蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)

1、會(huì)計(jì)學(xué)1蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)2021年12月10日星期五2第一節(jié) 概述1985年由貝爾杜科等提出，1990年正式啟動(dòng)并于2003年學(xué)成的人類(lèi)基因組計(jì)劃使生命科學(xué)的研究進(jìn)入了后基因組時(shí)代。蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生2021年12月10日星期五3第一節(jié) 概述蛋白質(zhì)組是澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome）兩個(gè)詞的雜合,意指proteins expressed by a genome，即“一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”。2021年12月10日星期五4第一節(jié) 概述各國(guó)政府支持，國(guó)際著名研究和商業(yè)各國(guó)政府

2、支持，國(guó)際著名研究和商業(yè)機(jī)構(gòu)加盟：機(jī)構(gòu)加盟：19961996年澳大利亞建立了世界上第一個(gè)年澳大利亞建立了世界上第一個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心（蛋白質(zhì)組研究中心（Australia Australia Proteome Analysis FacilityProteome Analysis Facility，APAFAPAF）2021年12月10日星期五5第一節(jié) 概述美國(guó)國(guó)立癌癥研究院（美國(guó)國(guó)立癌癥研究院（NCINCI）投資）投資1 1 000000萬(wàn)美元建立肺、直腸、乳腺、卵萬(wàn)美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。巢腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。NCINCI和和FDAFDA共同投資數(shù)百萬(wàn)美元建立共同

3、投資數(shù)百萬(wàn)美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。2021年12月10日星期五6第一節(jié) 概述英國(guó)建立三個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心對(duì)已英國(guó)建立三個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心對(duì)已完成或即將完成全基因組測(cè)序的生物完成或即將完成全基因組測(cè)序的生物體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。2021年12月10日星期五7第一節(jié) 概述 CeleraCelera公司投資上億美元獨(dú)自啟動(dòng)了公司投資上億美元獨(dú)自啟動(dòng)了全面鑒定和分類(lèi)匯總?cè)祟?lèi)組織、細(xì)胞全面鑒定和分類(lèi)匯總?cè)祟?lèi)組織、細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體，構(gòu)建和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體，構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的工作。新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的工作。

4、2021年12月10日星期五8第一節(jié) 概述 19971997年召開(kāi)了第一次國(guó)際年召開(kāi)了第一次國(guó)際“蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)組學(xué)”會(huì)議會(huì)議 19981998年在美國(guó)舊金山召開(kāi)了第二屆年在美國(guó)舊金山召開(kāi)了第二屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議 19991999年年1 1月在英國(guó)倫敦舉行了應(yīng)用月在英國(guó)倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會(huì)議蛋白質(zhì)組會(huì)議2021年12月10日星期五9第一節(jié) 概述我國(guó)也于我國(guó)也于19981998年啟動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)研年啟動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在中科院上海生物化學(xué)研究所舉究，在中科院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國(guó)性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會(huì)辦了兩次全國(guó)性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會(huì)2021年12月10日星期五

5、10第一節(jié) 概述 20032003成立了中國(guó)人類(lèi)蛋白質(zhì)組組織成立了中國(guó)人類(lèi)蛋白質(zhì)組組織（CHHUPOCHHUPO），并分別于），并分別于20032003年年9 9月、月、20042004年年8 8月以及月以及20052005年年8 8月召開(kāi)月召開(kāi)了中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第了中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)，三屆學(xué)術(shù)大會(huì)，20042004年年1010月在中國(guó)月在中國(guó)北京召開(kāi)了第三屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)北京召開(kāi)了第三屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議。議。2021年12月10日星期五11第一節(jié) 概述科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我國(guó)國(guó)“973973”計(jì)劃項(xiàng)目和計(jì)劃項(xiàng)目

6、和“863863”計(jì)劃項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)也將目；國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)也將“蛋白質(zhì)組研究蛋白質(zhì)組研究”列為重點(diǎn)項(xiàng)目。列為重點(diǎn)項(xiàng)目。我國(guó)在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌我國(guó)在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大的進(jìn)展蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大的進(jìn)展。2021年12月10日星期五12第一節(jié) 概述蛋白質(zhì)組的概念：1995年，由Wasinger等在Wlectrophoresis中定義為一個(gè)基因組編碼的全部蛋白質(zhì)。1977年，在Williams和Wilkins有關(guān)蛋白質(zhì)組研究的專(zhuān)著ProteomeResearch:New frontiers in Functional Gen

