b b）與被測組分性質(zhì)比較接近；與被測組分性質(zhì)比較接近；（c c）不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（d d）出峰位置應(yīng)位于被測組分附近，且無組分峰響。出峰位置應(yīng)位于被測組分附近，且無組分峰響。內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn)內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn)與外標(biāo)法比較：1. 外標(biāo)法：標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)樣品AACC2. 內(nèi)標(biāo)法：標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)樣品內(nèi)標(biāo)樣品標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)樣品內(nèi)標(biāo)樣品AAAACCCC可以推導(dǎo)出：樣品內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)樣品內(nèi)標(biāo)樣品樣品CCCCAAAA思考題思考題l色譜分離的原理及過程。色譜分離的原理

12、及過程。第二節(jié)第二節(jié) 薄層層析（薄層層析（ Thin-layer Thin-layer chromatography chromatography ）1、基本原理、基本原理薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種 一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當(dāng)液相（展開溶劑）在固定相上流動時(shí)，固定相。當(dāng)液相（展開溶劑）在固定相上流動時(shí)，由于吸附劑對不同組分的吸附力不一樣，不同組分由于吸附劑對不同組分的吸附力不一樣，不同組分在展開溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄板上的混合在展開溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄板上的混合樣品隨著展開劑的移

13、動速率也不同，因而可以彼此樣品隨著展開劑的移動速率也不同，因而可以彼此分開。（即通過吸附分開。（即通過吸附-解吸解吸-再吸附再吸附-再解吸的反復(fù)進(jìn)再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分離開來）行，而將樣品各組分分離開來）Thin-Layer Chromatography: A Two-Component MixtureMore polar!Less polar!solvent frontoriginmixturesolvent frontcomponent Bcomponent Aoriginsolvent frontcomponent Bcomponent AoriginIncreasing D

14、evelopment TimeThin-Layer Chromatography: Determination of Rf Valuessolvent frontcomponent Bcomponent AorigindSdBdARf of component A = dA dSRf of component B = dB dSThe Rf value is a decimal fraction, generally only reported to two decimal placesThin-Layer Chromatography: Qualitative AnalysisA B unk

15、nown固定相：氧化鋁OAlOOAlOOHAlOOHAlOOHAlOHOAcidic: -Al-OHNeutral: -Al-OH + -Al-O-Basic: -Al-O-硅膠吸附薄層層析硅膠吸附薄層層析l 吸附薄層中常用的吸附劑為吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠氧化鋁和硅膠 l 硅膠：表達(dá)式為硅膠：表達(dá)式為SiOSiO2 2XHXH2 2O O。層析用硅膠是一種。層析用硅膠是一種多孔性物質(zhì)，它的硅氧環(huán)交鏈結(jié)構(gòu)表面上密布極多孔性物質(zhì)，它的硅氧環(huán)交鏈結(jié)構(gòu)表面上密布極性性硅醇基（硅醇基（Si SiOHOH），），這種極性的硅醇基能和這種極性的硅醇基能和許多化合物形成許多化合物形成氫鍵氫鍵而產(chǎn)

16、生吸附而產(chǎn)生吸附. .OHSiOOHSiOOOOHSiOOOHSiOOOHSiOOOSiOOSiOOSiOOSiOOOSiOOSiOOSiOOO硅膠吸附薄層層析的特點(diǎn)：硅膠吸附薄層層析的特點(diǎn)： 硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負(fù)性相關(guān)。性也與含水量呈負(fù)性相關(guān)。硅醇基顯較弱的硅醇基顯較弱的酸性酸性，因而，硅膠只能用，因而，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用它于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用它分離。分離。硅膠的活化溫度通常為硅膠的活化溫度通常為105105110110，不，不能過高。能過高。2、操作步驟、操作步驟薄層板的

