木棉不同部位總黃酮的減壓內(nèi)部沸騰提取及抗氧化性研究

1、    木棉不同部位總黃酮的減壓內(nèi)部沸騰提取及抗氧化性研究    翁艷英+張貞發(fā)+曾振芳+蘇秀芳+鐘燕鳳摘要：為優(yōu)化木棉花和木棉樹皮總黃酮的減壓內(nèi)部沸騰提取工藝，提高總黃酮提取率，采用單因素試驗的方法，考察解吸劑濃度、解吸時間、提取劑濃度、提取時間、提取溫度及提取劑用量等6個因素對提取效果的影響，結(jié)果表明：木棉花用20%乙醇2.5 ml/g解吸15 min，30%乙醇120 ml/g在50 和0.035 mpa下提取6 min，提取2次，提取率達到1.81%；木棉樹皮用40%乙醇2.5 ml/g解吸25 min，30%乙醇50 ml/g在50 和0.03

2、5 mpa下提取2次，每次5 min，提取率達到17.70%，而且木棉樹皮總黃酮提取率是木棉花總黃酮的9.78倍。與傳統(tǒng)醇回流提取相比，木棉花和樹皮的總黃酮提取率分別提高了0.06、1.00百分點，但提取時間分別縮短了78、60 min，提取溫度降低了34.7 。減壓內(nèi)部沸騰提取的木棉樹皮總黃酮抗氧化性研究表明，木棉樹皮總黃酮對超氧陰離子、亞硝基的清除能力較強，清除率最高達到76.82%、78.33%。減壓內(nèi)部沸騰法快速高效，用于木棉不同部位總黃酮的提取效果良好，木棉樹皮總黃酮具有較強的抗氧化活性。關鍵詞：木棉花；木棉樹皮；減壓內(nèi)部沸騰提?。豢傸S酮；抗氧化性： r284.2 文獻標志碼： a：

3、1002-1302（2016）09-0293-04木棉分布于我國廣東、廣西、云南等省區(qū)，系一種常規(guī)的藥用植物，其葉、樹皮、花等均可入藥，含有多種藥效成分，特別富含黃酮類化合物1。研究表明，黃酮類化合物具有很多藥效作用，特別是抗氧化性，將是一類良好的天然抗氧化劑2-5。目前，對木棉的研究集中在化學成分6-7和提取方法方面，而提取木棉成分的方法主要包括回流提取8和超聲波提取9等，提取時間長，而且對提取液中黃酮類成分的抗氧化性研究很少。近年來，減壓內(nèi)部沸騰法已經(jīng)成功應用到多種藥用植物黃酮成分的提取研究10-13，并取得了較好的提取效果，該法主要是在乙醇溶液對物料進行解吸后減壓低溫快速提取，發(fā)生的內(nèi)部

4、沸騰強化了提取過程14。本研究以木棉為原料，對木棉花和木棉樹皮總黃酮進行減壓內(nèi)部沸騰提取研究；對木棉皮減壓內(nèi)部沸騰提取液進行抗氧化性測定試驗。減壓內(nèi)部沸騰法短時間的低溫提取，可更好保留植物有效成分的原有生物活性，提高植物資源的開發(fā)利用價值，將為木棉及其他藥用植物的后續(xù)開發(fā)提供良好的理論依據(jù)，為天然抗氧化劑的開發(fā)打下基礎。1 材料與方法1.1 材料與儀器木棉花和木棉樹皮，采自廣西崇左市周邊；蕓香苷，購自上海金穗生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（dpph），購自美國sigma公司；鄰二氮菲、硫酸亞鐵、對氨基苯磺酸，購自天津市光復科技發(fā)展有限公司；鄰苯三酚、雙氧水，購自成都市科龍化工

