葡萄糖微生物限度檢查法分析方法驗證

1、葡萄糖微生物限度檢查法分析方法驗證目錄a、驗證方案1概述2. 適用范圍3. 驗證目的4. 驗證小組及職責分工4. 1驗證小組4. 2職責分工5. 驗證內容6. 漏項與偏差及采取的糾偏牯施.7. 驗證結論8. 驗證方案批準b、驗證報告1. 概述2. 適用范圍3. 驗證目的4. 驗證小組及職責分工4. 1驗證小組4. 2職責分工5. 確證內容6. 漏項與偏差及采取的糾偏措施.7. 驗證結論8. 最終批準9.再驗證周期1概述由于某些供試品抗菌活性，在建立測定方法或原測定法的檢驗條件發(fā)生改變時，町能影 響檢驗結果的準確性，必須対供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性、重現(xiàn)性進行驗證。 驗證時，按供試液的制

2、備和細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法進行。對各試驗菌的回 收率應逐一進行驗證。2適用范圍適用于進廠的原輔料葡萄糖微工物限度檢查平皿法的驗證。3驗證廿的建立葡萄糖微41物限度分析方法，包括細菌數(shù)、爲菌數(shù)及酵母菌數(shù)的檢查以及控制菌的 檢查，并對分析方法進行驗證，以證明所采用的方法適合于葡萄糖微生物限度的檢查，為 日常的檢測工作提供依據(jù)。4驗證小組及職責分工5驗證內容5.1品種：匍萄糖原料5. 2驗證方法：微生物限度檢杳平iiil法5.3平皿計數(shù)方法的驗證5. 3. 1培養(yǎng)基及稀釋液5. 3. 1. 1培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。5. 3. 1.2稀釋液0. 9%

3、氯化鈉溶液、ph7. 0的無菌氯化鈉-蛋白豚緩沖液。5. 3. 2培養(yǎng)基的配制和滅菌將改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基按照購買廠家的使用說 明書進行配制，在適宜的溫度條件下滅菌冷卻后備用。5. 3.3試驗用具將試驗所用的培養(yǎng)皿用不銹鋼培養(yǎng)皿消毒桶盛放，其他所需用具和溶液用牛皮紙包好, 在121°c的溫度條件下滅菌20分鐘冷卻后備用。5. 3. 4驗證試驗用菌種驗證試驗用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為笫0 代)，并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。大腸埃希菌(escherichia coli) (cmcc(b) 4

4、4 102)金黃色衙萄球菌(staphylococcus aureus) (cmcc(b) 26 003)枯草芽他桿菌(bac i 1 i us subtil is) (cmcc(b) 63 501)白色念珠菌(candida albicans) (cmcc(f)98 001)黑曲w(aspergillus niger) (cmcc(f)98 003)5. 3. 5菌液制備：取經32. 5°c培養(yǎng)1824小時的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽砲桿菌營養(yǎng)肉湯 液體培養(yǎng)物，用0. 9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含菌數(shù)為50loocfu的菌懸液。取經25. 5°c培養(yǎng)2448小

5、時的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)物，用0. 9%無菌氯化鈉溶液制 成每lml含菌數(shù)為50loocfu的菌懸液。取經25. 5°c培養(yǎng)57天的黑1111霉改良馬丁斜而培養(yǎng)物，加0. 9%無菌氯化鈉溶液3 5ml,將砲子洗脫。然后，吸出抱子懸液至無菌試管內，用9ml 0. 9%無菌氯化鈉溶液制成 每lml含50loocfu的他子懸液。5. 3. 6活菌計數(shù)活菌計數(shù)結果見下表活菌計數(shù)(cfu/ml)5. 3. 7供試液制備取葡萄糖10g,加入ph7.0的無菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液至100訊溶解，混勻，作為 1:10的供試液。5. 3. 8驗證方法a試驗組用吸管分別取上述1:10供試液lml和含試

6、驗菌50loocfu的大腸埃希菌、金黃色葡萄 球菌、枯草芽他桿菌、口色念珠菌、黑曲霉的菌懸液，每種試驗菌平行測定兩份。前3種 菌加入平皿中并加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，后2種菌加入平川l中并加入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。b菌液組(測定所加的試驗菌數(shù))取和試驗組一樣多的試驗菌加入平血后培養(yǎng)。c供試品對照組取和試驗組一樣稀釋級別的供試液lml,加入平血中，平行操作4份，2份加入營養(yǎng)瓊 脂培養(yǎng)基并培養(yǎng)，另2份加入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基并培養(yǎng)。d稀釋劑對照組用吸管分別取稀釋液1ml和含試驗菌50loocfu的人腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯 草芽他桿菌、門色念珠菌、黑曲霉的菌懸液，置平皿中，每種試驗菌平行測定兩份。前3