17、制備薄層板的制備 展開劑的選擇展開劑的選擇 Ala Arg Gly Mix輕觸疾起輕觸疾起操作步驟操作步驟點(diǎn)樣點(diǎn)樣 (a)點(diǎn)狀點(diǎn)樣 (b)條狀點(diǎn)樣 (c)頸部點(diǎn)樣 (d)溝槽點(diǎn)樣 半自動點(diǎn)樣儀半自動點(diǎn)樣儀手動點(diǎn)樣器手動點(diǎn)樣器操作步驟操作步驟 展層、顯色展層、顯色Ala Arg Gly Mix物理顯色物理顯色 含有共軛雙鍵的有機(jī)物質(zhì)能吸收紫外光，將分離后的含有共軛雙鍵的有機(jī)物質(zhì)能吸收紫外光，將分離后的薄層板置于紫外燈下，組分薄層呈現(xiàn)暗色斑；如果采薄層板置于紫外燈下，組分薄層呈現(xiàn)暗色斑；如果采用硅腔用硅腔GF(或其它含有熒光指示劑的吸附劑或其它含有熒光指示劑的吸附劑)鋪成的薄鋪成的薄層，在紫外光照

18、射下，整個(gè)薄層呈顯黃綠色熒光，斑層，在紫外光照射下，整個(gè)薄層呈顯黃綠色熒光，斑點(diǎn)部分呈現(xiàn)暗色，更為明顯。點(diǎn)部分呈現(xiàn)暗色，更為明顯。 利用利用蒸氣熏顯色蒸氣熏顯色時(shí)，常用的試劑有固體碘、濃氨水、時(shí)，常用的試劑有固體碘、濃氨水、液體溴。進(jìn)行顯色時(shí)，把這些易揮發(fā)的試劑放置在密液體溴。進(jìn)行顯色時(shí)，把這些易揮發(fā)的試劑放置在密閉容器內(nèi)（例如標(biāo)本瓶、標(biāo)本缸、干燥器等），使它閉容器內(nèi)（例如標(biāo)本瓶、標(biāo)本缸、干燥器等），使它們的蒸氣充滿整個(gè)容器，將已展開并已揮發(fā)去溶劑的們的蒸氣充滿整個(gè)容器，將已展開并已揮發(fā)去溶劑的薄層板放入其中，使之顯色。薄層板放入其中，使之顯色。 化學(xué)顯色化學(xué)顯色的方式通常有直接噴霧法和浸漬法

19、兩種。的方式通常有直接噴霧法和浸漬法兩種。 化學(xué)顯色常用的顯色劑劑大致可以分為兩類，即通用顯色化學(xué)顯色常用的顯色劑劑大致可以分為兩類，即通用顯色劑和專屬性顯色劑。劑和專屬性顯色劑。通用顯色劑：對未知化合物的檢測，可以考慮先用通用顯通用顯色劑：對未知化合物的檢測，可以考慮先用通用顯色劑。這種顯色劑是利用它與被測組分的氧化還原反應(yīng)、色劑。這種顯色劑是利用它與被測組分的氧化還原反應(yīng)、脫水反應(yīng)及酸堿反應(yīng)等而顯色的，常用的有脫水反應(yīng)及酸堿反應(yīng)等而顯色的，常用的有50的硫酸溶的硫酸溶液、酸堿指示劑溶液、液、酸堿指示劑溶液、5磷鉬酸乙醇溶液、熒光顯色劑磷鉬酸乙醇溶液、熒光顯色劑等。等。 ： 結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算

20、lRf =斑點(diǎn)至原點(diǎn)距離斑點(diǎn)至原點(diǎn)距離溶劑前緣至原點(diǎn)距離溶劑前緣至原點(diǎn)距離 小心量出斑點(diǎn)中心至原點(diǎn)中心距小心量出斑點(diǎn)中心至原點(diǎn)中心距離，再量出原點(diǎn)中心至溶劑前沿的距離，再量出原點(diǎn)中心至溶劑前沿的距離，計(jì)算出它們的離，計(jì)算出它們的 值。值。 根據(jù)根據(jù)值，鑒定出混合樣品中值，鑒定出混合樣品中氨基酸的種類，并繪出層析圖譜。氨基酸的種類，并繪出層析圖譜。薄層色譜掃描儀薄層色譜掃描儀 定義：定義： 紙色譜分離法又稱紙層析法，是根據(jù)不紙色譜分離法又稱紙層析法，是根據(jù)不同物質(zhì)在兩相中的同物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)分配系數(shù)不同而進(jìn)行分不同而進(jìn)行分離的一種微量分離方法。離的一種微量分離方法。載體載體層析紙（濾紙）；

