柿子葉中黃酮化合物的分離與鑒定

1、學(xué)位論文柿子葉中黃酮化合物的分離與鑒定separation and appraisal of flavonoids in persimmon leaf作者姓名：陳兆輝學(xué)科、專業(yè)： 化學(xué)工程與工藝 學(xué) 號(hào)：042037103指導(dǎo)教師：衛(wèi)靜莉完成日期： 2008. 6. 10中北大學(xué)分校the branch of north university of china柿子葉中黃酮化合物的分離與鑒定摘要本論文闡述了柿葉的化學(xué)成分以及結(jié)構(gòu)，介紹了黃酮類化合物紫外光吸收原理。主 要研究了利用薄層色譜法和紫外分光光度法分離與鑒定黃酮類化合物。英屮，薄層色譜 法分離時(shí)使用了多種層析液對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)

2、止丁醇一乙醇一乙酸一甲酸 體系效果最佳。并建立以蘆丁為對(duì)照品的柿葉中總黃酮含量測(cè)定方法，采用紫外分光光 度法對(duì)柿葉中總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定。以及利用上述兩種方法分析了四種大孔吸附樹(shù)脂 吸附黃酮類化合物的吸附性能，發(fā)現(xiàn)30-60 r的吸附性能最佳。并ii通過(guò)黃酮化合物薄 層分離結(jié)果和紫外吸收光譜淺論了四個(gè)黃酮斑點(diǎn)為何種黃酮。關(guān)鍵詞：蘆丁薄層色譜法紫外分光光度法吸附性abstractin this paperjt is the chemical compositions and their structures in the leaves of persimmon that were describ

3、ed and the ultraviolet light absorption principle of the yellow ketone compound that having been introduced.lt is that using the thin layer chromatography and the uv spectrophotometry part for and identify the yellow ketone mainly.among them, the thin layer chromatography has used various tier of xi

4、 liquid to carry out separation on the yellow ketone compound, finding that set butanol right alcohol acetic acid formic acid system effect is optimum.did establish a method which acted rutin as standard sample to measure determination of total flavonoids in persimmon leaf. meanwhile.the contents of

5、 the total flavonoids in persimmon leaf were measured and analyzed by using the the uv spectrophotometry .the big four kinds hole adsorptions resin having made use of above-mentioned two kinds method analysis adsorbs and the yellow ketone compound adsorption function , we discover that the adsorptio

6、n functions of the 30-60 eye is best.and, by the fact that yellow ketone compound thin layer separates result and the ultraviolet absorption spectrum, the tray has commented on yellow four ketone flecks.keywords:rutin ； thin layer chromatography(tlc) ； uv spectrophotometry; adsorption function目錄摘要ia

7、bstractii引言11. 文獻(xiàn)綜述21. 1柿葉化學(xué)成分的研究21. 1. 1黃酮類21. 1.2三菇類21. 1.3有機(jī)酸21.1.4香豆素類21. 1.5其他類21.2黃酮類化合物31.2. 1黃酮類31.2.2黃酮醇類41.2.3 二氫黃酮類41.2.4 二氫黃酮醇類51.2.5異黃酮類51.2.6 二氫異黃酮類61.2.7 查耳酮61.2.8 二氫査耳酮類71.2.9橙酮類71.2. 10花色素類71.2. 11黃烷醇類81.2. 12雙苯毗酮類81.2. 13高界黃酮91.2. 14其他黃酮類91.3黃酮類化合物的性質(zhì)101.4黃酮類化合物的捉取102.1材料，試劑與儀器設(shè)備11

8、2. 1. 1材料112. 1.2試劑122. 1.3儀器設(shè)備122.2實(shí)驗(yàn)原理122. 2. 1色譜分離方法及原理122. 2. 2鑒定方法原理及應(yīng)用132.3實(shí)驗(yàn)方法162.3.1薄層色譜法鑒定162. 3.2紫外分光光度法分析172. 3.3對(duì)四種大孔吸附樹(shù)脂的分析192.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果242.4.1薄層層析效果242. 4.2 測(cè)定波長(zhǎng)262.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)262.4.4精密度實(shí)驗(yàn)27結(jié)論28參考文獻(xiàn)29致謝31近年來(lái)，除了從藥材中提取分離黃酮類化合物不斷被報(bào)道外，一些農(nóng)作物如柑橘、 山楂等的黃酮類化合物的分離鑒定也口益受到人們的關(guān)注。研究表明，以往被作為廢棄 物處理的柿葉、荷葉、葡萄

9、渣、蘋(píng)果渣中富含黃酮類化合物。柿葉中含冇蘆丁、黃酮昔、 vc、胡蘿卜素、生物態(tài)堿、糅質(zhì)、酚類、香豆素、三祜類、有機(jī)酸、揮發(fā)油植物輜 醇、樹(shù)脂、還原糖、維生索c和必須氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì)。柿葉作為 藥用始載于明.滇南木草，曰：“經(jīng)霜葉敷賺瘡”。以后諸多本草及醫(yī)（藥）書(shū)也 多有記載，其中含有的黃酗類化合物是約用植物中主要活性成分z-,具有消除氧口由 基、抗氧化、抗過(guò)敏、抗炎、抗高血壓、抗菌、抗過(guò)敏、抗突變、抗腫瘤、保肝、類似 雌激索的作用、瀉下、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)和抗病毒以及殺蟲(chóng)等廣譜的生理活性，且毒性 較低，因此述可用作食品、化妝品的天然添加劑，如甜味劑、抗氧化劑、食用色素等。 而蘆

