畢業(yè)論文少量豬細胞的快速性別鑒定

1、少量豬細胞的快速性別鑒定本科生畢業(yè)論文任務書論文題目少量豬細胞的快速性別鑒定學院名稱指導教師畢業(yè)論文（設計）的內(nèi)容摘要通過pcr擴增，擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用pcr marker作分子量標 準，分別從雌性和雄性豬肌肉組織中擴增出不同的條帶，從而達到性別鑒定的目 的通過pcr擴增哺乳動物雄性決定基因sry來鑒定胚胎的性別在畜牧業(yè)生產(chǎn)上已經(jīng) 得到廣泛應用，應用多重pcr同時擴增雌雄特界基因，使雌雄樣品均有擴增產(chǎn)物. 本實驗針對豬細胞設計了兩對引物il31,2和gapdh-1,2。畢業(yè)論文（設計）基本要求及工作量要求1根據(jù)要求閱讀相關文獻10篇以上，翻譯外文文獻1篇以上，并對所查得的

2、資料進行深入分析整理，推敲試驗的可行性，設計詳細的實驗方案。2.具體實驗過 程中，著重培養(yǎng)動手操作以及獨立思考問題與解決問題的能力。3.實驗結束后要完 成一篇研究性論文，要求數(shù)據(jù)真實可靠，保持嚴格的客觀真實性，結果討論清晰 詳細。4.學會word文檔的編輯排版和幻燈片的制作。5.要求中文摘要不少于200 字，附有英文摘要，論文總字數(shù)在30005000字。畢業(yè)論文（設計）的主要階段計劃（分前期、中期、后期）前期:2013.3.12013.3.291、廣泛查閱有關動物性別鑒定的文獻。2、提出實驗方案。3、做好材料、設備用具和方法的準備工作。中期:2013.3.302013.4.301、對傳統(tǒng)基因組

3、dna提取進行優(yōu)化改進。2、通過文獻查閱對pcr反應的引物進行有針對性的設計。3、熟悉pcr儀的使用和瓊脂糖凝膠電泳檢測的全部過程，并熟練操作。4、進行豬細胞的快速性別鑒定。后期：2013.5.12013.5.91、進一步整理實驗數(shù)據(jù)及圖片。2、撰寫和修改畢業(yè)論文并定稿、答辯。任務下發(fā)日期2013.3.1完成日期2013.5.9系主任：主管教學院長審批（簽字）：少量豬細胞的快速性別鑒定摘要：本實驗通過對雌雄成年豬肌肉組織所含因子的dna序列，設計了兩對特 異性pcr引物，通過pcr擴增，擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用pcr marker作分子量標準，分別從雄性和雌性組織中擴增出不同的條

4、帶，從而達到 性別鑒定的目的。具有較高的應用價值。關鍵詞：豬細胞，細胞培養(yǎng)；pcr法；性別鑒定pcr method of gender identification of cellsabstract： through the experiments of male and female mice hair (including hair follicle) contains the dna sequence of factor, the design of the two specific pcr primer, through the pcr amplification, amplifica

5、tion 1.5% agarose gel products in the electrophoresis, with pcr marker for molecular weight standard, separately from the male and female organization different channel expansion, so as to achieve the purpose of sex identification. it has higher application value.key words： mice, epithelial tissue；

6、pcr； gender identificationw s 1材料和方法-1-1.1 材料-1-1.2 方法-2-2試驗結果-3-3討論3. 1鑒定過程的高效性-4-3. 2 pcr鑒定的準確性-5-3.3注意事項-5-參考文獻6致謝-6-隨著科學技術的不斷發(fā)展，我國畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)生了翻天覆地的變化，性別 鑒定技術在畜牧業(yè)中的作用也日益明顯。因為家畜的很多生產(chǎn)性狀與性別 有關，如在乳制品生產(chǎn)中，需要較多的母畜；而在肉畜生產(chǎn)中，因雄性個體 的生長速度和產(chǎn)肉性能明顯高于雌性個體而優(yōu)先選擇雄性；并且在消滅不理 想的隱性性狀1烏達巴拉，賴雙英，石泉。家畜早期胚胎性別鑒定技術的應用。畜 牧與飼料科學，20

