不同肉質(zhì)顏色蘿卜DFR基因表達(dá)差異分析

1、    不同肉質(zhì)顏色蘿卜dfr基因表達(dá)差異分析    陳發(fā)波 高健 姚啟倫摘要：為了探明dfr基因的表達(dá)量與蘿卜紅色素含量之間的關(guān)系，以16個(gè)色素含量不同的蘿卜品種為研究材料，測(cè)定肉質(zhì)根色素含量和dfr基因的表達(dá)量，并進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明，不同類(lèi)型蘿卜品種間色素含量存在真實(shí)的差異，16個(gè)蘿卜品種間色素含量變幅在0.0125.43，平均值為7.40。采用rt-pcr法定量分析dfr基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，dfr基因在16個(gè)品種蘿卜中的表達(dá)差異達(dá)到了極顯著水平，dfr基因表達(dá)量在0.077 96.639 3 之間，平均值為1.574 1。對(duì)16個(gè)蘿卜品種

2、的dfr基因表達(dá)量與色素含量進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明，dfr基因相對(duì)表達(dá)量與色素含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.89，達(dá)到了極顯著水平，說(shuō)明dfr基因的表達(dá)量越高，蘿卜紅色素的含量越高。推測(cè)dfr基因可能是蘿卜紅色素合成的關(guān)鍵基因，可將其作為蘿卜或其他作物色素生產(chǎn)基因工程的候選基因。關(guān)鍵詞：紅心蘿卜;紅色素;rt-pcr;dfr基因;表達(dá)量;方差分析： s631.101  文獻(xiàn)標(biāo)志碼： a  ：1002-1302（2019）12-0182-04紅心蘿卜別稱(chēng)胭脂蘿卜，是十字花科蘿卜屬蘿卜種中的一個(gè)地方品種，在1979年蔬菜品種調(diào)查中確認(rèn)為重慶涪陵特產(chǎn)1。紅心蘿卜具有心皮全紅、色澤鮮美的

3、特點(diǎn)，用以制作泡菜、蘿卜干等，口感清脆。此外在紅心蘿卜中提取的紅色素不僅可以作為食品添加劑，還具有抗氧化、抗痛風(fēng)等功效，其應(yīng)用前景廣闊。涪陵紅心蘿卜在涪陵及周邊區(qū)縣均有栽種，是非常具有地方特色的蔬菜品種。但由于人們長(zhǎng)期以來(lái)的自繁自種及紅心蘿卜與其他蘿卜品種容易相互授粉，紅心蘿卜的一些優(yōu)良性狀已逐步退化，如紅心性狀普遍退化，亟待人們對(duì)其色素合成相關(guān)基因展開(kāi)研究，以保護(hù)和利用這一特色農(nóng)業(yè)資源。目前人們對(duì)于涪陵紅心蘿卜的研究主要集中在新品種選育1-3、相關(guān)性狀關(guān)系4-6與蘿卜紅色素的提取工藝7-8等方面，而關(guān)于基因表達(dá)量與色素含量之間的關(guān)聯(lián)性分析報(bào)告較少。二氫黃酮醇-4-還原酶（dfr）是植物花青素

4、合成途徑中的關(guān)鍵酶，它在不同植株間具有高度的同源性。dfr基因?yàn)楸Ｊ鼗?-10，其表達(dá)存在時(shí)空差異性11，并且受多種因素的限制，如ga、nacl、光照和uv-a等12-14。盡管dfr基因的相關(guān)特性及其在色素合成過(guò)程中的重要作用已逐漸為人所知，但其在紅心蘿卜色素合成中的作用尚不清楚。本研究通過(guò)分析dfr基因在不同肉質(zhì)顏色蘿卜中的表達(dá)差異，探尋dfr基因與蘿卜肉質(zhì)根顏色形成的關(guān)系，從分子水平解析紅心蘿卜紅色素合成的機(jī)制，對(duì)改善紅心蘿卜優(yōu)良性狀、提高其利用價(jià)值具有重要意義，為通過(guò)基因工程手段提高紅心蘿卜的蘿卜紅色素含量提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 供試材料試驗(yàn)選用16份來(lái)自長(zhǎng)江師范學(xué)院的不