10、丁是黃酮類化合物中主耍含量，我國(guó)地域遼闊，有著大量的柿葉資源，柿樹(shù)葉的綜 合開(kāi)發(fā)利用具有廣闊的市場(chǎng)前景。特別是近30年來(lái)黃酮類化合物一直是國(guó)內(nèi)外研究開(kāi) 發(fā)利用的熱點(diǎn)，目前，隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)向老齡化的轉(zhuǎn)變，對(duì)預(yù)防和治療心腦血管疾病 的藥物如蘆丁、懈皮素等的需求量逐年增加，因此開(kāi)發(fā)利用我國(guó)極為豐富的植物資源， 從中提取黃酮類化合物對(duì)于發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟(jì)具冇很好的經(jīng)濟(jì)效益。這也是本實(shí)驗(yàn)選取蘆丁 的主耍原因之一。并h ,現(xiàn)在最新研究表明，黃酮類化合物能育接殺傷禽流感病毒， 可以用于治療和預(yù)防禽流感病毒，能在制備抗禽流感病毒的藥物和添加劑屮得到廣泛應(yīng) 用。柿葉中的黃酮類物質(zhì)在人體內(nèi)有一定的勝利功能，而定性定量

11、檢測(cè)始對(duì)其進(jìn)行分類 和治理那個(gè)評(píng)價(jià)的前捉條件，盡管其它的一些現(xiàn)代化的一起分析方法如毛細(xì)管電泳和微 膠束毛細(xì)管色譜也已經(jīng)被應(yīng)用于黃酮類物質(zhì)的檢測(cè)，但n前柿葉屮黃酮類化合物的測(cè)定 方法述是以紫外分光光度法、鋁鹽顯色分光光度法、高效液相色譜法為主，而r主要以 分光光度法為主測(cè)定總黃酮的含量。本文主耍以薄層色譜法、紫外分光光度法對(duì)柿葉提取物中的黃酮類進(jìn)行了分離與鑒 定，方法簡(jiǎn)便快速，結(jié)果可靠，為柿葉及葉中黃酮類物質(zhì)的研究提供了參考。1.文獻(xiàn)綜述1.1柿葉化學(xué)成分的研究1.1.1黃酮類柿葉(d.kakil.)中的主要有效成分是黃酮類化合物?？谇?，己發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物 有蘆丁、黃罠貳(astraglin)

12、、異懈皮素(isoquercitrin) 山蔡酚3-0- 6d葡萄糖成 (kacmfctol-3- p -d-glucopyranosidc)山蔡酚(kaemfcrol) 桝皮素(quercetin) 山蔡酚 3-0- q l鼠李糖貳(kaempfetol 3-o-l-rhamnopyranoside),山蔡酚 3- p -d 一 木糖貳 (kaempferol-3- b -d-xylopyramoside) 山蔡酚 3-o- al阿拉伯糖貳(kaempferol3-o-a -l-arabnopyranoside) 榊皮素 3-o-2*-o-(3.4.5-三輕基苯甲酰)卜葡萄糖h(querce

13、tin3-o -(2* ' -o-galloyl)- p -d -glucopyranoside),絲桃貳(w皮素3半乳糖或)、楊梅樹(shù)皮貳等。1.1.2三砧類柿葉屮含有多種三砧類化合物。如:樺木酸(betulicacid)齊墩果酸(oleanolic)、烏蘇 酸(ursolicacid)、熊果貳(uvasol)等。1. 1.3有機(jī)酸柿葉所含有機(jī)酸包括琥珀酸(succinicacid)苯甲酸(benzoicacid)、水楊酸(salicylic) 糖酸(pyromucicacid) 丁香酸(syringicacid)、對(duì)疑基苯甲酸、原兒茶及卩引味基醋酸等1. 1.4 香豆素類據(jù)報(bào)道，香豆

14、索類主要有藝蓉亭(scopolerin). 6 -疑基7甲氧基香豆索等。植物 笛醇類植物輜醇類主要是菜子笛醇(campesterol)豆笛醇(stiginasterol), b 一谷笛醇(b sitosterol)等 qb。1. 1.5其他類柿葉尚含有糅質(zhì)類，女口：司布(shibuol)和什)一無(wú)色飛燕草素3葡萄糖貳 (+)-leucadelphinidin-3-glucoside,還含有酚類、樹(shù)脂、多糖、揮發(fā)油、葉綠索、胡蘿 b m(carotene)隱黃素及人量的維生索c,維生索c含量最高吋達(dá)2135mg/100g,比常 見(jiàn)水果屮華yr猴桃、桔、橙等高幾十倍。但需注意柿葉的釆收期，因柿葉中

15、維生素含 量的高低與柿葉的生長(zhǎng)期有關(guān)(a =0.01),以5月份含量最高。除此以外，還含有抗氧化 劑(該種天然抗氧化劑可用于食物及化妝品，安全無(wú)毒)、16種氨基酸及多種微量元素。1.2黃酮類化合物黃酮類化合物（flavonoids）主要是指基本母核為2-苯基色原酮(2-phenyl-chromone)類化合物,現(xiàn)在則是泛指兩個(gè)苯環(huán)（a-與b-環(huán)）通過(guò)中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)血成的一系列化合物o色原酮生物合戊研究表明a環(huán)來(lái)|2于三個(gè)丙二酰輔酶a, b環(huán)來(lái)|2亍桂皮酰輔酶a根據(jù)中央三碳鏈的氧化程度、b-壞連接位置（2-或3-位）以及三碳鏈?zhǔn)欠駱?gòu)成壞狀等特點(diǎn)，可將重要的天然黃酮類化合物分類如下：1.2.1

16、黃酮類黃酮類是以2-苯基色原酮為基本母核，3位無(wú)含氧取代的一類化合物。天然黃酮a 環(huán)的5, 7位兒乎同時(shí)帶有劭基，而b環(huán)常在4,位有輕基或甲氧基，3,位有時(shí)也有軽常見(jiàn)的黃酮及其昔類冇芹菜索、木犀草索、芹菜素木樨草素1.2.2黃酮醇類黃酮醇類在黃酮基木母核的3位上連有輕基或其他含氧基團(tuán)。黃酮醇常見(jiàn)的黃酮醇及其昔類有山奈酚、h000h0h00h0hr=hr二蕓香糖楊梅素柳皮素蘆丁1.2.3二氫黃酮類二氫黃酮類結(jié)構(gòu)可看作是黃酮基本母核的2、3位雙鍵被氫化而成。如橙皮中的橙皮素和橙皮昔；甘草中的甘草素和甘草昔。甘草索r=h甘草昔r=glc橙皮索r二h 橙皮營(yíng)r二蕓香糖1.2.4二氫黃酮醇類二氫黃酮醇是