7、05, (2)： 40 41,防止性連鎖疾病2禹學禮，粟穎華。pcr在動物胚胎性別鑒定中的應用。洛陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W校學報。2002,22 ( 1 )： 27 28,加快遺傳進展及 畜群的更新等方面也起重要作用。因此，如果能夠有效地控制家畜的性別， 就能更好地利用自然資源，從而服務于人類自身。隨著分子生物學的飛速發(fā)展 以及對畜禽生殖生理的深入研究，人們相繼研發(fā)出了在實踐中應用的性別鑒定方法有: 細胞遺傳學法，h-y抗原法，x染色體相關酶法，y染色體特異dna探針特異雜交 法，pcr法3熊焰成，蘇雷.家畜早期胚胎性別鑒定的研究進展j.上海畜牧曽醫(yī)通訊，2006(6) : 22-23.等。其屮最為常

8、用的就是sry-pcr法，即通過擴 增位于y染色體上的性別決定區(qū)(sex-de termi nation region)的基因片段來判 定月丞胎或者細胞的'性另 0 4 kunieda t, xian m, kob ayashi e, et al . sexing of mouse preimplantation embryos by detection of y chromosomespecific sequences using polymerase chain reactionj.biology of reproduction, 19 92, 46(4) : 692-697.,該

9、基因在不同物種之冋咼度 保守 9 早在 1 9 9 0 年 he 匕1? 5 her*r c mr reed k c micronanipulation of bovine embryos for sex determinationj theriogenology, 1991/35(1): 45-54.等就是用該方法對家畜胚胎的性別進行了鑒定，準確率較髙。而用該方 法鑒定性別具有相對簡單、快速、準確率高，靈敬等優(yōu)點，可在實際應用中 廣泛推廣。同時也為法醫(yī)鑒定、刑偵學斷案和遺傳學檢測分析提供更高效可 靠的技術手段張大偉，向子東.耗牛胚胎性別鑒定pcr反應體系的建立j.畜牧獸 醫(yī)學報,2011,5

10、(3):28-31.1材料和方法1.1材料1.1.1動物材料實 驗 室 保 藏 的 新 鮮 豬 肉 組 織 1.1.2儀器和試劑臺式高速離心機，pcr儀，水浴鍋，電泳儀，渦旋振蕩器，凝膠成像儀統(tǒng)， 微波爐，移液管，吸頭，1.5ml離心管，250|il離心管，250ml錐形瓶，50ml 量筒,小燒杯，酒精燈，眼科剪，眼科銀，浮漂等。tkm緩沖液(10 mm tris-hcl ph7.6, 10mm kc1, 2mm edta, 4 mm mgch), 10% sds溶液，飽和nacl溶液，75%的乙醇，無水乙醇，70%乙醇， te 緩沖液(10 mm tris-hcl ph 8, 0.1 mm

11、edta)；瓊脂糖，tae電泳緩沖 液(40 mm tris-acetate, 1 mm edta), eb溶液(澳化乙錠)，滅菌雙蒸水，dntp, 上下游引物，loxpcr buffer(mg"fiee),taq酶，m-dl2000 markero1.2方法1.2.1試驗方案將購得的新鮮豬的肌肉組織進行基因組的快速提取，將所提的基因組作 為模板制備pcr反應體系，反應體系中的引物為預先設計好的兩對特異性 引物，然后在pcr儀中進行dna的體外擴增，取pcr產(chǎn)物進行凝膠電泳 檢測，對凝膠成像所得照片進行分析。1.2.2基因組dna的快速提取(1) 分別取豬肌肉組織(約1 mg),置于

