枸杞多糖對Ⅱ型糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制研究

1、枸杞多糖對ii型糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制研究孫桂菊，張勇，黃杰1，王少康，孫子林2,黃培林3(爾南大學(xué)公井衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，1南京市衛(wèi)生監(jiān)督所，2爾南大學(xué)附屬中大醫(yī)院內(nèi)分泌科，3東南人學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，南京210009)【摘要】h的：觀察枸杞多糖(lbp)對ii型糖鉍病人鼠杼臟的保護(hù)作川及機(jī)制。方法：川 鏈脲佐菌素(stz)結(jié)合高脂飼料建立ii型糖尿病大鼠模型，根據(jù)胰島素敏感指數(shù)、糖耐s 曲線下而積分為模型組，lbp低、中、高劑fi組120、40、80 mg/ (kgbw?d) j,同時設(shè)立正 常對照及正常高劑景對照組，試驗期1個月。檢測lbp對ii型糖以病人鼠血

2、淸糖基化終產(chǎn) 物-肽(ages-p)、糖基化血紅蛋a (hbalc)及腎臟a介素-8(il-8)含解:、1抒臟癇理變化的 影響。結(jié)果：lbp討降低11型糖尿病模型大鼠血清ages-p及血漿hbalc與腎臟中il-8含腎臟病變明顯改善。結(jié)論：lbp可降低模型大鼠糖基化終產(chǎn)物的產(chǎn)生，減少腎臟il-8 的分泌，從而預(yù)防糖尿病腎病的發(fā)生。營養(yǎng)學(xué)報，2006, 28 (1)： 47-50j 關(guān)鍵同：枸杞多糖；糖以病腎?。惶腔K產(chǎn)物；tl細(xì)胞介素-8糖w肉腎禍(diabetic nephropathy,dn)足糖以炳慢性ifll管并發(fā)癥之-，其發(fā)牛.機(jī)制尚無定 論，h前研究較多的足組織非酶糖菇化終產(chǎn)物(

3、advanced glycosylation endproducts,ages)嘗積 1、醛糖還原酶(aldose reductase, ar)活性改變2等。近年來又發(fā)現(xiàn)il-8與dn發(fā)病有 關(guān)l3j。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides, lbp)是枸杞子有效成分之一。我們矜 報道lbp具有降血糖作用，并nj提高模型大鼠的胰島素敏感桁數(shù)(isi)。本研究主耍觀察 lbp對ii型糖尿病人鼠腎臟保護(hù)作用及k機(jī)制。1材料與方法1.1樣品lbp按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行提取。1.2主要試劑、儀器鏈脈佐菌素(streptozotocin，stz), sigma公司產(chǎn)dna自動擴(kuò)

4、增儀，techne incorporated； eps 604穩(wěn)壓穂流電泳儀，南;科寶儀器研究所；島津-10a命效液相色譜儀， 日本島津公司；is-1001凝膠成像系統(tǒng)，上海復(fù)u科技有限公司。i.3 n型糖尿病大鼠模型的建立據(jù)文獻(xiàn)h建立n型糖鉍病動物模型，其條件為：(丨)胰島索敏感指數(shù)isi=lnl/(空腹血 糖值x血清胰島素水平)，isis正常大鼠isi的均值減1個標(biāo)準(zhǔn)差；(2)葡萄糖耐量實驗曲 線下側(cè)積26; (3)空腹胰島素不小于正常大鼠的均值減一個標(biāo)準(zhǔn)差。1.4動物分組將糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為4組，分別為模型組(model)，繼續(xù)給予高脂飼料，灌胃蒸 餾水；lbp低、小、高劑景組，在給

5、予高脂飼料的同吋湘胃給予lbp 20、40、80 mg/kg bwo 同時設(shè)正常對照組和正常lbp菇劑朵組，喂普通飼料，p者灌胃給予lbp8()mg/kgbw。持 續(xù)灌胃1個月沿，動物斷尾取血測定hbalc、血清ages-p含s,處死后取腎臟進(jìn)行病理學(xué) 檢査和用免疫組化及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒闯?rt-pcr)進(jìn)行腎臟il-8 mrna含景測定。1.5指標(biāo)測定1.5.1大鼠腎臟il-8含量的測定：免疫組化法：試劑盒購tl福州邁新生物制劑公操作少驟按試劑盒說明書進(jìn)行。人鼠 竹臟組織50100 mg,川異丙醇-乙醇-步法離心提取rna,使川晶芙生物工稈公司的試劑 盤，采用rt-pcr技術(shù)對腎臟組織屮的