7、種菌加入平皿中并并加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，后2種菌加入平皿中并加入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng) 基。e陰性對照用吸管分別取ph7. 0的無菌氯化鈉-蛋白豚緩沖液51巻平皿中，分別加入營養(yǎng)瓊脂培 養(yǎng)基和玫塊紅鈉瓊脂培養(yǎng)基并培養(yǎng)。5. 3. 9培養(yǎng)及計數(shù)獨立平行操作3份。分別將玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基在25.5°c培養(yǎng)72小時，逐h計數(shù)，以 72小時的菌落數(shù)報告,營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在32. 5°c培養(yǎng)48小時逐日計數(shù)，以48小時的菌 落數(shù)報告。5. 3. 10試驗結果試驗組菌落計數(shù)(cfu/ml )實驗次數(shù)1 2 3平均菌落數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽他桿菌口色念珠菌黑曲霉菌液組菌落計數(shù)(cfu/m

8、l)實驗次數(shù)1 2 3平均菌落數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽砲桿菌白色念珠菌黑曲霉供試品對照組菌落計數(shù)(cfu/ml)實驗次數(shù)1 2 3平均菌落數(shù)人腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽泡桿菌白色念珠菌黑曲霉稀釋劑對照組菌-落計數(shù)(cfu/ml)實驗次數(shù)1 2 3平均菌落數(shù)人腸埃希菌金黃色衙萄球菌枯草芽泡桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗組的回收率(%)=試驗組平均菌落數(shù)一供試液對照組平均菌落數(shù)菌液紐平均菌落數(shù)x100%稀釋劑對照組平均菌落稀釋劑對照組的回收率(%)=數(shù)x100%菌液組平均菌落數(shù)試驗紐的回收率(%)實驗次數(shù)1 2 3平均冋收率人腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽泡桿菌白色念珠菌黑曲得稀釋劑對照組的回收

9、率(%)實驗次數(shù)1 2 3平均冋收率人腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孑包桿菌白色念珠菌黑曲爲5.4控制菌檢杳驗證5. 4. 1培養(yǎng)基及稀釋液5. 4. 1. 1培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng) 肉湯培養(yǎng)基。5. 4. 1.2稀釋液0. 9%氯化鈉溶液、pii7. 0的無菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液5. 4.2驗證試驗用菌種金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus ) cmcc(b)26003大腸埃希菌(escherichia coli) cmcc(b) 441025. 4. 3試驗步驟5.4. 3. 1培養(yǎng)基的配制和滅菌將營養(yǎng)瓊脂培

10、養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營 養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基按照購買廠家的使用說明書進行配制，在121°c的條件下滅菌20n)in冷卻后 備用。5. 4. 3. 2試驗用具將試驗所用的培養(yǎng)皿用不銹鋼培養(yǎng)皿消毒桶盛放，氏他所需用具和溶液用牛皮紙包好， 在121°c的溫度條件下滅菌20分鐘冷卻后備用。5. 4. 3. 3菌液制備取經36°c培養(yǎng)1824小時的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)物lml, 用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每lml含菌數(shù)為10loocfu的菌懸液。5. 4. 3. 4供試液的制備見5. 3.6供試液的制備。5.

11、4. 3. 5活菌計數(shù)活菌計數(shù)結果見下表活菌計數(shù)(cfu/ml)5. 4. 3. 6驗證方法a.試驗組分別取上述5. 3.6中1： 10供試液10ml和含試驗菌大腸埃希菌的菌懸液10loocfu, 置于盛放有100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。b. 陰性対照組分別取上述5.3.6 + 1： 10供試液10ml和含試驗菌金黃色葡萄球菌的菌懸液lml 10 loocfu,置于100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。c. 陰性對照取ph7.0的無菌氯化鈉-蛋白豚緩沖液10ml,置于100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。d.供試 品的測試取上述5.3.6中1： 10供試液10ml,置于looiiil的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。5. 5

12、培養(yǎng)及計 數(shù)將膽鹽乳糖培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在36±1°c培養(yǎng)1824小時，必要時延長至48小時 計數(shù)。5.6合格標準 計算供試品組的菌回收率、稀釋劑對照組的菌凹收率a、在3次獨立的 平行試驗屮，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù) 的百分率）應均不低于70%. b、若試驗組的菌冋收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照 纟i的平均菌落數(shù)的值占菌液紐的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70%,按此該供試液制備方 法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù).c、若任一次試驗中試驗組的菌回收率低 于70%,應采重新驗證。陰性対照組不得檢出陰性対照菌。若試驗

