關于“DAD秘籍”

1、關于“DAD秘籍”     二極管陣列檢測器目前已在高效液相色譜分析中大量使用，一般認為是液相色譜最有發(fā)展、最好的檢測器。隨著DAD檢測器的普及，我們很多客戶反饋在使用DAD的過程中有些許疑惑，于是小桂版的DAD秘籍應運而生，幫助用戶無憂修煉 :) 要進入正題了，好激動 =1明表象四張圖分清紫外檢測器（UVD）和二極管陣列檢測器（DAD）     外觀差不多：   原理有不同:一句話概括：紫外檢測器先分光，取得單色光再通過流通池，用光電二極管檢測，只能獲得特定波長的

2、信號；二極管陣列檢測器復色光先通過流通池，再分光，整個光譜由二極管陣列檢測，同時獲得一段光譜范圍內信號。      功能有差異：  DAD譜圖更豐富： DAD是大勢所趨   一般情況下，二極管陣列檢測器可以完全替代紫外檢測器。同時因為DAD可以獲取更多的數據信息，用于輔助定性和光譜檢索，因此DAD的使用會越來越普遍。 2知用法    DAD再牛，也要會使用。相對紫外檢測器，DAD的設置和參數優(yōu)化會更多一些，對使用者的要求也高一些。不過不用怕，只要

3、掌握了下面的秘籍，你也可以輕松玩轉DAD。     有硬件就要有軟件，DAD全部由工作站來控制。下面就以RIGOL UltraChrom 和安捷倫 Chemstation為例，看看工作站方法設置。（實驗方法是藥典、標準等既定方法規(guī)定的，按照方法中的要求設定方法。） 1. 下面來看看 RIGOL Ultrachrom 工作站方法設置: 這個方法，用紫外檢測器得跑三遍，但用DAD可以一次搞定，如何設置，看下圖： 2. 再來看看 安捷倫Chemstation工作站方法設置：

4、0; 【插播】DAD 方法中參數說明：【一般情況下】樣品波長：按照方法要求選擇檢測波長，可以參考下文中的詳細說明。 樣品帶寬：主要影響峰高和基線噪音，因此優(yōu)化帶寬可以獲得最佳信噪比；樣品帶寬選擇的最直接依據是其吸收光譜中峰的峰寬，詳見后面的解釋。4nm是比較通用的樣品帶寬。 參比波長：選擇合適的參比波長可以減小梯度洗脫過程中的基線漂移，甚至可以通過優(yōu)化參比波長對共流出峰（沒分開的峰）做分別檢測。一般選擇在靠近樣品信號的無吸收或低吸收區(qū)域，請參考下文詳細說明。 參比帶寬：是參比波長取值的波長范圍，影響參比波長設置的實際效果。參比帶寬至少要與樣品波

5、長的帶寬相等，許多情況下選擇100nm作為缺省值，如果在不想用參比波長的情況下，也可以直接將帶寬設置為0（或去掉參比波長前面的勾，如Agilent儀器）。 波長范圍：是工作站采集3D光譜數據的波長范圍。一般按照方法要求，沒有要求則需要包含所有被測物質的檢測波長，但是較寬的波長范圍采集會占用更多的磁盤空間。 步進: 一般選擇1nm，步進的選擇對譜帶數據點數有影響。 采樣率/峰寬：采樣率和峰寬是同一目的的兩種不同實現方式，其目的都是為了真實的采集到一個色譜峰。一般選擇10Hz。采樣率高能更真實的還原峰型，但會帶來更大的基線噪音。反之過低的采樣率會導致峰變形，

6、但基線噪聲更小。選擇合適的采樣率以獲得最佳的信噪比。 曝光時間：這是RIGOL L-3520 DAD的一項高級參數設置，一般選擇20ms濾波設置: 這是RIGOL L-3520 DAD的一項高級參數設置，快/正常/慢/無，一般選擇正常 要弄明白一般為什么這樣設置，請您接著看每個參數的意義 3懂原理1.  樣品和參比波長及帶寬簡單說：你看到的色譜圖上的最終吸光度值是這么來的： 吸光度=以樣品波長為中心在樣品帶寬范圍內的所有波長吸光度平均值-以參比波長為中心在參比帶寬范圍內的所有波長吸光度平均值這個吸光度是實時計算的，你看到的色