17、黃酮醇類的2、3位被氫化的黃酮類化合物，而且常與相應(yīng)的黃酮醇共存于同一植物屮。二氫黃酮醇類如滿山紅葉中的二氮柳皮索和柳皮索共存，桑枝中的二氮桑色索和桑色索共存。1.2.5異黃酮類異黃酮類黃柏索-7-0-葡萄糖昔異黃酮類母核為3-苯基色原酮的結(jié)構(gòu)，即b環(huán)連接在c環(huán)的3位上。豆科植物葛糧屮所含有的大豆素、大豆昔、大豆素-7,-二葡萄糖苜、葛根素和大豆?fàn)Ir1二r2二r3二h葛根素r1二r3二h r2=glcr2 二 r3 二 ii rl=glc葛根素木糖甘均屬于界黃酗類化合物。大豆索-7, 4f -二葡萄糖昔葛根素木糖昔r1二h r2=r3=glcrl=glc r2=xvl r3=h1.2.6二氫異

18、黃酮類二氫異黃酮具有異黃酮的2、3位被氫化的基本母核。二氫異黃酮醇類如中藥廣豆根當(dāng)中含有的紫檀素、三葉豆紫檀昔、高麗槐素具有抗癌活性，昔的活性強(qiáng)于昔元。毛魚(yú)藤中所含冇的魚(yú)藤酮也屬于二氫異黃酮的衍生物，具冇較強(qiáng)的殺蟲(chóng)和毒魚(yú)作用。它們都屬于二氫異黃酮類的衍生物。00：r二ch3三葉豆紫檀苛r=glc 高麗槐素r二ii1.2.7查耳酮結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為二氫黃酮c環(huán)的1、2位鍵斷裂生成的開(kāi)環(huán)衍生物，即三碳鏈不構(gòu)成環(huán)。 個(gè)2_365 查耳酮0在酸的作用廠 查耳酮可轉(zhuǎn)化為無(wú)色的二氫黃酮，堿化后又轉(zhuǎn)為深黃色的2' -輕 基查耳酮。23h+0h-如紅花的花中含有的紅花營(yíng)紅屁甘1.2. 8二氫查耳酮類二氫杳耳酮

19、為杳耳酮a b雙鍵氫化而成。o二氫查耳酮類二氫查耳酮在植物界分布極少，如薔薇科梨屬植物根皮和蘋(píng)果種仁屮含有梨根昔。1.2.9結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為c環(huán)為含氧五元環(huán)。梨根甘母核碳原子的編號(hào)也與其他黃酮類不同。此類化合物較少見(jiàn)，主好在于玄參科、菊科、橙酮類苦苣苔科以及單子葉植物沙草科中，如在黃花波斯菊花中含有的硫磺菊素屬于此類。硫堿菊素1.2. 10花色素類結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是基本母核的c環(huán)無(wú)撥基,1位氧原子以（金羊）鹽形式存在。 花色素類花色索在中藥中多以昔的形式存在。花色索是使植物的花、果、葉、莖等呈現(xiàn)藍(lán)、 紫、紅等顏色的色素，如矢車(chē)菊首元、飛燕草營(yíng)元和天竺葵莒元以及它們所組成的營(yíng)最 為常見(jiàn)。矢車(chē)菊苛元飛燕草營(yíng)元天

20、竺葵甘元r1=oh r2=hr1=r2=ohr1=r2=h根據(jù)c環(huán)上的3, 4位存在疑基的情況分為黃烷-3-醇和黃烷-3, 4-二醇。黃烷-3- 醇類，又稱兒茶素°、黃烷三醇類0h主要存在于含糅質(zhì)的木木植物屮。如兒茶素為屮藥兒茶屮的主要成分，有四個(gè)光學(xué) 異構(gòu)體，但在植物中主要有異構(gòu)體兩個(gè)，兒茶素和表兒茶素。hoh表兒茶索兒茶索2.黃烷-3, 4-二醇類又稱為無(wú)色花色素類,黃烷一3, 4 二醇類這類化合物在植物界中分布很廣，在含糅質(zhì)的木木植物和蕨類植物中更為多見(jiàn)，如: 無(wú)色矢車(chē)菊素。0h無(wú)色車(chē)菊素1.2.12雙苯毗酮類又稱為苯駢色原酮，母核由苯環(huán)和色原酮的2, 3位駢合而成，是一種特姝

21、類型常分布在龍丿k1科、藤黃科、百合科植物當(dāng)中，如：存在于石葦、芒果葉和知母葉屮具有止咳去痰作用的界芒果素。1.2. 13高異黃酮異芒杲素包括雙黃酮類，黃酮木脂體類，生物堿型黃酮等。銀杏索榕堿基木母核為3-節(jié)基色原酮高界黃酮類1.2. 14其他黃酮類1.3黃酮類化合物的性質(zhì)黃酮類化合物大多具有顏色，在植物休內(nèi)大部分與糖結(jié)合成甘，一部分以游離形式 存在的黃酮類化合物廣泛分布丁植物界中，而冃生理活性多種多樣，引起了國(guó)內(nèi)外的廣 泛重視，研究進(jìn)展很快。僅截止到1974年為止，國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的黃酮類化合物共1674個(gè)(主要是天然黃類, 也有少部分為合成品，其中昔元902個(gè)，昔722個(gè)),并以黃酮醇類最為常