5、同肉質(zhì)顏色蘿卜品種，材料編號(hào)及相關(guān)表型性狀見(jiàn)表1。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 于2015年9月至2016年1月在長(zhǎng)江師范學(xué)院試驗(yàn)地進(jìn)行田間試驗(yàn)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置2次重復(fù)，每個(gè)品種種植3行，每行12株，行距50 cm，株距33 cm。2015年9月23日播種，2015年9月30日出苗，出苗后 100 d，進(jìn)行色素含量測(cè)定和肉質(zhì)根總rna的提取，每個(gè)處理取中間10株獲取數(shù)據(jù)資料。1.2.2 蘿卜肉質(zhì)根色素含量的測(cè)定 16個(gè)不同肉質(zhì)顏色蘿卜品種肉質(zhì)根的色素含量依照呂發(fā)生等提出的方法15提取測(cè)定，其操作步驟如下：（1）稱(chēng)取檸檬酸16.958 0 g、磷酸二氫鈉13.500 0 g配制成

6、ph值為3.0的緩沖液1 000 ml，稱(chēng)取蘿卜紅色素 0.205 2 g，加入95 %乙醇1 ml為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。然后分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液113 ml并用緩沖液定容至 100 ml，在 520 nm 處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。（2）將新鮮肉質(zhì)根清洗、擦干，切成小顆粒充分混勻，立即稱(chēng)取鮮樣測(cè)定肉質(zhì)根含水量，余下部分用漿渣自動(dòng)分離機(jī)獲取汁液，攪勻之后取810 ml汁液在離心機(jī)中以 4 000 r/min 離心5 min，離心完成后汲取1 ml上清液，用磷酸二氫鈉緩沖液定容到 100 ml，然后在分光光度計(jì)中檢測(cè)520 nm波長(zhǎng)下的吸光度。（3）1 000 g新鮮肉質(zhì)根的蘿卜紅含量c鮮（）=v

7、5;y。其中，汁液容積v（ml）=1 000×肉質(zhì)根含水量（%）;汁液濃度y（g/ml）由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程計(jì)算。1.2.3 蘿卜肉質(zhì)根總rna的提取 本次蘿卜肉質(zhì)根總rna提取方法參照柱式植物總rna抽提純化試劑盒（sk8661）提取，試劑盒組成成分（表2）及具體操作步驟如下。首先按照試劑盒說(shuō)明在gt溶液、nt溶液中加入相應(yīng)量的無(wú)水乙醇，混合均勻后在室溫下密封保存?zhèn)溆?，每次使用后注意將瓶蓋旋緊，保持gt溶液、nt溶液中的乙醇含量（18 ml gt溶液中加入12 ml無(wú)水乙醇，36 ml gt溶液中加入24 ml無(wú)水乙醇;6 ml nt溶液中加入24 ml無(wú)水乙醇，12 ml nt溶

8、液中加入48 ml無(wú)水乙醇）。最后在1.5 ml rnase-free的離心管加入450 l buffer rlysis-pg后備用。（1）取蘿卜肉質(zhì)根組織2550 mg于研缽中，加入少許液氮迅速研磨成粉末，并將其全部轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，立刻振蕩將之混勻，在室溫中放置5 min后置于4 離心機(jī)中以12 000 r/min離心3 min，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到 1.5 ml rnase-free離心管中，然后加入二分之一體積的無(wú)水乙醇，并充分混合均勻。（2）將吸附柱放入收集管中，用移液器將上述離心管中溶液全部加至吸附柱中，靜置1 min，在室溫下以12 000 r/min離心1 min后

9、將收集管中的廢液倒掉;加入500 l gt溶液，靜置1 min，在室溫下以10 000 r/min離心1 min后將收集管中的廢液倒掉;加入500 l nt溶液，靜置1 min，在室溫下以10 000 r/min離心1 min后將收集管中的廢液倒掉。（3）將吸附柱放回收集管中，以12 000 r/min離心2 min后將吸附柱取出放入1.5 ml rnase-free離心管中，在吸附柱中間加入3050 l depc-treated ddh2o，靜置2 min后以12 000 r/min離心2 min，將最后得到的rna溶液置于 -70 冰箱中保存或留待后續(xù)試驗(yàn)使用。1.2.4 dfr引物設(shè)計(jì)