6、mrna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，以p -actin作為內(nèi)參對照， pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在圖像掃描儀k觀察并掃描入電腦，用統(tǒng)計軟件處理， 得出h的條帶與內(nèi)參照條帶的光密度比值。1.5.2血清ages-p的測定：流動注射分析法6。1.5.3血漿hbalc的測定：采川德國拜耳公司的dca2000型糖化血紅蛋白分析儀測定。1.6統(tǒng)計方法數(shù)裾以x土s表示，采用sas 6.12統(tǒng)汁軟件對數(shù)裾進(jìn)行統(tǒng)計分析。 2結(jié)果2.1 lbf對血清ages和hbalc含量的影響(表1)table 1 the effect of lbp on ages level in serum andhbalc level in

7、 plasma in typeii diabetic rats ( t 土 j )group-bp (mg/kg bw)nhbalc in plasma (%)ages-p in serum (pg/ml)model77.7±1.35.22 ±0.80low lbp2086.3 士 1.3b3.07 ±0.45"med lbp4075.8±1 jb3.01 ±0.84mhigh lbp8085.2±0.9b2.73 土 0.84nh8073.8 ±0.9"2.84±0.80wnc0103.8&#

8、177;o.7m2.87 ±0.56"low=low dosc med=medium dose>high=high dosenh=high dose oflbp in normoh nc=normalcontrol：4>=15.89,<0.001： v=12.69./ko.ool: a: compared with the model group (/k0.05)b: compared with the model group and the normal group (zko.05) , the same in belowlbp低、屮、高劑撒組hbalc

9、水平明顯低于模型組，但仍m于正常對照組，差異有顯 著性(p<0.05)。各實驗組大鼠血清中age-p的水平，模型對照組，顯著高于其它各組 (f= 12.69, pc0.05)。2.2 lbp對腎臟病理學(xué)改變的影響(圖ia-e)a： normal control: b: model： c： lbp low dose group d s lbp medium dose group： e： lbp high dosse groupfig. 1 the histopathological observation of kidney undera：microscope (he staining)d

10、:實驗結(jié)束吋模型組光鏡下可見腎小球明敁增大，腎小球毛細(xì)血管基底膜彌漫性增厚、系膜區(qū)増寬，近端腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)大s空泡變性。lbp低、中、高劑g組與模型組相比,忖小球系膜區(qū)增寬、基底膜增厚均較輕，行小管空泡變性較少。2.3 lbp對模型大鼠腎臟il-8含量影響(圖2 a-e)a: normal control： b: model： c: lbp low dose group：d： lbp medium dose group： e： lbp high dose groupfig. 2 the histopathological observation of kidney undermicrosc

11、ope (immune histochemistry staining)2.3.1免疫組化法檢測：模型纟ii的腎小球®底膜和內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中冇il-8免疫陽性物質(zhì)沉積，lbpg各劑s組 的免疫陽性物質(zhì)沉積率明顯降低，腎小球基底膜上的顯色降低，正常對照組不顯色。2.3.2 rt-pcr：實驗結(jié)來時lbp各劑量組腎臟皮質(zhì)il-8 mrna含量明顯低于模型組，差異顯著(p<0.05),低、屮劑量組仍高于正常對照組(p<0.05),而高劑賢組與正常對照組比，差異不顯著(p0.05,圖3,表2)。3討論dn是糖尿病特別是非胰島素依賴型糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。ages是由蛋白質(zhì)的游