13、組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢 查法作該供試品的控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應消除供試詁的抑菌活性。建立 新的方法，并垂新驗證。5. 7驗證結果分析與評價稀禪劑對照組菌回收率分別為均不低于70%；試驗組菌的回收率分別為均不低于70%, 表明徊萄糖原料無抑菌成分?？砂垂┰囈褐苽浞椒ê推酱?法測定葡萄糖原料的細菌、需菌 和酵母菌數(shù)；在控制菌的驗證屮分別川人腸埃希菌、金黃色葡萄球菌兩種菌種進行了驗證，陰性菌對 昭八、組陰性対照菌，試驗組檢出試驗菌，陰性對照無菌生長，供試詁。計數(shù)方法準確和控 制菌方法專屬性強，能滿足葡萄糖微生物限度檢查的需要，此分析方法可行。在以后的微 生物限度檢測中

14、，檢驗人員按照驗證的分析方法進行葡萄糖微生物限度檢查。6.漏項與偏差及采取的糾偏措施在驗證過程中，若出現(xiàn)漏項或偏差，立即向驗證領導小組報告，征得同惠后，將漏項或 偏差部分采取的冇關措施詳細闡明。結論：檢查人：復核人：年 月曰7驗證結論評價人：年刀日8再驗證8. 1修訂檢驗方法后；&2供試品組分發(fā)生改變町能影響檢驗結果時；&3原檢驗條件發(fā)生改變町能影響檢驗結果時；& 4定期的方法驗證：每年一次。9驗證合格證書1概述由于某些供試品抗菌活性，在建立測定方法或原測定法的檢驗條件發(fā)生改變時，町能影 響檢驗結果的準確性，必須対供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性、重現(xiàn)性進行驗證。 驗

15、證時，按供試液的制備和細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法進行。對各試驗菌的回 收率應逐一進行驗證。2適用范圍適用于進廠的原輔料葡萄糖微生物限度檢查平皿法的驗證。3驗證冃的建立葡萄糖微物限度分析方法，包括細菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)的檢查以及控制菌的 檢查，并對分析方法進行驗證，以證明所采用的方法適合于葡萄糖微生物限度的檢查，為 日常的檢測工作提供依據(jù)。4驗證小組及職責分丁5驗證內容5.1品種：匍萄糖原料5. 2驗證方法：微生物限度檢査平川l法5. 3平皿計數(shù)方法的驗證5. 3. 1培養(yǎng)基及稀釋液5. 3. 1. 1培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。5. 3. 1.2稀釋

16、液0. 9%氯化鈉溶液、ph7. 0的無菌氯化鈉-蛋白腺緩沖液。5. 3.2培養(yǎng)基的配制和滅菌將改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基按照購買廠家的使用說 明書進行配制，在適宜的溫度條件下滅菌冷卻后備用。5. 3. 3試驗用具將試驗所用的培養(yǎng)皿用不銹鋼培養(yǎng)皿消毒桶盛放，其他所需用具和溶液用牛皮紙包好, 在121°c的溫度條件下滅菌20分鐘冷卻后備用。5. 3. 4驗證試驗用菌種驗證試驗用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為笫0 代)，并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。大腸埃希菌(escherichia coli) (cmc

17、c(b) 44 102)金黃色衙萄球菌(staphylococcus aureus) (cmcc(b) 26 003)枯草芽他桿菌(bac i 1 i us subtil is) (cmcc(b) 63 501)白色念珠菌(candida albicans) (cmcc(f) 98 001)黑曲霉(aspergillus niger) (cmcc(f)98 003)5. 3. 5菌液制備:取經32. 5°c培養(yǎng)1824小時的大腸埃希菌、金黃色匍萄球菌與枯草芽砲桿菌營養(yǎng)肉湯 液體培養(yǎng)物，用0. 9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含菌數(shù)為50loocfu的菌懸液。取經25. 5°c

18、培養(yǎng)2448小時的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)物，用0. 9%無菌氯化鈉溶液制 成每lml含菌數(shù)為50loocfu的菌懸液。取經25. 5°c培養(yǎng)57天的黑曲爲改良馬丁斜面培養(yǎng)物，加0. 9%無菌氯化鈉溶液3 5ml,將孑包子洗脫。然后，吸出范子懸液至無菌試管內，用9ml 0. 9%無菌氯化鈉溶液制成 每lml含50loocfu的抱子懸液。5. 3.6活菌計數(shù)活菌計數(shù)結果見下表活菌計數(shù)(cfu/ml)5. 3. 7供試液制備取葡萄糖10g,加入ph70的無菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液至100ml溶解,混勻，作為 1:10的供試液。5. 3. 8驗證方法a試驗組用吸管分別取上述1:10供試液lm