12、1.5 mlep管中并剪碎。(2) 加入100 gltkm緩沖液，用200 pl移液器將剪碎的組織充分分散后， 再加入400 |1l tkm 和37.5 pl 10% sds,旋渦混勻。(3) 在水浴鍋內(nèi)55°c孵育5 mine力u200(1l飽和nacl,旋渦混勻。(4) 12000 rpm,離心5 min。取上清(約500 gl )加入新 1.5 mlep管 中(預先加入900(1l100%乙醇)，顛覆數(shù)次。(5) 12000 rpm,離心5 min。棄上清，力h500 gl70%乙醇，輕輕轉(zhuǎn)動后， 吸去乙醇，倒置于濾紙上，置3 min,干燥。(6) 加 30 pl te 緩沖液

13、，55°cfi 10 min，備用。1.2.4引物設計根據(jù)gapdh (甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因序列(genbank登錄號：af017079.1 ), 和sry基因序列(genbank登錄號：u49860.2),用 primer premier 5.0,分別設計引物 gapdh-1,2 和 sryi,2, 引物由由南京金思特公司合成，引物序列如下：sry 上游弓| 物 (sry-1 ): 5 * gctttcattgtgtggtctcgt 3'sry 下游弓 i 物(sry-2)： 5 * cttggcgactgtgtatgtgaag 3，gapdh 上游弓| 物 (ga

14、pdh-1)： 5 ' gatggcccctctgggaaactgtg3 * gapdh 下游弓i 物(gapdh-2 )： 5 ' ggacgcctgcttcaccaccttct3'1.2.5 pcr的性別鑒定1. pcr條件的優(yōu)化在50 pl反應體系中：1 pldna模板，引物各1 pl, mgcl23 pl, dntp4 pl, loxpcr buffer（mg2+free）, taq酶0.25 pl,滅菌雙蒸水補加至50 pl。95°c 預變 性5 min； 95°c 變性35s,退火溫度設為8個梯度（50.0°c、51.4

15、6;c、53.4°c、54.4°c、 55.5°c、56.7°c、57.4°c、58. tc ） 1 min, 72°c 延伸40 s, 30個循環(huán)；72°c 延伸 5 mino2. pcr性別鑒定選取上步的優(yōu)化條件進行多重pcr,在50pl反應體系屮:1 |1l dna模板, 兩對引物各 1 pl, mgcl23（1l, dntp4|il, loxpcr buffer（mg2+free）, taq 酶 0.25（1l,滅菌雙蒸水補加至50（ilo 95°c預變性4.5 min； 95°c變性35s, 5

16、6°c 退火1 min, 72°c延伸40s, 30個循環(huán)；72°c延伸5 min。1.2.6電泳1. 制備1.5%瓊脂糖凝膠：稱取0.3 g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入20 ml的 lxtae電泳緩沖液，微波爐加熱煮沸至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.5%瓊脂 糖凝膠液。2. 將少量eb （約3 nl）加入冷卻到70°c左右的瓊脂糖凝膠液中，搖勻。3. 膠板制備（灌膠）:將洗凈的電泳槽載膠板放入制膠槽內(nèi)，使載膠板 與內(nèi)槽兩端邊緣對齊封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放 好點樣梳。將瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入載膠板上，使膠液緩慢展開，直到 整個塑

17、料板表面形成均勻膠層。室溫下，靜置直至凝膠完全凝【古i,垂直輕拔點 樣梳，將載膠板放入電泳槽中，lxtae電泳緩沖液沒過膠板lmm為止。3. 加樣：用10 pl微量移液管分別將樣品（pcr擴增后產(chǎn)物）加入膠板的 樣品小槽內(nèi)，上樣量為5pl,每加完一個樣品，應更換一個加樣吸頭（注意： 加樣前耍先記下加樣的順序）o4. 電泳:加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓110 v,樣品由負極（黑 色）向正極（紅色）方向移動。當漠酚藍移動到距離膠板下沿約1 cm處時（約20 min）,停止電泳。5. 觀察照相：在紫外燈下觀察，dna存在則顯示岀紅色熒光條帶，采用凝 膠成像系統(tǒng)拍照保存。2試驗結果pcr條件的