5、試劑廠；鹽酸萘乙二胺、三羥甲基氨基甲烷，購自上海潤捷化學試劑有限公司；維生素c，購自國藥集團，分析純。超級恒溫水浴鍋，南京南大萬和科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；電子天平，梅特勒托利多儀器有限公司。1.2 方法1.2.1 減壓內(nèi)部沸騰提取1.2.1.1 木棉花總黃酮的減壓內(nèi)部沸騰提取稱取1.00 g木棉花粉末，用2.5 ml一定濃度的乙醇溶液均勻解吸一段時間，使乙醇溶液充分滲透木棉花粉末，加入一定體積一定溫度某濃度的乙醇溶液，迅速減壓至內(nèi)部沸騰（物料表面產(chǎn)生小氣泡）15，提取若干分鐘，抽濾，濾渣重復提

6、取1次，合并濾液，取5 ml濾液顯色測定總黃酮含量，計算木棉花總黃酮提取率。1.2.1.2 木棉樹皮總黃酮的減壓內(nèi)部沸騰提取稱取2.00 g 木棉樹皮粉末，用5 ml一定濃度的乙醇溶液均勻解吸若干分鐘，參照“1.2.1.1”節(jié)步驟提取，取5 ml濾液顯色測定總黃酮含量，計算木棉樹皮總黃酮算提取率。1.2.2 總黃酮測定方法 參照文獻13 的亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定總黃酮含量，繪制蕓香苷標準曲線為d=10.062c + 0.010 7，其中r2=0.999 3，線性范圍在462.4 g/ml，并計算木棉總黃酮提取率。提取率=c×v×k103×m×100%

7、，式中：m為稱取的木棉皮粉末的質(zhì)量，g；c為提取液的濃度，mg/ml；v為提取液的總體積，ml；k為提取液稀釋的倍數(shù)。1.2.3 單因素試驗1.2.3.1 木棉花總黃酮的單因素試驗 根據(jù)“1.2.1.1”節(jié)提取木棉花總黃酮，提取條件分別固定。固定條件為1.00 g木棉花粉末，解吸時間為20 min，提取溫度為50 ，100 ml 30%乙醇提取5 min，提取2次，考察不同解吸劑乙醇濃度（10%、20%、30%、40%、50%、60%）對總黃酮提取率的影響；固定條件為1.00 g木棉花粉末，解吸劑濃度為20%，提取溫度為50 ，100 ml 30%乙醇提取5 min，提取2次，考察不同解吸時間

8、（5、10、15、20、25、30 min）對總黃酮提取率的影響；固定條件為1.00 g木棉花粉末，解吸劑濃度為20%，解吸15 min，提取溫度為50 ，100 ml 30%乙醇提取2次，考察不同提取時間（2、4、6、8、10 min）對總黃酮提取率的影響；固定條件為1.00 g木棉花粉末，20%乙醇解吸15 min，提取溫度為50 ，100 ml乙醇提取6 min，提取2次，考察不同乙醇濃度（20%、30%、40%、50%、60%）對總黃酮提取率的影響；固定條件為1.00 g木棉花粉末，20%乙醇解吸15 min，100 ml 30%乙醇提取6 min，提取2次，考察不同溫度（30、40、

9、50、60、70 ）對總黃酮提取率的影響；固定條件為1.00 g木棉花粉末，20%乙醇解吸15 min，提取溫度為50 ，30%乙醇提取6 min，提取2次，考察不同提取劑用量（40、60、80、100、120、140 ml）對總黃酮提取率的影響。 1.2.3.2 木棉樹皮總黃酮的單因素試驗根據(jù)“1.2.1.2”節(jié)提取木棉樹皮總黃酮，提取條件分別固定。固定條件為2.00 g木棉樹皮粉末，解吸時間為20 min，提取溫度為50 ，100 ml 30%乙醇提取5 min，提取2次，考察不同解吸劑乙醇濃度（20%、30%、40%、50%、60%）對總黃酮提取率的影響；固定條件為2.00 g木棉樹皮粉