19、l和含試驗菌50loocfu的大腸埃希菌、金黃色筍萄 球菌、枯草芽他桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液，每種試驗菌平行測定兩份。前3種 菌加入平皿屮并加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，后2種菌加入平皿小并加入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。b菌液組(測定所加的試驗菌數(shù))取和試驗組一樣多的試驗歯加入平皿后培養(yǎng)。c供試品對照組取和試驗組一樣稀釋級別的供試液1眉，加入平皿中，平行操作4份，2份加入營養(yǎng)瓊 脂培養(yǎng)基并培養(yǎng)，另2份加入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基并培養(yǎng)。d稀禪劑對照組用吸管分別取稀釋液lml和含試驗菌-50loocfu的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯 草芽泡桿菌、口色念珠菌、黑曲霉的菌懸液，置平川i中，每種試驗菌平行測定兩份

20、。前3 種菌加入平血中并并加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)棊，后2種菌加入平血中并加入玫塊紅鈉瓊脂培養(yǎng) 基。e陰性對照用吸管分別取ph7. 0的無菌氯化鈉-蛋白腺緩沖液lml逍平皿中，分別加入營養(yǎng)瓊脂培 養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基并培養(yǎng)。5. 3. 9培養(yǎng)及計數(shù)獨立平行操作3份。分別將玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基在255°c培養(yǎng)72小時，逐口計數(shù)，以 72小時的菌落數(shù)報告，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在32. 5°c培養(yǎng)48小時逐日計數(shù)，以48小時的菌 落數(shù)報告。5. 3. 10試驗結果試驗組菌落計數(shù)(cfu/ml)實驗次數(shù)1 2 3平均菌落數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽砲桿菌白色念珠菌黑曲孫菌液組菌落計數(shù)(cf

21、u/ml )實驗次數(shù)1 2 3平均菌落數(shù)人腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽砲桿菌口色念珠菌黑曲霍供試品対照組菌落計數(shù)(cfu/ml)實驗次數(shù)1 2 3平均菌落數(shù)人腸埃希菌金黃色匍萄球菌枯草芽砲桿菌白色念珠菌黑曲霉稀釋劑対照組菌落計數(shù)(cfu/ml)實驗次數(shù)1 2 3平均菌落數(shù)人腸埃希菌金黃色匍萄球菌枯草芽砲桿菌門色念珠菌黑曲霉試驗組的回收率(%)=試驗組平均菌落數(shù)一供試液對照組平均菌落數(shù)菌液組平均菌落數(shù)x100%稀釋劑對照組平均菌落稀釋劑對照組的回收率(%)=數(shù)x100%菌液組平均菌落數(shù)試驗組的回收率(%)實驗次數(shù)1 2 3平均冋收率大腸埃希菌金黃色匍萄球菌枯草芽抱桿菌白色念珠菌黑曲得稀釋劑對照組

22、的冋收率(%)實驗次數(shù)1 2 3平均回收率大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽砲桿菌白色念珠菌黑曲霉5. 4控制菌檢査驗證5. 4. 1培養(yǎng)基及稀禪液5. 4. 1. 1培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、瞎紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng) 肉湯培養(yǎng)基。5. 4. 1.2稀釋液0. 9%氯化鈉溶液、ph7. 0的無菌氯化鈉-蛋白豚緩沖液5. 4.2驗證試驗用菌種金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus ) cmcc(b)26003大腸埃希菌(escherichia coli) cmcc(b) 441025. 4. 3試驗步驟5.4. 3. 1培養(yǎng)基的配制和滅菌將營養(yǎng)瓊脂

23、培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營 養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基按照購買廠家的使用說明書進行配制，在121°c的條件下滅菌20min冷卻后 備用。5. 4. 3. 2試驗用具將試驗所用的培養(yǎng)皿用不銹鋼培養(yǎng)皿消毒桶盛放，氏他所需用具和溶液用牛皮紙包好， 在121°c的溫度條件下滅菌20分鐘冷卻后備用。5. 4. 3. 3菌液制備取經36°c培養(yǎng)1824小時的大腸埃希菌、金黃色徊萄球菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)物lml, 用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每lml含菌數(shù)為10loocfu的菌懸液。5. 4. 3. 4供試液的制備見5. 3.6供試液的制備。5. 4. 3. 5活菌計數(shù)活菌計數(shù)結果見下表活菌計數(shù)(cfu/ml)5. 4. 3. 6驗證方法a.試驗組分別取上述5. 3.6中1： 10供試液10ml和含試驗菌大腸埃希菌的菌懸液10loocfu, 置于盛放有100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。b. 陰性對照組分別取上述5. 3.6中1： 10供試液10ml和含試驗菌金黃色葡萄球菌的菌懸液lml 10 loocfu,置于100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基屮。c. 陰性對照取p1i7. 0的無菌氯化鈉-蛋白腋緩沖液10