22、見(jiàn)，約占總 數(shù)的三分之一，其次為黃酮類，山總數(shù)的四分之一以上，其余則較少見(jiàn)。至于雙黃酮類 多局限分布于裸子植物，尤其松柏綱，銀杏綱和鳳尾綱等植物中。至1993年，黃酮類 化合物總數(shù)已達(dá)到4000個(gè) 黃酮類化合物具有以下性質(zhì)：(1) 黃酮類化合物多為晶形固體，少數(shù)(如黃酮甘類)為無(wú)定形粉末，有較高的熔點(diǎn), 分子結(jié)構(gòu)中，大多帶有酚性疑基，因此具有酚類化合物的通性。另外，分子中還常帶有 毗酮環(huán)或碳基，構(gòu)成了生色團(tuán)的基本結(jié)構(gòu)，根據(jù)輕基的數(shù)目，結(jié)合的位置與交叉共扼體 系，構(gòu)成了黃酮類化合物的呈色。一般來(lái)說(shuō)，黃酮及黃酮醇和其苛類多呈灰黃到黃色。(2) 黃酮類化合物的溶解度，因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)(昔或昔元，單糖

23、苜，雙糖苜或三糖 昔)不同而有很大差異。一般游離昔元難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī) 溶劑及稀堿液中;而黃酮昔一般易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑，難溶于或不溶于苯、 氯仿等有機(jī)溶劑。(3) 黃酮類化合物多具冇強(qiáng)的熒光，在紫外燈照射下呈亮黃、黃綠、亮藍(lán)、暗棕等 顏色。(4) 黃酗類化合物對(duì)鹽酸鎂粉或汞齊呈鮮紅、紫色或黃色反應(yīng)。結(jié)構(gòu)中有3-oh, 5oh或鄰位疑基者，均能與金屬鹽類試劑，如:鋁鹽、鎂鹽、總鹽和鐵鹽等形成顏色較 深的絡(luò)合物。天然黃酮類化合物多以營(yíng)類形式存在，并且，由于糖的種類、數(shù)量、聯(lián)接位置及聯(lián) 接方式不同，可以組成各種各樣的黃酮昔類。木本植物中的黃酮類物質(zhì)多為懈皮素、山荼

24、酚、8-徑基黃酮，植物界中黃酮類成分與黃 酮醇類成分很少共存于同一植物中，二氫黃酮和二氫黃酮醇類常存于同一植物中。1.4黃酮類化合物的提取黃酮類化合物的提取方法有：水蒸氣蒸憾法、溶劑浸提法、超臨界流體提取法等。 定。2.實(shí)驗(yàn)部分2. 1材料，試劑與儀器設(shè)備2.1.1材料柿葉提取液（70%乙醇微波提?。?蘆j表21蘆丁對(duì)照品性質(zhì)tab. 2-1 the character of rutin contrastry product產(chǎn)品規(guī)格uv含量測(cè)定（供測(cè)總黃酮用）產(chǎn)品介紹品名：蘆丁對(duì)照品英文：rutin別名：蕓香昔；路?。唤j(luò)通；路通；維生索p；路丁粉；蕓香貳；紫懈皮 干；捉取來(lái)源：蕓香葉、煙葉、棗

25、、杏、橙皮、番茄、養(yǎng)麥花等中性質(zhì)描述：淺黃色針狀結(jié)晶（水）,mp. 176°c-178°co難溶于冷水（0. 0013%）, 可溶于熱水（0. 55%）、熱甲醇（11.2%）、冷甲酹（1.0%）、熱乙醇（3. 5%）、 冷乙醇（0.36%）、冷毗噪（8. 5%）,易溶于堿水，酸化乂析出。不溶于其 他有機(jī)溶劑。分 子式：c27h30016分子量：610.51蘆丁結(jié)構(gòu)式：0hh0占hoyo丫。丫''庁h ho'、'6h蘆丁藥理作用：蘆丁屬維生素類藥，有降低毛細(xì)血管通透性和脆性的作用， 保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性。用于防治高血壓腦溢血；糖尿病視網(wǎng)

26、膜 出血和出血性紫瘢等，也用作食品抗氧劑和色素。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用途：測(cè)總黃酮、紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線等。包裝說(shuō)明：毫克級(jí)，克級(jí)保質(zhì)期：2年保存：陰涼干燥，避光環(huán)境保存。2.1.2試劑（均為分析純）十二烷基硫酸鈉（sds）（北京化學(xué)試劑廠），95%乙醇（天津北辰方正試劑廠）， 竣甲基纖維素鈉（cmc）,可溶性淀粉，聚酰胺（80-400目），乙酸，止丁醇，甲酸， 氫氧化鈉，三氯化鋁，亞硝酸鈉，硝酸鋁，去離子水。2.1.3儀器設(shè)備聚酰胺預(yù)制板（臺(tái)州四青生化材料廠）:tu 一 1900雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京 普析通用儀器有限責(zé)任公司）；分析天平（上海醫(yī)用激光儀器廠）；re-85z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （鞏義市英峪予華

27、儀器廠）；恒溫加熱器（聯(lián)泰儀表有限公司）；gzx-9070mbe數(shù)顯鼓 風(fēng)干燥器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公 司）；超聲波清洗機(jī)（北京利而普電器有限公司）；分子篩，濾紙。100ml燒杯（2個(gè)）,500ml燒杯（一個(gè)），10ml量筒（一個(gè)），100量筒（一個(gè)）， 10ml容量瓶（2個(gè)），50ml容量瓶（20個(gè)），100ml容量瓶（2個(gè)），移液管（5個(gè)）， 膠頭滴管（2個(gè)），玻璃棒（2支），層析缸（若干），玻璃板，毛細(xì)管。2.2實(shí)驗(yàn)原理2. 2.1色譜分離方法及原理（1）薄層色譜法：薄層色譜（thin layer chromatography, tlc）是一