7、omics中定義為一個(gè)基因組或組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。1999年進(jìn)一步定義為一個(gè)細(xì)胞的整個(gè)生命過(guò)程中由基因組表達(dá)的以及表達(dá)后修飾的全部蛋白質(zhì)。2021年12月10日星期五13第一節(jié) 概述蛋白質(zhì)組是：蛋白質(zhì)組是：1、對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。 2、同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同 。3、在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體。2021年12月10日星期五14第一節(jié) 概述蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門(mén)新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間

8、的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。 2021年12月10日星期五15熒光染色的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)2021年12月10日星期五16第一節(jié) 概述與單一蛋白質(zhì)研究比較，蛋白質(zhì)組學(xué)與單一蛋白質(zhì)研究比較，蛋白質(zhì)組學(xué)的特點(diǎn)是：的特點(diǎn)是：蛋白質(zhì)組學(xué)采用高通量和大規(guī)模的研究手段，在研究有關(guān)生命活動(dòng)機(jī)制的基本規(guī)律方面達(dá)到了空前的規(guī)模和速度。最終目標(biāo)：構(gòu)建出細(xì)胞的“功能圖 ”2021年12月10日星期五17第一節(jié) 概述與基因組比較，蛋白質(zhì)組學(xué)的特點(diǎn)是與基因組比較，蛋白質(zhì)組學(xué)的特點(diǎn)是：基因組蛋白質(zhì)組整體的動(dòng)態(tài)的每個(gè)生物體只有一個(gè)基因組復(fù)雜程度低修飾程度低特異性低整體的動(dòng)態(tài)的基因組中各個(gè)基因的表達(dá)條件及程

9、度隨不同的時(shí)間與地點(diǎn)的不同而不同復(fù)雜程度高修飾程度高特異性高2021年12月10日星期五18 了解某種特定的細(xì)胞、組了解某種特定的細(xì)胞、組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類(lèi)；織或器官制造的蛋白質(zhì)種類(lèi)； 明確各種蛋白質(zhì)分子是如明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類(lèi)似于電路的網(wǎng)絡(luò)的；何形成類(lèi)似于電路的網(wǎng)絡(luò)的； 描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)，揭描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)，揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位，如與藥物結(jié)示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位，如與藥物結(jié)合并且決定其活性的部位。合并且決定其活性的部位。 2021年12月10日星期五19第一節(jié) 概述蛋白質(zhì)組學(xué)研究的意義Genome - 導(dǎo)演導(dǎo)演RNome - 編劇編劇Proteome-演員演員

10、2021年12月10日星期五20Central dogma2021年12月10日星期五21mRNA水平的基因表達(dá)研究取得進(jìn)展，但mRNA與蛋白質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)僅為0.40.5， mRNA的種類(lèi)與含量不能代表蛋白質(zhì)的種類(lèi)與含量。支原體的蛋白質(zhì)數(shù)目較基因多24%，對(duì)于人，蛋白質(zhì)的數(shù)目至少多3倍。蛋白質(zhì)自身特點(diǎn)難以從DNA和mRNA水平得到解答：復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位或遷移、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用等基因與其編碼產(chǎn)物蛋白的非線性關(guān)系第一節(jié) 概述2021年12月10日星期五22第一節(jié) 概述蛋白質(zhì)組學(xué)研究范圍及意義蛋白質(zhì)組學(xué)研究范圍及意義表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究 選擇具有重要生物學(xué)意義且已完成DNA測(cè)

11、序的生物體，鑒定出生物體/某種組織（細(xì)胞）所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，建立其蛋白質(zhì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。 進(jìn)展較快的領(lǐng)域：一些重要的疾病及微生物組。有難度的領(lǐng)域：估計(jì)人類(lèi)的蛋白質(zhì)組由50萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)組成，真核生物細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)也超出1萬(wàn)個(gè)2021年12月10日星期五23第一節(jié) 概述功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究 識(shí)別、鑒定生物體（組織，細(xì)胞）與某一種生理現(xiàn)象或病理過(guò)程相關(guān)的所有蛋白質(zhì)。重要生命過(guò)程或重要疾病的比較蛋白質(zhì)組學(xué) 選取重大生命活動(dòng)或重要疾病中幾個(gè)相繼階段，識(shí)別、鑒定其差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，然后從核酸、蛋白質(zhì)水平對(duì)差異蛋白的功能進(jìn)行分析，從而確定重要生命活動(dòng)的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)或疾病的生物標(biāo)志物。2021年12月10日星期五