7、譜圖中的每一個點，都是這個公式計算來的。（當然如果關閉了參比波長，就沒有后半截了） 暈了吧？ 打個比方，檢測器方法中的信號 A 設置為樣品 254.0/4、參比360.0/100，即從 252到 256 nm 波長范圍內的平均吸光度減去從 310 到 410 nm 波長范圍內的平均吸光度。有什么用？想一想，我們在走梯度，流動相的組成時時變化，導致基線漂移，大家應該經常遇到。為啥會這樣？主要因為流動相變化時：（1）流動相組成變化導致背景吸收變化（尤其是檢測波長比較短的時候，如203nm）；（2）流動相組成變化導致折光系數改變（這個是流通池里面光折射的物理的影響）。現在回顧下上

8、面的公式，其實：吸光度=(樣品吸收+背景吸收)-(參比吸收+背景吸收)如果我們把參比波長選在一個樣品沒吸收的地方，則：吸光度=(樣品吸收+背景吸收)-(0+背景吸收)換句話說，背景變化被扣掉了所以基線不飄了！就像下面這樣：（此圖片來源于Agilent用戶手冊）所以，小伙伴們，用DAD時，正確選擇參比波長，是糾正基線漂移的法寶。 還有，一般參比帶寬都選的那么寬，為啥？因為，帶寬越寬，被平均的數據點越多，偶然性變化帶來的影響越低，背景扣除越準確穩(wěn)定。100nm是比較常用的參比帶寬。但參比帶寬范圍內注意不要有吸收，否則會降低峰高，搞不好出來一堆倒峰。 樣品帶寬為啥多數是4nm？樣

9、品帶寬決定了樣品信號平均的波長范圍，顯然帶寬越寬，平均的越多，基線越穩(wěn)定。但如果太寬了，峰的高度和光譜的分辨率都會受影響，后面小編會通過專題講這是為啥，敬請期待！這里只要記住，帶寬寬，基線噪聲小，峰高降低；帶寬窄，基線噪聲大，峰高受影響小。如下圖：一般4nm就可以了（此圖片來源于Agilent用戶手冊） 2. 步進就是采集光譜時，離多遠采集一個數據點。步子大了，得到的光譜圖清晰度不夠；步子小了，會產生大量的數據迅速填滿你的磁盤。而光譜圖的清晰度，又會影響峰純度分析時的準確性，所以選擇什么樣的步進，還要看看以后的用途。 3采樣率/峰寬：采樣率和峰寬是同一目的的兩種不

10、同實現方式，其目的都是為了真實的采集到一個色譜峰。一般選擇10Hz，采樣率高能更真實的還原峰型，但會帶來更大的基線噪音。反之過低的采樣率會導致峰變形，但基線噪聲更小。選擇合適的采樣率以獲得最佳的信噪比。來張圖就明白了4.曝光時間曝光時間屬于RIGOL L-3520 DAD高級選項，曝光時間與采樣率有負相關，同時也跟曝光次數有關。一般選擇20ms就可以滿足要求了，不需要用戶做過多設置。 5. 濾波濾波屬于RIGOL L-3520 DAD高級選項，濾波是針對采集后的基線做了微小的處理。濾波目前有四種速度，分別是快、正常、慢和無。濾波速度越慢濾波相對效果會好一些，但是平常使用選擇

11、正常就可以了。  4懂數據 PDA視圖分析按照正確的設置方法，待測物質分析完畢，則需要使用PDA視圖：3D譜圖可以比較直觀地查看 信號-時間-波長 三維視圖，通過調整等高圖中橫軸(波長軸)即樣品的檢測波長，縱軸(時間軸)即保留時間，可以得到合適的色譜圖和光譜圖，通過峰純度可以確定檢測峰是否含有其它物質。確切地說，每種一定濃度范圍內的具有紫外吸收的物質都會有其獨特的光譜圖，通過比較對照品與供試品譜圖目標峰的保留時間范圍內的光譜圖，如不相同則不含待測物質。 5解難題 DAD常見問題分析:1.濃度太高超量程平頭了2.濃度太低噪聲已經掩蓋了部分峰形這兩種情況的處理方法：適當地增減樣品的濃度，保證光譜圖在合適的濃度范圍內顯示。同時也需要考慮到流動相的溫度、成分或PH值的變化。 以下是一