28、種快速、簡(jiǎn)便、 高效、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用廣泛的色譜分析方法。薄層色譜的特點(diǎn)是可以同時(shí)分離多個(gè)樣品，分 析成本低，對(duì)樣品預(yù)處理要求低，對(duì)固定相、展開(kāi)劑的選擇自由度大，適用于含冇不易 從分離介質(zhì)脫附或含有懸浮微?；蛐杷ＩV后衍生化處理的樣品分析。tlc廣泛地應(yīng)用 于藥物、生化、食品和壞境分析等方面，在定性鑒定、半定量以及定量分析中發(fā)揮著重 要作用。（2）薄層色譜原理：薄層色譜是一種微量分析的分離過(guò)程，它將樣品點(diǎn)在以玻璃板 或鋁、塑料等片材為載體的多孔吸附劑薄層的固定相上，利用流動(dòng)相在特定的展開(kāi)室中 將混合物屮的組份推移到不同距離處，在色譜展開(kāi)整個(gè)過(guò)程屮，樣詁的成份受到正反不 同的力的作用。 .流動(dòng)相利用毛

29、細(xì)管力帶著樣品穿過(guò)固定相。 .樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過(guò)程中由于偶極-（誘導(dǎo)）-偶極 相互作用，氫鍵和范德華力的作用而產(chǎn)生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò) 合等分離機(jī)理。出于樣品組份與流動(dòng)相和固定相之間的相互作用力程度不同，整個(gè)毛細(xì)管流動(dòng)過(guò)程 中分離運(yùn)動(dòng)都在進(jìn)行。基于這點(diǎn)，tlc系統(tǒng)（流動(dòng)相和固定相）必須與樣品很好地匹配。用顯色試劑處理，許多黃酮組份可在日光或紫外燈光下檢視。色譜可用肉眼或使用 光密度計(jì)和照和機(jī)記錄或影像系統(tǒng)方法來(lái)評(píng)價(jià)。2. 2.2鑒定方法原理及應(yīng)用（1）紫外分光光度法：紫外和可見(jiàn)光譜統(tǒng)稱為電子光譜，這類光譜是由于分子的價(jià) 電子或外層電子發(fā)生躍遷產(chǎn)生的。電子

30、光譜的譜長(zhǎng)范圍為10800,該波段乂可分為： 可見(jiàn)光區(qū)，冇色物質(zhì)在這個(gè)區(qū)威冇吸收；近紫外區(qū)，芳香族化合物或具有共軌體系的物 質(zhì)在此區(qū)域有吸收，這是紫外光譜研究的對(duì)象；遠(yuǎn)紫外區(qū)又稱真空紫外區(qū)。通常所說(shuō)的 紫外光譜實(shí)質(zhì)200400的近紫外光譜。與其他的光譜測(cè)定方法相比，紫外光譜具有儀器價(jià)格較低，操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)在有機(jī) 化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，歷史也很長(zhǎng)久，主要應(yīng)用于冇機(jī)化合物共軌發(fā)色基團(tuán)的鑒定、成分 分析、平衡常數(shù)測(cè)定、相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定、互變異構(gòu)體測(cè)定、氫鍵強(qiáng)度測(cè)定等，是一種 有力的分析測(cè)試手段。2（2）紫外分光光度法原理：原了或分了中的電了總是處于某一運(yùn)動(dòng)狀態(tài)中，每一狀態(tài)都具有一定的能量，屬于 一定的能

31、級(jí)。根據(jù)planck關(guān)系式：e=hu=hc/入，電子吸收能量，產(chǎn)生躍遷。分子所具有的能量包括：分子的勢(shì)能e0,分子的平動(dòng)能e平，分子的轉(zhuǎn)動(dòng)能e轉(zhuǎn)及分 子的電子能e電子e=e0+e平+e振+e轉(zhuǎn)+e電子由于分了的勢(shì)能不隨吸收能量的變化而變化，分了的平動(dòng)能是連續(xù)的，不能量了化, 因此，分子吸收能量時(shí)，能量的改變包括三項(xiàng)，即4e= a e振+ e轉(zhuǎn)+ e電子，分子吸 收光譜也就分為三類：轉(zhuǎn)動(dòng)光譜化振=已電子=0）；振動(dòng)光譜化轉(zhuǎn)=己電子=0）；屯子光譜（e 轉(zhuǎn)大于0e電子大to） o其中： e振：0.051電子伏分子所吸收的光能引起振動(dòng)能級(jí)的躍遷，吸收波長(zhǎng)大多位于2.516呵內(nèi)（屮紅外區(qū)內(nèi)）, 因此稱

32、為紅外光譜。 e轉(zhuǎn)：小于0.05電子伏分子所吸收的光能只能引起分子傳動(dòng)能級(jí)的躍遷，傳動(dòng)能級(jí)z間的能量差很小，位于 遠(yuǎn)紅外及微波區(qū)內(nèi)，在有機(jī)化學(xué)中用處不大。 e電了最大：110電了伏 即：e電了e振沌轉(zhuǎn)曲于分子內(nèi)部電子能級(jí)的變化而產(chǎn)生的光譜位于紫外或口 j見(jiàn)區(qū)內(nèi)。（3）黃酮類化合物紫外吸收光譜分析：黃酮、黃酮醇等多數(shù)黃酮類化合物，因分子中存在如下所示的桂皮?；╟innamoyl） 及苯甲?；╞enzoyl）組成的交叉共覘體系，故其甲醇溶液在200-400nm的區(qū)域內(nèi)存在 兩個(gè)主要的紫外吸收帶，成為峰帶i （ 300-400nm）和峰帶ii （220-280nm）。（峰常 urgmtlnm）i