10、末，解吸劑濃度為40%，提取溫度為50 ，100 ml 30%乙醇提取5 min，提取2次，考察不同解吸時間（5、10、15、20、25、30 min）對總黃酮提取率的影響；固定條件為2.00 g木棉樹皮粉末，40%乙醇解吸25 min，提取溫度為50 ，100 ml 30%乙醇提取2次，考察不同提取時間（3、5、7、9、11 min）對總黃酮提取率的影響；固定條件為2.00 g木棉樹皮粉末，40%乙醇解吸25 min，提取溫度為50 ，100 ml提取劑提取5 min，提取2次，考察不同提取劑濃度（20%、30%、40%、50%、60%）對總黃酮提取率的影響；固定條件為2.00 g木棉樹皮粉

11、末，40%乙醇解吸25 min，100 ml 30%乙醇提取5 min，提取2次，考察不同溫度（30、40、50、60、70 ）對總黃酮提取率的影響；固定條件為2.00 g木棉樹皮粉末，40%乙醇解吸25 min，提取溫度為50 ，30%乙醇提取5 min，提取2次，考察不同提取劑用量（40、60、80、100、120、140 ml）對總黃酮提取率的影響。1.2.4 傳統(tǒng)醇提按照減壓內(nèi)部沸騰提取木棉花、木棉樹皮總黃酮的最佳條件回流提取1 h后抽濾，濾渣重復回流提取1 h，合并2次濾液，顯色法測定總黃酮的含量，計算總黃酮提取率，并保留木棉樹皮總黃酮的提取液進行抗氧化性測定。1.2.5 木棉樹皮總

12、黃酮的抗氧化性測定161.2.5.1 dpph自由基清除率的測定配制不同濃度的木棉樹皮總黃酮樣品溶液，取樣品溶液2.00 ml，加入2.00 ml 0.3 mmol/l的dpph溶液作為待測組；無水乙醇取代dpph 溶液作為對照組；同體積 dpph溶液加無水乙醇作為空白組，搖勻后避光靜置30 min，分別在517 nm處測定，吸光度分別記為d測、d對、d空。維生素c作陽性對照，清除率計算公式：dpph自由基清除率=1-（d測-d空）d對×100%。1.2.5.2 超氧陰離子清除率的測定配制不同濃度的木棉樹皮總黃酮樣品溶液，在10 ml比色管中加入5.00 ml的tris-hcl緩沖溶

13、液，加1.00 ml樣品液，25 恒溫水浴10 min，再加入同溫的鄰苯三酚0.20 ml，蒸餾水定容，迅速搖勻后立即在420 nm處每隔30 s測1次吸光度，測定4 min。等體積10 mmol/l hcl取代鄰苯三酚作為空白組，等體積蒸餾水取代樣品液作為對照組。維生素c作陽性對照，清除率計算公式：o-2· 清除率=v對-v樣v對×100%。式中：v樣為樣品組在420 nm 處吸光度變化曲線的斜率；v對為對照組在420 nm 處吸光度變化曲線的斜率。1.2.5.3 羥基自由基清除率的測定配制不同濃度的木棉樹皮總黃酮樣品溶液，取1.00 ml樣品溶液加入1.00 ml7.5

14、 mmol/l 鄰二氮菲溶液，再加5.00 ml 50 mmol/l pbs磷酸緩沖液、0.50 ml 7.5 mmol/l feso4溶液及1.00 ml 0.1% h2o2，蒸餾水定容，搖勻后37 恒溫水浴60 min，510 nm處測定吸光度，記為d樣。蒸餾水代替樣品液作為對照組，吸光度記為d對；蒸餾水代替樣品液和h2o2作為空白組，吸光度記為d空。維生素c作陽性對照，清除率計算公式：·oh清除率=d樣-d對d空-d對×100%。1.2.5.4 亞硝基清除率的測定（1）nano2標準曲線的繪制：準確配制10 g/ml nano2水溶液，分別取0.00、1.00、2.0