12、24第一節(jié) 概述亞細(xì)胞復(fù)合物和細(xì)胞器蛋白質(zhì)組分析 了解蛋白質(zhì)的功能和細(xì)胞 定位。識(shí)別、鑒定蛋白質(zhì)翻譯后的修飾。藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn) 蛋白質(zhì)不僅是多種致病因子作用于機(jī)體的重要靶分子，也是大多數(shù)藥物的靶標(biāo)。一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)表明：20世紀(jì)90年代中期，全世界制藥業(yè)用于尋找新藥的靶標(biāo)483個(gè)，其中蛋白質(zhì)占73%，而當(dāng)時(shí)正在使用的藥物共2000種，其中85%都是針對(duì)483種藥靶。2021年12月10日星期五252021年12月10日星期五26第一節(jié) 概述發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺(tái)是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。2021年12月10日星期五27第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系蛋白質(zhì)

13、組學(xué)的三大支撐技術(shù)分離技術(shù)：雙向電泳技術(shù)鑒定技術(shù)：質(zhì)譜技術(shù)生物信息學(xué)：計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)2021年12月10日星期五28第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系蛋白質(zhì)組學(xué)的三大支撐技術(shù)分離技術(shù)：雙向電泳技術(shù)鑒定技術(shù)：質(zhì)譜技術(shù)生物信息學(xué)：計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)2021年12月10日星期五29第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系蛋白質(zhì)組學(xué)兩條互補(bǔ)的技術(shù)流程兩條互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)流程基于凝膠的工作流程（Gel-based workflow）基于液相色譜的工作流程（LC-based workflow）2021年12月10日星期五302021年12月10日星期五312021年12月10日星期五3

14、22021年12月10日星期五33第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系雙向電泳Two Dimensional Electrophoresis2021年12月10日星期五34第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系二維凝膠電泳（2-DE）目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離與展示的分離技術(shù)工作原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的兩個(gè)一級(jí)屬性：等電點(diǎn)和分子量的特異性，將蛋白質(zhì)混合物通過(guò)等電聚焦電泳（IEF）和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），在兩個(gè)水平上進(jìn)行分離。1975年首先由OFarrell等創(chuàng)立2021年12月10日星期五352021年12月10日星期五36第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系特 點(diǎn)：1、可分離10100

15、KDa分子量的蛋 白質(zhì) 2、高靈敏度和高分辨率3、重復(fù)性高4、便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理 5、與質(zhì)譜分析匹配2021年12月10日星期五37第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系重復(fù)性高的技術(shù)前提：1、樣品制備的重現(xiàn)性2、等電聚膠的pH梯度的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性3、一向膠條與二向膠之間的接觸是否良好4、二向聚丙的聚合均勻程度及重現(xiàn)度5、凝膠顯色方法的選擇及顯色時(shí)間的控制實(shí)驗(yàn)人員的操作技能2021年12月10日星期五382D-SDS-PAGE重復(fù)性2021年12月10日星期五392021年12月10日星期五40第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系1、樣品制備通?？刹捎眉?xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。

16、 也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí)，即將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成不同部分，分別進(jìn)行研究。2021年12月10日星期五41第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系過(guò)程1）收集生物樣品2）破碎3）抽提2021年12月10日星期五42第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系抽提蛋白質(zhì)常用到的試劑1）去污劑，有助于溶解膜蛋白質(zhì)，并有助于膜蛋白質(zhì)與脂類(lèi)的分離2）還原劑，用于還原二硫鍵或防止蛋白質(zhì)氧化3）變性劑，用于改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度和PH，破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。4）酶，用于消化污染的核酸、糖和脂類(lèi)。2021年12月10日星期五43第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系可能干擾蛋白質(zhì)組分析的某些試劑