33、lavonol（roh>黃酮及黃酮醇類uv光譜圖形相似，但帶1位置不據(jù)此進(jìn)行分類。在黃酮及黃酮醇母核上，如7-為及4,- 疑基、甲氧基等供屯基，將促進(jìn)結(jié)構(gòu)重排，有利于實(shí) 電子躍遷，可引起相應(yīng)吸收紅移。通常，整個(gè)母核上 程度越高，則帶1將越向長(zhǎng)波方向位移。氧取代同。可位引入現(xiàn)上述帶2峰主要受a環(huán)氧取代程度的影響，b環(huán)的取代基對(duì)其峰位影響甚微，但可以影響 他的形狀。例如當(dāng)b環(huán)上僅有4氧取代時(shí)，帶2為單峰；而當(dāng)b環(huán)上同時(shí)存在349-二氫 取代時(shí)，則帶2將變?yōu)殡p峰（或一個(gè)主峰，并伴有一個(gè)肩峰），如圖2所示。綜上所述，可以根據(jù)帶1, 2的峰位及形狀，初步推測(cè)黃酮及黃酮醇母核上超基取代 的數(shù)目及取代

34、模式。黃酮及黃酮醇母核上疑基甲基化或昔化時(shí)，將引起相應(yīng)吸收帶，尤其帶1將發(fā)生 紫移。當(dāng)疑基乙酰化后，原來(lái)的酚疑基對(duì)光譜的影響將會(huì)完全消除。例如，4疑基黃 酮類在乙?；?，將表現(xiàn)出與4亠甲氧基黃酮十分相近的光譜，據(jù)此可以鑒定黃酮類化 合物母核上烷氧基的取代位置。表2-2兒種癥基黃酮類化合物的紫外吸收光譜（帶i ）化合物帶 i (入 maxmcu<l) /nm3, 5, 7-三疑棊黃酮（高良姜素）3593, 5, 7, 4_四輕基黃酮（山蔡酚）3673, 5, 7, 3t-五疑基黃酮醇（桝皮素）3703, 5, 7, 3459-六疑基黃酮醇（楊梅素）374表2-3兒種疑基黃酮類化合物的紫外吸

35、收光譜（帶ii）化合物帶ii （入嚴(yán)）/nm黃酮2507輕基黃酮2525-梵基黃酮及5, 7-二耗基黃酮2625, 6, 7-三疑基黃酮2745, 7, 8-三羥基黃酮281查耳酮中，帶2位丁200270nm,帶1位于340390nm,有時(shí)分裂為la（340390nm） 及l(fā)b （300320nm） o與黃酮黃酮醇類化合物一樣，壞上引入氧取代基，也會(huì)引起吸收 帶（尤其是帶1）紅移（見(jiàn)表2-4）,引入2-0h時(shí)影響最大。表2-4杳耳酮類化合物的紫外吸收光譜（帶i ）化合物帶 i （入 maxme）ii） /nm查耳酮3124疑基查耳酮3204-疑基査耳酮3504, 2十輕基査耳酮370反之，2-

36、oh甲基化或甘化時(shí)，可引起帶1紫移1520nm,但其余位置的結(jié)構(gòu)變化對(duì)帶1 影響不大。橙酮中，常顯示3-4個(gè)吸收峰，但主要吸收峰（帶1） 一般位丁370-430mn, 犬然來(lái)源的橙酮可為388-413nmo輕基甲基化或昔化，可引起帶1紫移18nmo 異黃酮，二氫黃酮及二氫黃酮醇 這三類化合物中，由a環(huán)苯甲酰系統(tǒng)引起的吸 收峰帶2為主峰，因而b環(huán)不與毗喃酮環(huán)上的城基共軌（或共軌很弱），故帶1很弱，常 在主峰的長(zhǎng)波方向處有一肩峰，如圖所示：2, 3, 4-三徑基查耳酮3', 4'-二疑基橙酮異黃酮與二氫黃酮的uv光譜7-疑基界黃酮4 7二甕基二氫黃酗根據(jù)主峰的位置可以區(qū)別異黃酮與二

37、氫黃酮及二氫黃酮醇類。前者吸收峰在245-270nm, 后兩者吸收峰在270-295nm.2.3實(shí)驗(yàn)方法2. 3.1薄層色譜法鑒定(1) 薄層色譜板的制備取聚酰胺粉(300-400 0) lg溶t 85%甲酸溶液6ml ,再加70%乙醇3ml,調(diào)勻。用 徒手傾倒法鋪層。鋪好后水平放在一個(gè)盛熱水(70-80°c)盤(pán)子的水面，不能浸入水屮, 但耍是盤(pán)中的水蒸汽能熏濕薄層。盤(pán)子要用蓋子蓋上。制好的薄層原是透明的，放在盤(pán) 中約一小時(shí)后，變成乳白色。放置數(shù)小時(shí)后，取出薄層板用蒸謂水漂洗三遍，以洗去甲 酸，晾干。再在烘箱中80°c恒溫烘t 15mino這樣制得的薄層板分離黃酮類化合物效

38、果 很好。(2) 薄層層析(tlc).展開(kāi)劑的制備配制:75%微乳液體系:十二烷基硫酸鈉：正丁醇:正庚烷(m : m二27 : 63 : 10) 乙醇：乙酸(v : v=100 : 2)乙醇：水(v ： v=3 : 2) 丁醇：乙酸：水(v ： v ： v二1 ： 6 ： 9)正丁醇：乙醇：乙酸(v : v ： v二4 ： 25 ： 1)上述層析液層析吋加少 量甲酸以防拖尾。.點(diǎn)樣在距離薄層板1cm處輕輕畫(huà)出點(diǎn)樣的起始標(biāo)記，然后用毛細(xì)管吸取70%乙醇提取液 點(diǎn)到板的左側(cè)，原點(diǎn)半徑應(yīng)小于5mnu然后在右側(cè)點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)樣（蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣）。樣點(diǎn)與 標(biāo)準(zhǔn)樣應(yīng)在同一起始線，兩和斑點(diǎn)中心z間距離應(yīng)大于1.5cm