15、0、3.00、4.00、5.00 ml于50 ml容量瓶，加入30 ml蒸餾水，再加2.00 ml 4 g/l對氨基苯磺酸溶液，搖勻后靜置5 min，再加入1.00 ml 2 g/l鹽酸萘乙二胺溶液，蒸餾水定容，搖勻，靜置15 min，540 nm處測定吸光度。以nano2濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，曲線方程為：d=0.744c+0.070 8（r2=0.999 4）。（2）亞硝基清除率測定：配制不同濃度的木棉樹皮總黃酮樣品溶液，在10 ml比色管中加入1.00 ml樣品液和2.00 ml亞硝酸鈉溶液，檸檬酸緩沖液補充至5.00 ml，37 恒水浴60 min，取出后在540 n

16、m處測定吸光度，根據(jù)nano2標準曲線計算nano2濃度，記為c樣；蒸餾水代替樣品液作為標準組，nano2濃度記為c標。維生素c作陽性對照，清除率計算公式：亞硝基（no2-）清除率= c標-c樣c標×100%。2 結(jié)果與分析2.1 單因素試驗2.1.1 解吸劑濃度對總黃酮提取率的影響由圖1可知，隨著解吸劑濃度的增加，木棉花和木棉樹皮總黃酮提取率都呈先增后減的趨勢，在20%處木棉花總黃酮提取率達到最大值，在40%處木棉樹皮總黃酮提取率達到最大值，繼續(xù)增加乙醇濃度，可能會影響到乙醇與植物細胞的相溶性，導致木棉中黃酮成分溶解不夠充分。2.1.2 解吸時間對總黃酮提取率的影響 由圖2可知，隨

17、著解吸時間的增加，木棉花總黃酮提取率呈先增后減的趨勢，解吸15 min時提取率達到最大值，當乙醇溶液已經(jīng)充分滲透到物料內(nèi)部，再繼續(xù)增加解吸時間，會增加其他成分的溶出，造成提取率下降；當解吸25 min時木棉樹皮總黃酮提取率達到最大值，已經(jīng)達到飽和，已經(jīng)沒有必要增加解吸時間。 2.1.3 提取時間對總黃酮提取率的影響由圖3可看出，木棉花和木棉樹皮的總黃酮分別在6 min時、5 min時已經(jīng)提取完全，主要是因為內(nèi)部沸騰提取傳質(zhì)過程屬于對流擴散過程，提取速度是普通分子擴散的100倍17。繼續(xù)增加提取時間，會增加其他成分的溶出率。2.1.4 提取劑濃度對總黃酮提取率的影響由圖4可看出，木棉花和木棉樹皮

18、總黃酮提取率在提取劑濃度為30%時達到最大值，隨后一直下降。繼續(xù)增加提取劑濃度，雖然增加了濃度差，但是周邊濃度高的乙醇包圍著物料，產(chǎn)生一定作用力，反而使得總黃酮溶出率減小。2.1.5 提取溫度對總黃酮提取率的影響由圖5可知，50 是最佳提取溫度。溫度太低，木棉內(nèi)部乙醇發(fā)生內(nèi)部沸騰不夠充分；溫度過高，導致木棉內(nèi)部的乙醇發(fā)生內(nèi)部沸騰太強，使得內(nèi)部乙醇擴散速度太快，導致總黃酮溶出量減少。2.16 提取劑用量對總黃酮提取率的影響由圖6可知，隨著提取劑乙醇用量的增加，總黃酮提取率呈先增加后減小的趨勢，120 ml乙醇是提取木棉花總黃酮的最佳用量，100 ml乙醇是提取木棉樹皮總黃酮的最佳用量。提取劑用量

19、太少，總黃酮提取不充分，提取劑用量太多，稀釋了物料內(nèi)部的乙醇，導致提取率下降。綜上可知，減壓內(nèi)部沸騰單因素試驗確定木棉花總黃酮的最佳提取條件為：1.00 g木棉花物料，20%乙醇解吸15 min，120 ml 30%乙醇在50 、0.035 mpa下提取6 min，提取2次；木棉樹皮總黃酮的最佳提取條件為：2.00 g木棉樹皮物料，40%乙醇解吸25 min，100 ml 30%乙醇在50 、0.035 mpa條件下提取2次，每次5 min。2.2 減壓內(nèi)部沸騰法與傳統(tǒng)醇提法的比較結(jié)果按照減壓內(nèi)部沸騰法最佳提取工藝和“1.2.4”節(jié)傳統(tǒng)醇回流提取木棉花、木棉樹皮總黃酮，比較結(jié)果如表1所示。從表