21、層析紙（濾紙）；固定相固定相濾紙上的吸濕水分；濾紙上的吸濕水分；流動相流動相有機(jī)溶劑（展開劑）。有機(jī)溶劑（展開劑）。紙色譜紙色譜思考題思考題l簡述簡述TLC的操作步驟。的操作步驟。l概念：概念：離子交換分離法是利用離子交換分離法是利用離子交換離子交換劑與溶液中的離子之間所發(fā)生的交換反劑與溶液中的離子之間所發(fā)生的交換反應(yīng)應(yīng)進(jìn)行分離的方法。進(jìn)行分離的方法。（二）離子交換色譜（二）離子交換色譜儀器設(shè)備簡介儀器設(shè)備簡介離子交換全套裝置離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)-網(wǎng)絡(luò)骨架網(wǎng)絡(luò)骨架苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、環(huán)氧系離子交換樹脂結(jié)構(gòu)骨架：骨架：接有功能基團(tuán)，本身是惰性接有功能基團(tuán)，本身是惰性功能基

22、團(tuán)：功能基團(tuán)：連接在骨架上，可與相連接在骨架上，可與相反離子結(jié)合反離子結(jié)合待交換分子：待交換分子：在吸附階段可與活在吸附階段可與活性離子交換，與骨架上的功能基性離子交換，與骨架上的功能基團(tuán)結(jié)合團(tuán)結(jié)合活性離子：活性離子：與功能基團(tuán)所帶電荷相與功能基團(tuán)所帶電荷相反的可移動的離子反的可移動的離子u活性離子為陽離子，稱陽離子交換樹脂，與陽離子發(fā)生交換活性離子為陽離子，稱陽離子交換樹脂，與陽離子發(fā)生交換u活性離子為陰離子，稱陰離子交換樹脂，與陰離子發(fā)生交換活性離子為陰離子，稱陰離子交換樹脂，與陰離子發(fā)生交換 基質(zhì)基質(zhì) 電荷基團(tuán)電荷基團(tuán) 反離子反離子商品名商品名纖維素纖維素 OCH2COO- Na+ +C

23、M-纖維素纖維素纖維素纖維素-O-O-（CHCH2 2）2 2- -N N+ +H H（C C2 2H H5 5）2 2 ClCl- -DEAE-纖維素纖維素聚苯乙烯聚苯乙烯SO3 3- - Na+ +732陽離子樹陽離子樹脂脂 聚苯乙烯聚苯乙烯N N+ +（CH2）4 4 ClCl- -717陰離子樹陰離子樹脂脂聚苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂的制備聚苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂的制備離子交換樹脂的形狀結(jié)構(gòu)示意圖離子交換樹脂的形狀結(jié)構(gòu)示意圖帶帶正正電荷多電荷多蛋白緊密結(jié)合蛋白緊密結(jié)合帶帶負(fù)負(fù)電荷多電荷多蛋白流過層析蛋白流過層析柱柱陽離子交換樹脂工作示意圖陽離子交換樹脂工作示意圖離子交換拄層析操作方式離子交換拄層析操作方式一、離子交換劑的處理、轉(zhuǎn)型和再生一、離子交換劑的處理、轉(zhuǎn)型和再生二、分離物質(zhì)的交換二、分離物質(zhì)的交換三、物質(zhì)的洗脫與收集三、物質(zhì)的洗脫與收集 一、離子交換劑的處理和轉(zhuǎn)型一、離子交換劑的處理和轉(zhuǎn)型l 一般程序：水泡，懸浮，酸或堿浸泡，洗滌至中性一般程序：水泡，懸浮，酸或堿浸泡，洗滌至中性l 疏水性離子交換劑疏水性離子交換劑 用用2-42-4倍的倍的2mol/L 2mol/L NaOHNa