39、0點(diǎn)5塊和同的薄層板。（3）.展開(kāi)將點(diǎn)上樣品的5塊薄層板分別置丁裝有不同展開(kāi)劑的層析缸中展開(kāi)，原點(diǎn)不要浸入 展開(kāi)劑的液面，整個(gè)展開(kāi)過(guò)程應(yīng)在密閉的層析缸中進(jìn)行 .顯色取出薄層板，待薄層板上的展開(kāi)劑基本揮發(fā)，用1%a1c1m乙醇溶）均勻噴在薄層層 析處理后的薄層板上顯色，風(fēng)干，紫外光下觀察，記錄斑點(diǎn)位置。2.3.2紫外分光光度法分析（1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取經(jīng)120°c干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品25mg,置50ml量瓶中，加乙醇適量， 超聲處理使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取20ml,置50ml量瓶屮，用 水稀釋至刻度，搖勻，即得0. 20mg/ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）標(biāo)

40、準(zhǔn)工作曲線的繪制精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 2.0ml、4. 0ml. 6. 0ml、80ml、10. 0ml. 12.0ml,分別 置50ml量瓶中，各加水12ml,加5%亞硝酸鈉溶液2ml,使混勻，放置6分鐘，加10%硝酸 鋁溶液2ml,搖勻，放置6分鐘，加4%氫氧化鈉試液20ml,再加水至刻度，搖勻，放置15 分鐘；以相應(yīng)的溶液為空白。在510nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為橫坐標(biāo)、濃度 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2-5標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值列tab. 2-5 the absorbing value of standard solutiongs in the visible region標(biāo)準(zhǔn)溶液的

41、量ml蘆丁濃度mg/ml吸光度值a0.00. 0000. 0022.00. 0080. 1084.00. 0160. 2226.00. 0240. 3358. 00. 0320. 44210. 00. 0400. 55712. 00. 0480.676蘆j濃度 mg0. 060. 050. 040. 030. 020.010.20.40.6y 二 0. 0711x + 0. 00022r = 0. 9997i0.8吸光度a圖1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)丁作111!線fig.l the standard job curve of rutin曲上述可知回歸方程：y二0.071 lx+0. 0002, r»

42、0. 9997,線性范圍為0-0. 20mg/ml其 中，y為蘆丁濃度mg/ml, x為吸光度a。（3）樣品含量的測(cè)定精密量取柿葉提取液（注：70%乙醇溶液微波提取液，由魏玲玲、向輝提供）5ml,放入50ml容量瓶,用70%乙醇定容。從中精密量取2ml于50ml容量瓶中加水12ml,加5%亞硝酸鈉溶液2ml,使混勻，放置6min,加10%硝酸鋁溶液2nd,搖勻，放置6min, 加4%氫氧化鈉試液20ml,再加水定容，搖勻，放置15min；以相應(yīng)溶液為空口。在510nn） 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度a。200. 00300.00400.00500.00600.00波長(zhǎng)(wn)圖2樣品的紫外吸收光譜fig

43、.2 ultraviolet absorption spectrum of the sample表2-6樣品的實(shí)驗(yàn)值tab. 2-6 the experiment value of the sample乙醇濃度/%吸光度a總黃酮含量/mg ml-170%0. 2484. 462.3.3對(duì)四種大孔吸附樹(shù)脂的分析（由林佳、武爽提供待測(cè)液）（1） 不同的樣品液含量（以14-30目的為基準(zhǔn)）.精密量取14-30 r吸附后的溶液，配制6份不同濃度的溶液，測(cè)定光度。表2-7不同濃度溶液吸光度值tab. 2-7 the absorbing value of the different thickness s

44、olution14-30冃吸附液含量/ml吸光度a （蘆?。?234564 0.0415 0.043100.054150.057200.091250.066可見(jiàn)取20ml吸附液的吸光度值（abs.）最大?？勺銎叫袑?shí)驗(yàn)：依法配制4份溶液，測(cè)定吸光度。表2-8平行實(shí)驗(yàn)的吸光度值tab. 28 the absorbing value of the experiment of equal14-30冃吸附液含量/ml吸光度a （蘆?。?200. 0912200. 0953200. 0914200. 093可見(jiàn)，此值真實(shí)可靠。平均abs二0.093。用30-60目、ads-17. ab-8對(duì)20ml樣品液

45、吸附，測(cè)定吸光度，并與14-30目的 進(jìn)行比較。表2-9卩4種樹(shù)脂吸附后溶液的吸光度值tab. 2-9 the absorbing value of the adsorption queen solution of four kinds resin吸附樹(shù)脂14-3030-60ads-17ab-8吸光度a0. 0930. 0880. 1540. 152可見(jiàn)，30-60 口的吸光度（abs.）最小為0. 088,說(shuō)明20ml條件下，30-60 口的吸 附性最好，而ads-17 ab-8吸收性較井。.30-60目樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附：每隔10ml接取吸附液一次。表2-10 30-60目動(dòng)態(tài)吸附后溶液的吸

46、光度值tab.2-10 the absorbing value of the 30-60 development adsorption queen solution吸光度a （蘆?。? 0.0132 0.0173 0.0300. 04256780. 0470. 0530. 0520. 0540. 0550. 0570. 0560. 0579101112對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形處理:吸 光 度每取10ml標(biāo)號(hào)圖3 30-60日動(dòng)態(tài)吸附趨勢(shì)線fig.3 the trend line of the 30-60 eye development adsorption由圖形可知，在第6次接取后蘆丁的濃度基木保持較穩(wěn)

