免疫組化實(shí)驗(yàn)方法學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1免疫組化實(shí)驗(yàn)免疫組化實(shí)驗(yàn)(shyn)方法方法第一頁，共23頁。性性結(jié)結(jié)合合的的原原理，理，通通過過化化學(xué)學(xué)反反應(yīng)應(yīng)使使標(biāo)標(biāo)記記(bioj)抗抗體體的的顯顯色色劑劑（熒熒光光素、素、酶、酶、金金屬屬離離子、子、同同位位素）素）顯顯色色來來確確定定組組織織細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)抗抗原原（多多肽肽和和蛋蛋白白質(zhì)）質(zhì)），對(duì)對(duì)其其進(jìn)進(jìn)行行定定位、位、定定性性及及定定量量的的研研究，究，稱稱為為免免疫疫組組織織化化學(xué)。學(xué)。2第1頁/共22頁第二頁，共23頁。3第2頁/共22頁第三頁，共23頁。切片和冰凍切片）n細(xì)胞標(biāo)本(biobn)（組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片）。n石蠟切片對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切

2、片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長期存檔；4第3頁/共22頁第四頁，共23頁。5第4頁/共22頁第五頁，共23頁。6第5頁/共22頁第六頁，共23頁。7第6頁/共22頁第七頁，共23頁。法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法n按標(biāo)記物定位于抗原所在部位的手段，則可將免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色方法分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋連法等。每進(jìn)行一步結(jié)合反應(yīng)。都會(huì)產(chǎn)生一次陽性(yngxng)結(jié)果的放大效應(yīng)。敏感性由高到低依次為橋連法、間接法、直接法。8第7頁/共22頁第八頁，共23頁。原反應(yīng)結(jié)合；用緩沖液洗去未結(jié)合的成分；直接觀察結(jié)果(ji gu)；或顯色后再用顯微鏡觀察。9第8頁/共22頁第九頁，共2

3、3頁。10第9頁/共22頁第十頁，共23頁。e，F(xiàn)ITC）黃色、橙黃色或褐黃色結(jié)晶粉末，最大吸收光譜為490495 nm，最大發(fā)射光譜為520530 nm，呈現(xiàn)明亮(mngling)的黃綠色熒光。最常用。2四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫紅色粉未，較穩(wěn)定，最大吸收光譜550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)射的黃綠色熒光對(duì)比鮮明。3四乙基羅丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200）褐紅色粉未，最大吸收光譜570 nm，最大發(fā)射光譜596600nm，呈橙紅色熒光。價(jià)廉。11

4、第10頁/共22頁第十一頁，共23頁。12第11頁/共22頁第十二頁，共23頁?？贵w，再借酶對(duì)底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物，于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞或組織表面或內(nèi)部某種抗原成分定位觀察。n常用的酶-辣根過氧化物酶（HRP），堿性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。n優(yōu)點(diǎn)：與免疫熒光技術(shù)相比，終產(chǎn)物可在普通光鏡下觀察，切片能夠長久保存，經(jīng)鋨酸處理后，電子密度增強(qiáng)，可用于電鏡觀察。13第12頁/共22頁第十三頁，共23頁。14第13頁/共22頁第十四頁，共23頁。15第14頁/共22頁第十五頁，共23頁。16ABC法的特點(diǎn)：法的特點(diǎn)：敏感性強(qiáng)敏感性強(qiáng) 特異性強(qiáng)，背景染色特異性強(qiáng)，背

5、景染色(rns)淡淡方法簡便，節(jié)約時(shí)間方法簡便，節(jié)約時(shí)間可用于雙重或多重免疫染色可用于雙重或多重免疫染色(rns)。第15頁/共22頁第十六頁，共23頁。17免疫金染色原理：免疫金染色原理：免疫金染色技術(shù)使用膠體金耦聯(lián)抗免疫金染色技術(shù)使用膠體金耦聯(lián)抗體，然后在光學(xué)顯微鏡下檢測抗原體，然后在光學(xué)顯微鏡下檢測抗原。解決了免疫組化里內(nèi)源性酶干擾的解決了免疫組化里內(nèi)源性酶干擾的問題。問題。整個(gè)檢測過程中無需酶的參與，因整個(gè)檢測過程中無需酶的參與，因此不必預(yù)先此不必預(yù)先(yxin)處理樣本以消除處理樣本以消除內(nèi)源性酶的活性。內(nèi)源性酶的活性。第16頁/共22頁第十七頁，共23頁。18第17頁/共22頁第十