17、 1）苯甲基黃酰氟 2） 去污劑2021年12月10日星期五44第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系樣品預(yù)分級(jí)的主要方法蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質(zhì)細(xì)胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等樣品預(yù)分級(jí)主要作用在于提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測(cè)靈敏度。2021年12月10日星期五45第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系分步提取法采用三種溶解性能不同的裂解液分步提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)組分，然后分別進(jìn)行雙向電泳分離。各步提取液：40mmol/L Tris-base；8m/L尿素、4%CHAPS、100mmol/L DTT、40mmol/L Tris-base、0.5 %的兩

18、性電解質(zhì)；5m/L尿素、 2mol/L硫脲、4%CHAPS、2%SB3-10、2mmol/L TBP、40mmol/L Tris-base、0.5 %的兩性電解質(zhì)。2021年12月10日星期五462021年12月10日星期五47第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系2、等電聚焦OOFarrellFarrell系統(tǒng)：系統(tǒng)：小分子載體兩性電解質(zhì)形成pH梯度。當(dāng)電壓加在載體兩性電解質(zhì)混合物間時(shí)，高pI的分子移向陰極，低pI的分子移向陽(yáng)極，形成一個(gè)連續(xù)的pH梯度。缺陷缺陷 梯度膠穩(wěn)定性差，電泳時(shí)易因電滲而出現(xiàn)陰性漂移2021年12月10日星期五48第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系固相pH梯度等電聚焦是80年

19、代建立起來(lái)的一種等電聚焦技術(shù)，其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙稀酰胺衍生物，它們于丙稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺有相似的聚合行為。固定化電解質(zhì)一端的雙鍵可以在聚合中共價(jià)結(jié)合到聚丙烯酰胺介質(zhì)中，其另一端的R集團(tuán)為弱酸或弱堿，可在聚合物中形成弱酸或弱堿的緩沖體系，利用緩沖體系滴定終點(diǎn)附近一段pH范圍就可行成近似線性的pH梯度，所以固相pH梯度在凝膠聚合時(shí)形成而不隨環(huán)境電場(chǎng)條件的改變而改變，固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達(dá)到0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一。2021年12月10日星期五492021年12月10日星期五50第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)

20、研究的技術(shù)體系IPG優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等缺點(diǎn)。穩(wěn)定的可以隨意精確設(shè)定的pH梯度。 尤其可在較窄的pH范圍內(nèi)進(jìn)行第二輪分析，大大提高了分辨率及重復(fù)性。重現(xiàn)性好上樣量大 2021年12月10日星期五51第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系3.聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）第二相的分子量分離：制膠；IPG膠在SDS平衡液中還原和烷基化；第一向膠成分移至第二向膠上；電泳；蛋白檢測(cè)2021年12月10日星期五52第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系IPG膠在SDS平衡液中還原和烷基化平衡液：使膠條上的蛋白質(zhì)變性，破環(huán)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及亞基間相互作用SDS: 陰離子去污劑，1mmol/L

21、,結(jié)合使蛋白帶負(fù)電荷過(guò)量，在電場(chǎng)作用下，遷移速率主要有分子量決定尿素、還原劑（DTT）、烷化劑（IAA）2021年12月10日星期五53第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系第一向膠成分移至第二向膠上最關(guān)鍵步驟注意事項(xiàng)：第一向膠和第二向膠接觸好：避免引入氣泡，封膠均勻：避免二向電泳時(shí)膠條的移動(dòng)SDS-PAGE電泳2021年12月10日星期五542021年12月10日星期五552021年12月10日星期五562021年12月10日星期五57Ettan Dalt twelve電泳系統(tǒng)電泳系統(tǒng)2021年12月10日星期五58Ettan Dalt six電泳系統(tǒng)電泳系統(tǒng)2021年12月10日星期五59202

22、1年12月10日星期五602021年12月10日星期五61可能原因：樣品含高豐度可能原因：樣品含高豐度Pr可能原因：可能原因：TCA殘留致使殘留致使Pr丟失丟失2021年12月10日星期五62可能原因：可能原因：Tris質(zhì)量不好質(zhì)量不好可能原因：可能原因：Urea 不純不純2021年12月10日星期五63第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系蛋白檢測(cè)檢測(cè)某種蛋白是否存在用Western blotting進(jìn)行分析；顯示蛋白質(zhì)全譜時(shí)多用銀染色法檢測(cè)，或用靈敏度較高的熒光標(biāo)記與同位素標(biāo)記檢測(cè)；當(dāng)雙向電泳蛋白分離后緊跟質(zhì)譜鑒定時(shí)，多用考馬斯亮蘭R-250、Cu染或Zn-咪唑負(fù)性染色法。2021年12月10日