12、離氨基端與還原糖(如葡萄糖)經(jīng)過一系列非酶促反應(yīng)形成的結(jié)構(gòu)多樣的不可逆聚合物，研究 發(fā)現(xiàn)小分子糖基化終產(chǎn)物-肽(age-p)可與靶組織或蛋白(如膠原、低密度脂®白)再次共價聯(lián) 結(jié)形成第二代ages,從而在糖尿病、尿毒癥等慢性血管并發(fā)癥中發(fā)揮更重要的作用7。腎 臟對小分子ages-p清除能力下降可明顯加重糖尿癇患者血管病變的發(fā)生和程度8。糖尿病 人血清ages水平明高于正常人，動物實驗或臨床試驗證明，運用ages抑制劑-氨基胍 等可預(yù)防或延緩dn等并發(fā)癥的發(fā)生9, 10。另外tashiro等11報道dn患者尿中il-8含 量明顯升高，可通過鉍中il-8含m評估dn病人腎臟受損程度。il

13、-8分泌上調(diào)可使腎小管 上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，雉質(zhì)產(chǎn)生增多，加速腎小管間質(zhì)病變病理 過程。1234567450bp <-270bp3.lbp medium dose group; 4. lbp low dose group; 5.diabetic model group; 6.normal groupfig. 3 the comparison of il -8 mrna expression in the renal cortexgroupnlbpsupplement (mg/kg bw)il-8mrna rt-pcr dec trap ho rc sis(gray

14、 sc ale)m odd70.80 士 0.22low lbp8200.52±0.18med lbp7400.41 ±0.1 2：lhigh lbp8800.29 ±0.04"high in normal rats7800.23 士 0.03"nc1000.24 士 0.05mtable 2 the effect of lbp on il-8mrna expression inthe renal cortexf=78.42，/<0.0001 a! dunnetts t-test， compared with the modelgroup

15、 (/k0.05)本研究表明，各實驗組大鼠血清中ages-f以枚型對照組最高，與我們以往報道的fflm li2j,也與孫子林等的結(jié)果-致。lbp各劑量組大鼠血清ages-p與腎臟1l-8含量均明品 低于梭型對照纟ll(p<0.05)，說明lbp可降低糖鉍癇人&糖基化終產(chǎn)物的產(chǎn)生，進(jìn)而降低體內(nèi)il-8的分泌，從而減輕糖尿病所引起的腎臟損害，從腎臟病理組織學(xué)的改變也可得到證 實。故lbp作為降血糖，預(yù)防dn的保健食品與藥品具有廣闊的開發(fā)前景。i參考文獻(xiàn)j11孫子林，劉乃豐，孫桂菊，等.糖尿病小鼠血清糖基化終產(chǎn)物水平增高m.中國糖尿病雜 志，2000, 8： 315316.2 汽瑪莉，

16、賈力莉，武玉鵬，等.岌枯草醇提物對實驗性糖以病竹臟病變的作川j.山西屮 醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000, 1： 7-10.3 付搏，陳香美.細(xì)胞因子與腎臟疾病j.中華醫(yī)學(xué)雜志,1998,12： 1 18.4j張勇，孫桂菊，孫子林，等.枸杞多糖降血糖及預(yù)防糖鉍病行病作川的實驗研究uj.江蘇咝 藥，2003, 29： 157-160.5 何進(jìn)，張聲平.枸杞多糖研究j.食品科學(xué)，1995, 16： 14-21.6 wrobcl k，wr6bel k.garay-scvilla me，et al.novcl analytical approach to monitoring advanced glycation

17、 end products in human serum withon-line spectrophotometric and spectrofluoro-metric detection in a flow systemj.clin chem 1997,43： 15631569.17 jgugliucci a，menini t.circulating advanced glycation peptides in streptozotocin-induceddiabetic rats:evidence for preferential modi-fication of igg light ch

18、ainsj.life sci,l998,62： 21412150.l8j沈克勤，楊俊偉.糖基化終產(chǎn)物與血管病變及糖尿病腎病llj.腎臟柄與透析腎移植雜志， 1996, 5： 51-58.9li ym,steffes mdonnelly t，et al.preventionof cardiovascular and renal pathology of aging bythc advanced glycation inhibitor aminoguani-dincj.proc natl acad sci usa, 1996,93： 3902 -3907.10wolffenbuttel-bh，boulanger-cm，crijns-fr，etal.breakers of advanced glycation end productsrestore large artery properties in experimentaldiabetesljj.proc natl acad sci usa 1998,95： 4630-46