20、1可看出，傳統(tǒng)醇回流提取木棉花總黃酮和木棉樹皮總黃酮的提取率均稍低于減壓內(nèi)部沸騰法，但由于減壓內(nèi)部沸騰法的提取溫度低，提取時間短，在減壓條件下可以更好地保護總黃酮的生理活性。由此可見，應用減壓內(nèi)部沸騰法提取木棉總黃酮是可行有效的，并且木棉樹皮中總黃酮提取率是木棉花的9.78倍。2.3 木棉樹皮總黃酮抗氧化性測定結(jié)果2.3.1 dpph自由基清除率的測定結(jié)果由圖7可知，在給定的濃度范圍，隨著木棉樹皮總黃酮提取液及維生素c濃度的增大，兩者對dpph自由基的清除能力都在增加，當濃度達到0.2 mg/ml時清除率基本不變，但木棉樹皮總黃酮清除dpph 自由基的能力不如維生素c。2.3.2 超氧陰離子清

21、除率的測定結(jié)果由圖8可知，在測定的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，木棉樹皮總黃酮和維生素c對超氧陰離子的清除率均增大，而且木棉樹皮總黃酮與維生素c對超氧陰離子的清除率相當，最大達到76.82%，說明木棉樹皮總黃酮對超氧陰離子有較強的清除能力。2.3.3 羥基自由基清除率的測定由圖9可知，木棉樹皮總黃酮清除羥基自由基的能力隨著濃度的增大呈先增后減的趨勢。在低濃度0.40.7 mg/ml范圍內(nèi)，兩者對羥基自由基的清除率基本一致，清除率達到40.43%；當濃度達到0.8 mg/ml 時，木棉樹皮總黃酮清除羥自由基的能力明顯低于維生素c。2.3.4 亞硝基清除率的測定由圖10可知，在測定的濃度范圍，木棉樹

22、皮總黃酮與維生素c對亞硝基的清除率隨著濃度的增大而增加。在0.11.0 mg/ml低濃度范圍內(nèi)，總黃酮清除亞硝基的能力高于維生素c，當濃度達到1.2 mg/ml時，對照品維生素c清除亞硝基的能力明顯高于總黃酮。整體來說，木棉樹皮總黃酮對亞硝基具有較強的清除能力，清除率最大達到78.33%。3 結(jié)論采用單因素試驗對木棉不同部位（花和樹皮）總黃酮的減壓內(nèi)部沸騰提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳提取條件為：1.00 g 木棉花，20%乙醇解吸15 min，120 ml 30%乙醇在50 、0.035 mpa 下提取6 min，提取2次；2.00 g木棉樹皮，40%乙醇解吸25 min，100 ml 30%乙

23、醇在50 、0.035 mpa下提取2次，每次5 min。在此條件下，木棉花總黃酮提取率為1.81%，木棉樹皮總黃酮提取率為17.70%。與傳統(tǒng)醇提比較，該法提取溫度低，提取時間短，總黃酮提取率高。抗氧化活性試驗表明，減壓內(nèi)部沸騰法提取的木棉樹皮總黃酮對dpph自由基、超氧陰離子、羥基自由基和亞硝基具有一定的清除作用，其中對超氧陰離子和亞硝基的清除作用明顯，說明木棉樹皮總黃酮具有較好的抗氧化活性。參考文獻：1李旭森，許光凱，王國凱，等. 木棉的化學成分及藥理作用研究進展j. 中國野生植物資源，2015，34（3）：42-45.2陳叢瑾，王 琪，李 欣.黃酮類化合物抗氧化和抑菌生物活性研究進展j

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