18、優(yōu)化及pcr性別鑒定的結果見圖1和圖2圖1： pcr退火溫度條件優(yōu)化結果圖2：多重pcr結果figi: pcr products amplified from gradientfig2: multiplex pcr amplificationannealing temperaturem： dl2000 dna maker；m： dl2000 dna maker;1-8： s小鼠dna樣品pcr擴增il3基因結果為16：待測上皮組織pcr結果；544bp的片段（退火溫度分別為：50.0°c、51.4°c、7：已知？小鼠pcr結果；8：已知g小鼠pcr結果。53.4°

19、c、54.4°c、55.5°c、56.7°c、57.4°c、58.tc )（退火溫度均為55.5°c）o9-16： s小鼠dna樣品pcr擴增sry基因結果為402bp 的片段（退火溫度分別:50.0°c、51.4°c、53.4°c、54.4°c、55.5°c、56.7°c、57.4°c、58.1 °c ）。 3討論3.1鑒定過程的高效性這項性別鑒定技術用于快速、準確的鑒定小鼠的性別。對該pcr擴增程序 的所有步驟進行了優(yōu)化使性別鑒定的時間低于4h。與其他的性別鑒定

20、方法相 比，它節(jié)省了大約2h。得出結果需耍以下幾步：dna提取、pcr擴增和凝膠電 泳。對組織dna的快速提取采用sds變性、高鹽的提取和乙醇沉淀法，可以在 lh之內(nèi)得到低成本高純度的dnao提取的dna量雖然很小，但用于pcr足夠。pcr反應時，在找到兩對引物合適的退火條件下同吋進行基因組dna的體外擴 增縮短了單獨反應時所用的時間3. 2 pcr鑒定的準確性多重pcr同時擴增雌雄特異基因，使雌雄樣品均有擴增產(chǎn)物，不僅可以避 免假陰性結果，同時提高了鑒定的準確率，而且可增加模板的使用率，使1個 或數(shù)個拷貝的dna獲得最大限度的應用。由于pcr能使極少的目的基因大量 擴增，所以在實驗操作過程中

21、要避免交叉污染。多重pcr要求在同一反應體系 中進行多個位點的特異性擴增，因而，引物間的配對、引物間的競爭性擴增等 均影響多重pcr的擴增效果，但如能調(diào)整反應的循環(huán)參數(shù)（包括退火溫度、退 火及延伸時間等）、pcr緩沖液成分、dntp的用量、引物的量及模板的量等， 選擇適宜的反應體系和反應條件，可極大地提高多重pcr擴增效果i®。3. 3注意事項（1）由于pcr反應高靈敏性，使擴增極易受到外源dna的污染，產(chǎn)生假陽 性。取樣用的剪刀和銀子必須做好實驗前預處理，取樣時應與所取樣品一一對 應不得交叉使用，防止樣品間的交叉污染。取過樣品后離心管上要用標記筆做 好編號標記，以便鑒定后可對應區(qū)分

22、小鼠。（2）制膠前應將電泳槽、載膠板、點樣梳子、凝膠槽清凈晾干；所加緩 沖液應與電泳槽中的相一致；加熱時，一定要煮沸，以保證瓊脂糖的完全溶解; 待溶液冷卻至不燙手時加eb；防止溫度過高eb分解和揮發(fā)。溶解的凝膠應及 時倒入板中，避免倒入前凝i古i結塊；倒入板中的凝膠應避免出現(xiàn)氣泡，影響電 泳結果。（3）取放eb時應該特別注意，有哪些位置是要戴手套，哪些是必須用手 接觸的，小心摘手套時不要接觸實驗用具，以免交叉感染，對自己和他人的安 全造成隱患。（4）取放凝膠時，膠凝固后，拔梳子前先倒入些電泳緩沖液以方便取梳 子，拔梳子時，應垂直輕拔，防止破壞上樣孔。（5）一般情況下，0.25 cm寬的梳子可加