23、星期五64第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系圖像分析系統(tǒng)圖像采集硬件和圖像分析軟件Melanie 3、PDQuest 6.0、Imagemaster 2D Elit3.10等2021年12月10日星期五65Image Scanner2021年12月10日星期五66 全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)（Ettan Spot Picker） 2021年12月10日星期五67第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系新型非凝膠分離技術(shù)液相色譜法液相色譜法liquid chromatographyliquid chromatography，LCLC毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳capillary electrophoresiscapill

24、ary electrophoresis，CECE2021年12月10日星期五68第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系生物質(zhì)譜與蛋白質(zhì)鑒定2021年12月10日星期五69第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系蛋白質(zhì)的鑒定方法主要利用蛋白質(zhì)的各種屬性參數(shù)，如分子量、等電點(diǎn)、序列、氨基酸組成和肽質(zhì)量指紋譜等，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，尋找與這些參數(shù)相符的蛋白質(zhì)。如果在數(shù)據(jù)庫(kù)中找不到，有可能是發(fā)現(xiàn)了新蛋白，進(jìn)一步要進(jìn)行序列分析，合成探針，分離相應(yīng)基因來(lái)表達(dá)，進(jìn)一步鑒定這一蛋白質(zhì)生物質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組鑒定中起非常重要的作用2021年12月10日星期五70第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系質(zhì)譜儀的發(fā)展簡(jiǎn)史質(zhì)譜儀的發(fā)展簡(jiǎn)史

25、 19121912年：年： 世界第一臺(tái)質(zhì)譜裝置世界第一臺(tái)質(zhì)譜裝置 19401940年代年代: : 質(zhì)譜儀用于質(zhì)譜儀用于同位素同位素測(cè)定測(cè)定 19501950年代：年代：MSMS商品化廣泛用于商品化廣泛用于有機(jī)物有機(jī)物結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)分析 19601960年代：研究年代：研究GC-MSGC-MS聯(lián)用技術(shù)聯(lián)用技術(shù) 19801980年代：研究年代：研究LC-MSLC-MS聯(lián)用技術(shù)聯(lián)用技術(shù) 19901990年代：年代：生物分析生物分析的需要，新的離子的需要，新的離子化方法化方法2021年12月10日星期五71第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系生物質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜分析法是通過(guò)測(cè)定樣品離子的質(zhì)量與電荷比值-質(zhì)荷比(

26、mass/charge， m/z)來(lái)進(jìn)行未知化合物的成分和結(jié)構(gòu)分析的分析方法。質(zhì)譜分析所獲得的結(jié)果即質(zhì)譜分析所獲得的結(jié)果即離子的相對(duì)含離子的相對(duì)含量量與與質(zhì)荷比質(zhì)荷比之間的關(guān)系圖就稱(chēng)為之間的關(guān)系圖就稱(chēng)為質(zhì)譜圖質(zhì)譜圖（亦稱(chēng)質(zhì)譜）（亦稱(chēng)質(zhì)譜）2021年12月10日星期五722021年12月10日星期五73第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系質(zhì)譜法的特點(diǎn)1、信息量大，應(yīng)用范圍廣，是研究有機(jī)化學(xué)和結(jié)構(gòu)的有力工具。2、由于分子離子峰可以提供樣品分子的相對(duì)分子量的信息，所以質(zhì)譜法也是測(cè)定分子量的常用方法。3、分析速度快、靈敏度高、高分辨率的質(zhì)譜儀可以提供分子或離子的精密測(cè)定。4、質(zhì)譜儀器較為精密，價(jià)格較貴，工