47、定的數(shù)值，說(shuō)明此時(shí)30-60 目樹(shù)脂己基本接近飽和。 利用al(iii)黃酮配合物紫外吸收光譜說(shuō)明d中的問(wèn)題fig.4 six set of ultraviolet absorption spectra of the coordination compounds ofal (iii)- the yellow ketone從紫外吸收光譜可以清楚的看出從第6次之后蘆丁的吸光度值基木保持穩(wěn)定，說(shuō)明 此時(shí)3060目的樹(shù)脂已經(jīng)接近飽和狀態(tài)。（2）不同乙醇濃度下四種樹(shù)脂的解吸比較（以14-30目為基準(zhǔn)）.將吸附好的14-30目樹(shù)脂在不同乙醇濃度進(jìn)行靜態(tài)解吸表2-11靜態(tài)解吸后的吸光度值tab.2-11 t

48、he absorbing value of static state desorption標(biāo)號(hào)乙醇濃度/%吸光度a （蘆?。?0%50%70%90%0. 003 0. 0080.018 0.012由表，可知乙醇濃度為70%時(shí)解吸較好。將吸附好的30-60目、ads-17. ab-8三種樹(shù)脂分別用70%乙醇進(jìn)行靜態(tài)解吸, 并與14-30目樹(shù)脂進(jìn)行比較。表2-12不同樹(shù)脂靜態(tài)解吸后的吸光度值tab.2-12 the absorbing value of the different resin static state desorption樹(shù)脂種類乙醇濃度/%吸光度a （蘆?。?0-600. 029

49、ads-1770%0. 009ab-80. 00814-300.018由表，可知70%乙醇條件f 30-60目樹(shù)脂的解吸性能較好。70%乙醇為流動(dòng)相對(duì)吸附好的30-60冃樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸：每隔10ml接取解吸 液一次。表2-13 30-60 fi動(dòng)態(tài)解附后溶液的吸光度值tab.2-13 the absorbing value of the 30-60 development desorption queen solution標(biāo)號(hào)吸光度a （蘆?。?biāo)號(hào)吸光度a （蘆?。?0. 04390.01620. 041100.01530. 034110.01440. 024120. 01150. 0241

50、30. 01160. 02140.0170. 021150. 01280. 018160. 0110. 040. 030. 020.0112345678910 1112 1314 15 16每取10ml標(biāo)號(hào)圖5 30-60冃動(dòng)態(tài)解吸趨勢(shì)線fig.5 the trend line of the 30-60 eye development desoiption從圖中可以看出第4次解吸之后，30-60目的柱子中黃酮化合物明顯減小，到第 12次解吸之后，柱子中的黃酮已達(dá)到解吸平衡，無(wú)法解吸出來(lái)。.利用al(iii)黃酮配合物紫外吸收光譜說(shuō)明c中的問(wèn)題從16組中選取4組1、4、12、16吸收光譜350.

51、00400.00500.00600.00波長(zhǎng)(nm)圖6四組al (iii)-黃酮配合物紫外吸收光譜fig.6 four set of ultraviolet absorption spectra of the coordination compounds ofal (iii)- the yellow ketone從紫外吸收光譜可以清楚的看岀從第4次之后,30-60 h的柱子中黃蘆丁明顯減少, 到第12次解吸之后，柱子中的蘆丁已達(dá)到解吸平衡。2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. 4.1薄層層析效果柿葉薄提取液用薄層色譜法分離時(shí)使用了不同微乳液和其他多種層析液對(duì)黃酮類 物質(zhì)進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)正丁醇一乙醇一乙酸一甲酸體

52、系效果最佳。(1) .正丁醇一乙醇一乙酸一甲酸體系對(duì)提取液的分離圖7提取液的薄層色譜圖fig.7 the thin layer chromatogram of the extracting liquid上部熒光很好的為榔皮素，下邊靠右邊的為蘆丁。小間我們可以清晰的看到4個(gè)點(diǎn)。 從左往右第一個(gè)點(diǎn)為楓皮素，第四個(gè)點(diǎn)為蘆丁。從薄層色譜板上我們可以知道提取液中 主要含有四種黃酮化合物，其中對(duì)應(yīng)蘆丁的點(diǎn)清晰可見(jiàn)。(2) .正丁醇一乙醇一乙酸一甲酸體系對(duì)30-60目樹(shù)脂吸附后和解吸后的溶液進(jìn)行分離。圖8吸附液和解吸液的薄層色譜圖fig.8 the thin layer chromatogram of th

53、e adsorption and desorption liquid上部右邊為蘆丁對(duì)照品，屮間為解吸后的薄層分離結(jié)果，下而為吸附后的薄層分離 結(jié)果。兩種溶液進(jìn)行分析可以得出：解吸后的薄層分離效果清晰可見(jiàn)，說(shuō)明30-60目樹(shù) 脂對(duì)蘆丁的吸附性能和解吸性能全部良好;吸附后的薄層分離效果模糊可見(jiàn)，說(shuō)明30-40 目樹(shù)脂對(duì)蘆丁的吸附性能良好且吸附能夠達(dá)到吸附平衡。（3）.紫外吸收光譜鑒定分析薄層色譜分離出（除蘆丁、棚皮素）兩種物質(zhì).柿葉提取液的吸收光譜（以下說(shuō)明數(shù)據(jù)可以參考2.2.2'p的介紹）200. 00300.00400.00500.00600.00波長(zhǎng)(nm)圖9柿葉提取液的吸收光譜f

54、ig.9 the ultraviolet absorption spectra of the extracting liquid吸收峰值：峰值2是250. 5nm在240-280nm之間；峰值1是331nm在300-390之間。 這說(shuō)明柿葉提取液屮主要黃酮化合物屮的黃酮醇類化合物和查耳酮類化合物，從而說(shuō)明 提取液薄層色譜板上中間兩點(diǎn)為這兩種類化合物。.30-60樹(shù)脂解吸液紫外吸收光譜（以下數(shù)據(jù)可以參考2. 2. 2屮介紹）200.00300.00400.00500.00600.00波長(zhǎng)(nm)圖10柿葉解吸液的吸收光譜fig.10 the ultraviolet absorption spectra of the desorption liquid