流式最新綜述-1

1、流式細胞術曹林當代生命科學熱點信號傳導 研究技術: 二維電泳,流式細胞術,免疫熒光流式細胞術流式細胞術是對單細胞定量分析和分選的新技術。激光 光學檢測系統(tǒng) 信號 分析。細胞從新生到死亡 從細胞膜到細胞漿和核內物質及染色體，探討不同物質之間的關系。 細胞中測得多種參數(如DNA、RNA、蛋白質 和細胞體積等)，進行多信息分析。細胞生物學和生物醫(yī)學研究強而有力的手段。流式細胞儀稱作熒光激活細胞分選器（Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS）能快速、精確地測量通過檢測區(qū)液流中的各種粒子。這些粒子可以是細胞、大分子、乳膠滴或其他粒子。特點測量速度快，最快可在1

2、秒種內計測數萬個細胞可進行多參數測量，可以對同一個細胞做有關物理(大小)、化學特性(膜電位,鈣流)的多參數測量，并具有明顯的統(tǒng)計學意義是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術、計算機技術、流體力學、細胞化學、圖像技術等從多領域的知識和成果既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。 廣泛應用基礎和臨床醫(yī)學研究，有效研究方法。它在免疫學、腫瘤學、細胞遺傳學、病理學、放射生物學等學科中已形成了獨立的學科分支。定量分析細胞表面和細胞內抗原，以及對細胞分子水平的核酸含量的測量，這些參數的定量變化已被用于確定正常和異常細胞的分化和生正常和異常細胞的分化和生長，預示各種病理狀態(tài)下細胞的生物行為長，預示各種病理

3、狀態(tài)下細胞的生物行為。發(fā)展史 1930 年 Caspersson 和Thorell 開始致力于細胞的計數1934 年 Moldaven 是世界上最早設想使細胞檢測自動化的人他試圖用光電儀記錄流過一根毛細管的細胞1936 年 Caspersson 等引入顯微光度術1940 年 Coons 提出用結合了熒光素的抗體去標記細胞內的特定蛋白1947 年 Guclcer 運用層流和湍流原理研制煙霧微粒計數器1949 年 Wallace Coulter 提出在懸液中計數粒子的方法的專利1950 年 Caspersson 用顯微分光光度計的方法在UV 和可見光光譜區(qū)檢測細胞1953 年 Croslannd-

4、Taylor 應用分層鞘流原理成功的設計紅細胞光學自動數器同年Parker 和Horst 描述一種全血細胞計數器裝置成為流式細胞儀的雛形1954 年 Beirne 和Hutcheon 發(fā)明光電粒子計數器1959 年 B 型Coulter 計數器1965 年 Kamemtsky 等提出兩個設想一是用分光光度計定量細胞成分二是結合測量值對細胞分類1967 年 Kamentsky 和Melamed 在Moldaven 的方法的基礎上提出細胞分選的方法1969 年 Van Dilla Fulwyler 及其同事們在Los Alamos NM(即現在的National FlowCytometry Res

5、ource Labs)發(fā)明第一臺熒光檢測細胞計1972 年 Herzenberg 研制出一個細胞分選器的改進型能夠檢測出經過熒光標記抗體染色熒光標記抗體染色的細胞的較弱的熒光信號的細胞的較弱的熒光信號1975 年 Kohler 和Milstein 提出了單克隆抗體技術單克隆抗體技術為細胞研究中大量的特異的免疫試劑的應用奠定了基礎工作原理待測細胞被制成單細胞懸液，經特異性熒光染料染色后加入樣品管中，在氣體壓力推動下進入流動室，流動室內充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排成單列出流動室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細胞液柱。這種同軸流動的設計，使得樣品流和鞘液流形成的流束始終保持著一種分層鞘流的狀態(tài)。鞘液和