10、選用primer 5軟件設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參基因的上下引物堿基序列。依據(jù)美國(guó)國(guó)立生物信息網(wǎng)（ncbi）發(fā)布的dfr基因堿基序列，設(shè)計(jì)dfr基因的引物序列：dfr-f：5-tcatcggttcatggctcgt-3 59.1，dfr-r：5-ccgtttatggcgtcatcgta-3，擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)共184 bp;內(nèi)參基因（actin）的引物序列：actin-f：5-tatgagcaaagagatcacagcact-3，actin-r：5-tgagggaagcaagaatggaa-3，擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)共113 bp。dfr基因引物和內(nèi)參基因（actin）引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。1.2.

11、5 rna反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cdna 使用第一鏈cdna合成試劑盒合成第一鏈cdna，操作流程如下：（1）將以下試劑加入0.2 ml pcr管中：總rna 5 l、0.2 g/l random primer p（dn）1 l和rnase-free ddh2o 5 l;（2）70 溫浴5 min;（3）冰浴10 s，將如下試劑加入離心后溶液中：10 u/l amv reverse transcriptase 2.0 l、20 u/l rnase inhibitor 1.0 l、10 mmol/l dntp mix 2.0 l、5×reaction buffer 4.0 l，總體積共20.

12、0 l;（4）37 溫浴5 min;（5）42 溫浴60 min;（6）70 溫水浴10 min后立即終止反應(yīng);（7）將上述溶液-20 保存或后續(xù)研究使用。1.2.6 熒光定量pcr測(cè)定 將上述合成的cdna樣品稀釋8倍作為模板上機(jī)檢測(cè)，然后配置反應(yīng)混合液（表3）和設(shè)置pcr循環(huán)條件（表4），完成上述步驟后，將反應(yīng)混合液加入96孔板后放在rt-pcr儀中開(kāi)始擴(kuò)增反應(yīng)。得到產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線(xiàn)與溶解曲線(xiàn)后，采用2-ct法16計(jì)算dfr基因初始模板數(shù)量的相對(duì)表達(dá)量（以?xún)?nèi)參基因actin為標(biāo)準(zhǔn)）。1.3 數(shù)據(jù)分析用dps數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)16種不同肉質(zhì)顏色蘿卜的dfr基因表達(dá)量（相對(duì)定量）和肉質(zhì)根色素含量進(jìn)行

13、方差分析，然后將dfr基因表達(dá)量與色素含量進(jìn)行相關(guān)分析。2 結(jié)果與分析2.1 不同蘿卜品種色素含量分析對(duì)16個(gè)蘿卜品種的色素含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表5）表明，不同類(lèi)型蘿卜品種間色素含量存在真實(shí)差異。16個(gè)蘿卜品種的色素含量和多重比較結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，16個(gè)蘿卜品種間色素含量變幅在0.0125.43，平均值為 7.40。其中編號(hào)14蘿卜品種色素含量最高（25.43），編號(hào)3和編號(hào)4蘿卜紅色素含量最低（0.01）;編號(hào)14（25.43）、編號(hào)15（23.48）和編號(hào)16（22.58）蘿卜品種色素含量顯著高于其他種蘿卜品種;編號(hào)10、編號(hào)11、編號(hào)12和編號(hào)13蘿卜品種色素含量分別為10.5

14、8、8.68、7.26 和8.34;編號(hào)8蘿卜品種色素含量為4.53;編號(hào)5、編號(hào)6、編號(hào)7和編號(hào)9蘿卜品種紅色素含量分別為 2.41、1.25、2.57和1.00;編號(hào)1、編號(hào)2、編號(hào)3和編號(hào)4蘿卜肉質(zhì)根品種幾乎不含蘿卜紅色素。為進(jìn)一步分析不同類(lèi)型蘿卜肉質(zhì)根紅色素含量的變化情況，將16個(gè)品種的蘿卜按照皮和肉質(zhì)的顏色分為5個(gè)類(lèi)型：白皮白心（編號(hào)1、編號(hào)2、編號(hào)3和編號(hào)4），紅皮白心（編號(hào)5、編號(hào)6和編號(hào)7），綠皮紅心（編號(hào)8），紅皮花心（編號(hào)9、編號(hào)10、編號(hào)11、編號(hào)13、編號(hào)15和編號(hào)16），紅皮紅心（編號(hào)12和編號(hào)14）。方差分析結(jié)果（表6）和多重比較結(jié)果（圖2）表明，5種不同肉質(zhì)顏色蘿