6、八頁，共23頁。疫原是整個(gè)蛋白分子或是胞外區(qū)、疫原是整個(gè)蛋白分子或是胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)。對(duì)于胞內(nèi)區(qū)抗體，染色胞內(nèi)區(qū)。對(duì)于胞內(nèi)區(qū)抗體，染色時(shí)需要使用穿孔時(shí)需要使用穿孔(chunkng)劑，劑，而胞外區(qū)抗體不必使用。而胞外區(qū)抗體不必使用。4. 正確使用：一般供應(yīng)商都會(huì)提供正確使用：一般供應(yīng)商都會(huì)提供稀釋范圍和使用方法。但常常需稀釋范圍和使用方法。但常常需要重新選擇比例。一般從供應(yīng)商要重新選擇比例。一般從供應(yīng)商提供稀釋比例的提供稀釋比例的1/10稀釋度始，作稀釋度始，作倍比稀釋。倍比稀釋。19第18頁/共22頁第十九頁，共23頁。20二抗二抗種屬來源要匹配：根據(jù)所用種屬來源要匹配：根據(jù)所用(su yn)

7、一抗選定二抗一抗選定二抗。一般來說，如果一抗是小鼠原性，二抗應(yīng)選。一般來說，如果一抗是小鼠原性，二抗應(yīng)選擇兔擇兔/山羊或其它種屬抗小鼠的抗體。山羊或其它種屬抗小鼠的抗體。注意抗體同種型和亞型：確定一抗同種型和亞型后注意抗體同種型和亞型：確定一抗同種型和亞型后，可以選擇抗一抗來源種屬廣譜，可以選擇抗一抗來源種屬廣譜Ig或針對(duì)一抗亞或針對(duì)一抗亞型的二抗。如一抗是小鼠型的二抗。如一抗是小鼠IgG1, 可以選用山羊抗可以選用山羊抗小鼠的小鼠的Ig或或IgG1的二抗。的二抗。正確使用：也需要重新選擇稀釋比例。一般從供應(yīng)正確使用：也需要重新選擇稀釋比例。一般從供應(yīng)商提供稀釋比例的商提供稀釋比例的1/10稀

8、釋度始，作稀釋度始，作5倍比稀釋倍比稀釋。第19頁/共22頁第二十頁，共23頁。21設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照-證明實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的正確性證明實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的正確性1. 1. 陽性對(duì)照：主要涉及所用緩沖液、稀釋陽性對(duì)照：主要涉及所用緩沖液、稀釋液、二抗和檢測系統(tǒng)等因素。尤其在結(jié)果出液、二抗和檢測系統(tǒng)等因素。尤其在結(jié)果出現(xiàn)無信號(hào)時(shí)，為查找原因提供重要線索?，F(xiàn)無信號(hào)時(shí)，為查找原因提供重要線索。2. 2. 陰性對(duì)照：一種是自身對(duì)照（常用），陰性對(duì)照：一種是自身對(duì)照（常用），指測試組織本身非抗原表達(dá)部位指測試組織本身非抗原表達(dá)部位(bwi)(bwi)。一種是外部對(duì)照，指已證實(shí)不表達(dá)檢測抗原一種是

9、外部對(duì)照，指已證實(shí)不表達(dá)檢測抗原的組織。的組織。第20頁/共22頁第二十一頁，共23頁。22試劑保存試劑保存-抗體試劑保存：抗體試劑保存：抗體濃度越高越穩(wěn)定，易保存；濃度低時(shí)抗體濃度越高越穩(wěn)定，易保存；濃度低時(shí)，應(yīng)加，應(yīng)加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保護(hù)的牛血清白蛋白作保護(hù)劑；必要時(shí)需要加劑；必要時(shí)需要加0.01-0.15NaN3防腐防腐劑以延長保存時(shí)間劑以延長保存時(shí)間(shjin)。 酶標(biāo)記抗體在應(yīng)用防腐劑時(shí)要注意不能用酶標(biāo)記抗體在應(yīng)用防腐劑時(shí)要注意不能用NaN3，否則會(huì)抑制酶的活性。，否則會(huì)抑制酶的活性。抗體濃縮液應(yīng)在抗體濃縮液應(yīng)在-20保存，可以長達(dá)兩保存，可以長達(dá)兩年；用時(shí)取出，室溫融解，如一次或短時(shí)年；用時(shí)取出，室溫融解，如一次或短時(shí)間間(shjin)用不完，應(yīng)進(jìn)行小量分裝，用不完，應(yīng)進(jìn)行小量分裝，-20保存，避免反復(fù)凍融；融解后抗體于保存，避免反復(fù)凍融；融解后抗體于28可以保存一個(gè)月?？梢员４嬉粋€(gè)月。第21頁/共22頁第二十二頁，共23頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)會(huì)計(jì)學(xué)。組織標(biāo)本（石蠟切片(qi pin)和冰凍切片(qi pin)）。（2）非醛類固定劑：適用于多肽類激素的組織固定，常與戊二醛或多聚甲醛