6、樣品流組成一個圓形的流束，一起自噴嘴的圓形寶石孔噴射出來，進入流動室，與水平方向的激光光束垂直相交。該區(qū)稱為測量區(qū)。利用樣品流和鞘流的氣壓差的層流原理，使細胞依次排列成單行，每個細胞以均等的時間依次通過測量區(qū)，被熒光染料染色的細胞受到強烈的激光照射后發(fā)出熒光，同時產生散射光。細胞發(fā)出的熒光信號和散射光信號，同時被熒光光電倍增管接收，被積分放大反轉換為電子信號輸入電子信息接收器、通過計算機快速而精確地將所測數據計算出來，結合多參數分析，從而實現了細胞的定量分析。 細胞儀工作示意圖濾片流式細胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散

7、射光和激發(fā)熒光散射光和激發(fā)熒光。FL-3FL-2FL-1熒光信號經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度，經光電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過模數轉換器，將連續(xù)的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理，將分析結果顯示在計算機屏幕上參數FSC 物理參數 SSC 物理參數 FL-1 熒光參數FL-2 熒光參數FL-3 熒光參數FL-2A area 熒光參數FL-2W width 熒光參數FSCSSCFSCSSC組圖FSCSSCFL-1FL-3FL-1FL-1FL

8、-1SSCFL-1SSC70.9925.2640.7558.960.9730.6649.847.7349.6045.7675.7024.06controlOrid8ug/mlOrid8ug/ml 12h +trailOrid4ug/ml 12h+trailOrid4ug/ml +trailOrid8ug/ml+trail熒光補償細胞分選細胞的分選是通過流束形成含有細胞的帶電液滴而實現的。在流動室的噴嘴上裝備有一個超聲振蕩壓晶體片，這個振蕩裝置使自噴嘴射出的液束破碎成千萬個小滴，流動的細胞就被分散在這些小水滴中。這時給流束一個電脈沖信號，使小水滴就全部帶上電荷。當帶有不同電荷的細胞液流經一對帶正

9、、負幾千伏恒定靜電電場的偏轉板時，帶電的小水滴就根據自身所帶的電荷性質產生偏轉，落入各自的收集容器中，不帶電荷的水滴就進入中間的廢液容器中，從而實現了細胞的分選。 A leading supplier for multi-color assays for flow cytometry and reagents for immunological assays流式細胞術的應用流式細胞術的應用淋巴細胞亞群分析淋巴細胞亞群分析細細 胞胞 凋凋 亡亡 細胞增殖細胞增殖表面抗原的檢測表面抗原的檢測流式科研應用流式科研應用膜電位膜電位其它細胞凋亡外源性途徑:通過細胞外信號激活細胞內的凋亡酶Caspase內

10、源性途徑:通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase活化的caspase可以將細胞內重要的蛋白降解,引起細胞凋亡檢測方法外源性啟動信號包括受體的配體,如TNF-Fas Ligand ;跨膜蛋白Granzyme B 顆粒酶B;非蛋白激活物Ca2+ 射線內源性信號反應性氧ROS可以特征性的引起細胞內損傷而誘發(fā)發(fā)生在線粒體膜上的凋亡典型特征1.線粒體膜電位的喪失2.細胞膜PS磷脂酰絲氨酸的外翻3.細胞核凝固縮和斷裂細胞膜檢測方法PS磷脂酰絲氨酸的外翻Annexin V fl-1細胞膜的完整性 PI & 7-AAD fl-3細胞膜PS磷脂酰絲氨酸的外翻相關凋亡事件細胞凋亡早期事件, PS暴

11、露在細胞膜外,Annexin V 分子量35-36KD的Ca2+依賴的磷脂結合蛋白,與PS親和力高Ka=10-10 ,Annexin V 被標記如FITC,PE.特點快,準確. Annexin V-FITC /PI雙染可區(qū)分凋亡,壞死和正常細胞.凋亡細胞膜完整,壞死細胞膜破碎. PI可嵌人DNA的紅色發(fā)光物質,不能通過完整的細胞膜,但是可以進入壞死細胞Time Course of TRAIL Induce Jurkat Cell ApoptosisDose Course of TRAIL Induce Jurkat Cell Apoptosis 細胞核相關凋亡檢測凋亡峰(DNA小片段峰)的檢測