23、0.1 pg的dna量，加樣量的多少 依據(jù)加樣孔的大小及dna中片段的數(shù)量和大小而定，過多的量會造成加樣孔 超載，從而導致拖尾和彌散，對于較大的dna此現(xiàn)象更明顯。（6）加樣時每加完一個樣品，應更換一個加樣吸頭，以防污染。加樣時 勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。如預計上樣孔過剩時，可避開第一個和最后一個 孔上樣，防止邊緣效應。（7）電泳期間接通電源，紅色為止極，黑色為負極，切記dna樣品由負 極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負）。電泳20-40 min即可；電泳槽蓋要安 全蓋好，以防止液體蒸發(fā)，乂可以降低電擊的可能性。參考文獻1 呂碧文，俞頌東，金水仙.牛早期胚胎性別鑒定的pcr方法研究j.武漢大學

24、學報， 1994,45(2):211 214.2 胡明信，吳學清，曾溢滔等.牛胚胎性別鑒定與取樣胚胎移植應用技術的研究j 畜牧獸醫(yī)學報，1995,6:487495.3 趙建軍，趙興緒，張偉等.兔早期胚胎pcr性別鑒定體系的建立j.現(xiàn)代畜牧獸 醫(yī).2008,12:42 46.張大偉，向子東.耗牛胚胎性別鑒定pcr反應體系的建立jj.畜牧獸醫(yī)學 報,2011,5(3):28 31.15徐艷春，馬立新，白素英等.應用pcr方法通過毛發(fā)進行哺乳動物性別鑒定j.東北 林業(yè)大學學報,2000,6:72-77.6 alanr t, karen s. molecular diagnostics in prei

25、mplantation genetic diagnocularj.j mol diagn , 2002,4(2): 167176.7 jean-francois lambert, brian o. benoit, geralda. colvin, et al. quick sex determinationof mouse fetusesj. journal of neuroscience methodsj.2000,95:127132.8 趙學明，朱士恩，侯云鵬等.雙重套pcr對不同取樣胚胎性別鑒定靈敏度測試j.中國 生物工程雜志,2005,25(3):1722 .9 呂碧文.家畜胚胎性別鑒

26、定的分子生物學方法及現(xiàn)狀j.浙江畜牧獸醫(yī)，1998,(3):15-16.10 黃銀花，胡曉湘，李寧等.影響多重pcr擴增效果的因素j.遺 傳,2003,25(1):65-68.致謝這次畢業(yè)論文能夠得以順利完成，是所有曾經(jīng)指導過我的老師，幫助過 我的同學，一直支持著我的家人對我的教誨、幫助和鼓勵的結果。我要在這 里對他們表示最深的謝意！首先，要特別感謝我的指導老師一一潘求真老師。感謝潘求真老師在我 實驗期間及畢業(yè)論文的撰寫過程中，給我提供了極大的幫助和指導。從開始 選題到中期修正，從實驗儀器的使用到實驗藥品的供給，直到最后論文的形 成，老師給我提供了許多寶貴建議和示范。其次，要感謝4053實驗室的師哥師姐們在實驗期間提供相關實驗器材 和使用指導，使實驗能夠順利完成。還要感謝人學四年里我的任課教師，是 你們每一次課堂上和課后的指導，讓我學到了豐富的知識。得以有能力完成 這次實驗。感謝我的父母親，你們是我力量的源泉和依靠，只要想到你們永遠支持 我，永遠是我最堅強的后盾，不管面對什么樣的困難，我都會勇往直前。感謝我的朋友們，大學四年我們一起學習，共同成長。學會了書本上的 知識，也收獲了最珍貴的友誼。你們的鼓勵與幫助是我前進路上最大的助力。 大學的結束不是我們友誼的結束，是新的開始