15、卜間肉質(zhì)根紅色素含量存在極顯著差異，說(shuō)明紅色素含量與肉質(zhì)顏色有關(guān)。由圖2可知，紅皮紅心蘿卜色素含量最高，為22.83，其次為紅皮花心蘿卜（7.172）、綠皮花心蘿卜（4.530）、紅皮白心蘿卜（2.077）和白皮白心蘿卜（0.065）。2.2 不同蘿卜品種dfr基因表達(dá)量分析以從蘿卜肉質(zhì)根提取的rna反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cdna為模板，以?xún)?nèi)參基因（actin）為標(biāo)準(zhǔn)，采用rt-pcr擴(kuò)增后得到溶解曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn)， 采用2-ct法計(jì)算16個(gè)品種蘿卜的dfr基因表達(dá)量（相對(duì)定量），并對(duì)其進(jìn)行方差分析（表7）。結(jié)果表明，dfr基因在16個(gè)品種蘿卜中的表達(dá)差異達(dá)到了極顯著差異水平。由圖3可知，編號(hào)16蘿

16、卜品種的dfr基因表達(dá)量最高，達(dá)到6.639 3，編號(hào)1、編號(hào)2、編號(hào)3、編號(hào)4、編號(hào)5、編號(hào)6、編號(hào)7、編號(hào)8、編號(hào)9、編號(hào)10、編號(hào)12和編號(hào)13蘿卜品種dfr基因表達(dá)量變幅為0.077 91.059，編號(hào)11、編號(hào)14和編號(hào)15蘿卜品種的表達(dá)量分別為3.049 0、5.309 7和4.222 1。方差分析結(jié)果（表8）表明，5種不同肉質(zhì)顏色蘿卜品種間dfr基因相對(duì)表達(dá)量存在極顯著差異。由圖4可知，紅皮紅心蘿卜的dfr基因表達(dá)量最高，為5.390 4，紅皮花心蘿卜基因表達(dá)量為1.198 5，白皮白心蘿卜的相對(duì)定量最低，為 0.091 4，而紅皮白心蘿卜和綠皮紅心蘿卜dfr基因表達(dá)量分別為0.

17、674 6和0.632 9。2.3 不同蘿卜品種dfr基因表達(dá)量與蘿卜紅色素含量相關(guān)分析為了探明dfr基因表達(dá)量與蘿卜肉質(zhì)根紅色素含量的關(guān)系，采用dps數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)16個(gè)蘿卜品種的dfr基因表 達(dá)量和蘿卜肉質(zhì)根色素含量進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果表明，dfr基因表達(dá)量與紅色素含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.89，達(dá)到了極顯著水平，說(shuō)明dfr基因的表達(dá)量越高，紅色素的含量越高。3 結(jié)論與討論已有研究表明，dfr是植物花色素苷合成途徑中的關(guān)鍵酶，大量學(xué)者在矮牽牛、金魚(yú)草、擬南芥、三葉草、蘭花、非洲菊等多種作物方面進(jìn)行了研究13，但是關(guān)于涪陵紅心蘿卜方面的研究卻鮮有報(bào)道，僅有孫玉燕等研究了dfr基因在白肉蘿卜與紅肉