12、DNA Ladder PI, 7-AAD TUNEL法細胞周期DNA含量0 200 400 600 8001000PI 熒光強度熒光強度(DNA含量含量)0 75 150 225 300DNA含量分析含量分析(PI法法)CountsG0/G1G2/MS異倍體DNA斷裂斷裂TUNEL 法DNA斷裂在凋亡初期形成200-250kp或30-35kb的大片段晚期進一步在核小體間斷裂,形成180-200bp的DNA斷裂碎片TUNEL(TdT mediated Dutp Nick End labeling) : 不依賴模板的方式在雙鏈或單鏈DNA的離3-OH末端將dUTP逐個加上 底物可以是 dUTP或B

13、rDU(無或有熒光標記) 顯示凋亡時DNA斷裂的程度直方圖Caspase相關檢測 Caspase 抑制性底物如DEVD,VDVAD,IEHD,LEHD,VAD上標記FITC綠色或sulfo-rhodamine紅色成為FITC-多肽-FMK或sulfo-rhodamine-多肽-FMK,標記物細胞膜通透性很好且無毒,在細胞凋亡中可與活化的Caspase不可逆的結合,反映活化的Caspase的量線粒體相關檢測JC-1該染料很容易進入正常細胞正常細胞的線粒體中并以多聚體的形式存在,發(fā)出紅色紅色熒光,凋亡凋亡細胞中線粒體膜電位崩潰,此染料無法聚集在線粒體中,只能以單體的形式存在細胞質中,發(fā)出綠色熒光綠

14、色熒光,紅綠熒光可以區(qū)分出正常和凋亡細胞FL-1通道檢測 峰圖細胞色素C釋放來檢測ADP/ATP比列 增殖細胞ATP水平高,凋亡細胞ADP水平提高,ATP水平下降,壞死細胞更顯著 luciferin+ATP+O2 Oxyluciferin+AMP+P+light谷胱甘肽 細胞凋亡早期GSH水平下降 GSH用來清除ROSNO檢測 凋亡細胞中NO合成的速度遠高于正常細胞 Luciferase,Mg2+細胞增殖細胞增殖CFSE一種熒光染料,能跟細胞骨架蛋白結合.細胞先用過量的CFSE染色,使骨架蛋白結合染料,洗去未結合的染料,再把細胞進行培養(yǎng).細胞分裂一代,染料平均分配到子細胞中去,熒光減少一半表面

15、抗原的檢測表面抗原的檢測基于抗體的檢測 將細胞表面特異的抗原的抗體上標記熒光物質,抗體與抗原特異識別 CD分子要點: 抗體與抗原的結合需要封閉,包被,洗細胞,可以同時檢測多種抗原,抗體的標記可以自由選擇 破膜劑的使用使得胞內的蛋白可以檢測JurkatHDMVCECOL0-205A l p h a v b eta 5 integrinAlphav beta3 integrin淋巴細胞亞群分析淋巴細胞亞群分析淋巴細胞亞群淋巴細胞亞群T淋巴細胞淋巴細胞(CD3+)名名 稱稱功功 能能輔助性/誘導性T細胞(Th/Ti)輔助和誘導細胞免疫和體液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-

16、輔助性T細胞(Th)誘導性T細胞(Ti)輔助細胞免疫和體液免疫誘導細胞免疫和體液免疫抑制性/殺傷性T細胞(Ts/Tc)抑制免疫反應/殺傷異源細胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29-抑制性T細胞(Ts)殺傷性T細胞(Tc)抑制細胞和體液免疫細胞毒性T細胞CD3+CD4+CD8+活化的T細胞在T細胞惡性增生時升高 CD3+CD4-CD8- 有調節(jié)功能的T細胞,其表達 / T細胞受體(TCR / ) CD45RA+CD45RO- 幼稚的/靜止的T淋巴細胞 當免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細胞毒性淋巴細胞的祖細胞時此細胞亞群較低 CD45RA-CD45RO+ 記憶性T淋巴細胞 病菌感染時升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T細胞, 感染時升高 感染時升高淋巴細胞亞群淋巴細胞亞群活化活化T淋巴細胞淋巴細胞名名 稱稱功功 能能CD3+HLA-DR+活化T細胞CD4+HLA-DR+ 活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞CD4+CD25+ 活