18、蘿卜在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式17，卻未對(duì)dfr基因與紅心蘿卜色素含量進(jìn)行相關(guān)分析，而弄清dfr基因的表達(dá)量與蘿卜紅色素含量之間的關(guān)聯(lián)將有利于更好地改善紅心蘿卜色素含量。本研究中，dfr基因的相對(duì)定量與肉質(zhì)根紅色素含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.89，達(dá)到了極顯著水平，說(shuō)明dfr基因的表達(dá)量越高，紅色素的含量越高，dfr基因可能是紅色素合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因。這與文樵夫等的研究結(jié)果18類(lèi)似，他們的研究結(jié)果表明海棠葉片的dfr基因表達(dá)量與葉色密切相關(guān)，葉色越紅的海棠，其葉片中花色素苷含量和dfr基因的表達(dá)量相對(duì)較高。此外馬春雷等發(fā)現(xiàn)不同茶樹(shù)品種中總兒茶素含量隨著lar和dfr基因表達(dá)量增加而增加，而其他基因

19、的表達(dá)量多少則與總兒茶素含量變化無(wú)關(guān)，因此推斷出dfr基因可能是茶樹(shù)黃酮類(lèi)代謝過(guò)程中的重要基因19。以上研究結(jié)果表明，dfr基因的表達(dá)量與色素積累關(guān)系密切，在色素合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。dfr基因在花色苷合成途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，許多學(xué)者將dfr基因作為候選基因，從分子水平上改善植物的色素含量，并且已經(jīng)取得了一定的成效。宋峰將毛白楊dfr基因轉(zhuǎn)入煙草中，發(fā)現(xiàn)外源dfr基因能夠改變煙草花瓣的顏色20。許志茹等研究發(fā)現(xiàn)，使煙草dfr基因過(guò)量表達(dá)后，花色能夠明顯加深，而將蕪菁的dfr基因rnai載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草后觀察到花色變淺13。由此，筆者認(rèn)為在今后紅心蘿卜紅色素含量育種中，可以將dfr作為蘿卜

20、基因工程育種的候選基因。在植物色素合成通路中有許多基因都會(huì)影響色素的積累，如chi、chs和ans等，然而本研究只對(duì)紅心蘿卜肉質(zhì)根成色過(guò)程中的1個(gè)基因dfr進(jìn)行了初步的分析，今后有待于進(jìn)一步地深入開(kāi)展紅心蘿卜色素合成分子機(jī)理研究。參考文獻(xiàn)：1呂發(fā)生，譚革新，陶洪英，等. 涪陵紅心蘿卜新品種胭脂紅1號(hào)的選育j. 中國(guó)蔬菜，2012，1（2）：104-106.2呂發(fā)生，陶洪英，譚革新，等. 雜交紅心蘿卜胭脂紅1號(hào)親本繁育技術(shù)規(guī)程j. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，61（9）：122-123.3秦文斌，戴忠良，張振超，等. 優(yōu)質(zhì)，高花青素蘿卜胭脂1號(hào)的選育與高產(chǎn)栽培技術(shù)j. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（

21、4）：75-76.4秦家順，許明惠，李昌滿(mǎn). 胭脂蘿卜農(nóng)藝性狀與肉質(zhì)根色素產(chǎn)量的多元回歸和通徑分析j. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（1）：107-109.5陶洪英，呂發(fā)生，譚革新，等. 紅心蘿卜肉質(zhì)根性狀間的關(guān)系j. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，25（2）：605-608.6陳發(fā)波，李春明，姚啟倫，等. 不同施肥處理對(duì)胭脂蘿卜主要性狀的影響j. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016（3）：441-446.7司 軍，李成瓊，任雪松，等. 胭脂蘿卜紅色素提取及其形成機(jī)理研究j. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，32（6）：73-77.8陽(yáng) 暉，楊呈鳳，李昌滿(mǎn)，等. 胭脂蘿卜廢渣中蘿卜硫素的提取工藝研究j. 食品科技，2016（2）：259-264.9潘怡辰，王 坤，王汝茜，等. 三種小麥作物二氫黃酮醇4-還原酶（dfr）基因的生物信息學(xué)分析j. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（6）：72-76.10肖繼坪，王 瓊，郭華春. 彩色馬鈴薯二氫黃酮醇4-還原酶（dfr）基因的克隆及生物信息學(xué)分析j. 分子植物育種，2011，9（6）：728-735.11褚云霞，陳海榮，潘俊松，等. 矮牽牛dfr-a基因的克隆與表達(dá)分析j. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（10）：163-169.12董 潔，王學(xué)敏，王 贊，