27、作環(huán)境要求較高，給普及帶來(lái)一定的限制。2021年12月10日星期五74第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系質(zhì)譜能夠提供的信息：質(zhì)譜能夠提供的信息： 相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量低分辨質(zhì)譜就可以確定相對(duì)分子質(zhì)量，高分辨質(zhì)譜可精確到0.0001； 分子式分子式( (樣品的元素組成樣品的元素組成) )用同位素豐度比法（低分辨法）或高分辨質(zhì)譜儀測(cè)得的準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量,均可以確定分子式；2021年12月10日星期五75第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系 鑒定某些官能團(tuán)鑒定某些官能團(tuán)如甲基(m/z 15)、羰基(m/z 28)、甲氧基(m/z 31)、乙酰基(m/z 43) 分子結(jié)構(gòu)信息分子結(jié)構(gòu)信息由分子結(jié)構(gòu)與裂解

28、方式的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律,根據(jù)碎片離子的m/z及相對(duì)豐度RA提供分子結(jié)構(gòu)信息； 人機(jī)問(wèn)答，給出可能的化合物。人機(jī)問(wèn)答，給出可能的化合物。 2021年12月10日星期五762021年12月10日星期五77SourceHexapolePre-filterQ1Mass FilterDetector+/- ionsQ3Mass FilterQ2 semi-circularCollision Cell250 l/sTurboInterlock2021年12月10日星期五78進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測(cè)器1.氣體擴(kuò)散2.直接進(jìn)樣3.氣相色譜1.電子轟擊2.化學(xué)電離3.場(chǎng)致電離4.激光 1.單聚焦 2.雙聚焦 3.飛

29、行時(shí)間4.四極桿 質(zhì)譜分析原理2021年12月10日星期五79第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系離子源離子源的作用是將欲分析樣品電離，得到帶有樣品信息的離子。質(zhì)譜儀的離子源種類(lèi)很多:2021年12月10日星期五80第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系1、電子電離源、電子電離源(Electron Ionization ，EI)2、化學(xué)電離源、化學(xué)電離源(Chemical Ionization , CI )。3、快原子轟擊源（、快原子轟擊源（Fast Atomic bombardment, FAB）4電噴霧源電噴霧源(Electron spray Ionization，ESI)5大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化

30、學(xué)電離源(Atmospheric pressure chemical Ionization, APCI)2021年12月10日星期五81第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系質(zhì)譜儀的分類(lèi)質(zhì)譜儀的分類(lèi)按按用途用途分：分：有機(jī)質(zhì)譜有機(jī)質(zhì)譜；無(wú)機(jī)質(zhì)譜；同位；無(wú)機(jī)質(zhì)譜；同位素質(zhì)譜素質(zhì)譜按按原理原理分：?jiǎn)尉劢官|(zhì)譜；雙聚焦質(zhì)譜；分：?jiǎn)尉劢官|(zhì)譜；雙聚焦質(zhì)譜；四極質(zhì)譜四極質(zhì)譜；飛行時(shí)間質(zhì)譜；回旋共振質(zhì)；飛行時(shí)間質(zhì)譜；回旋共振質(zhì)譜譜按按聯(lián)用聯(lián)用方式分：氣質(zhì)聯(lián)用；液質(zhì)聯(lián)用；方式分：氣質(zhì)聯(lián)用；液質(zhì)聯(lián)用；質(zhì)質(zhì)聯(lián)用質(zhì)質(zhì)聯(lián)用2021年12月10日星期五82第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系質(zhì)譜分析法原理質(zhì)譜分析法原理 將樣品轉(zhuǎn)化

31、為將樣品轉(zhuǎn)化為運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)的的帶電氣態(tài)離帶電氣態(tài)離子碎片子碎片，然后按，然后按質(zhì)荷比質(zhì)荷比(m/z)(m/z)大小大小分分離并記錄的分析方法離并記錄的分析方法 2021年12月10日星期五83第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系儀器組成儀器組成按質(zhì)量分析器按質(zhì)量分析器 ( ( 或者磁場(chǎng)種類(lèi)或者磁場(chǎng)種類(lèi) ) ) 可分可分為為靜態(tài)儀器和動(dòng)態(tài)儀器靜態(tài)儀器和動(dòng)態(tài)儀器，即，即穩(wěn)定電穩(wěn)定電磁場(chǎng)磁場(chǎng)( (單聚焦及雙聚焦質(zhì)譜儀單聚焦及雙聚焦質(zhì)譜儀) )和和變化變化電磁場(chǎng)電磁場(chǎng)( (飛行時(shí)間和四極桿質(zhì)譜儀飛行時(shí)間和四極桿質(zhì)譜儀) ) MSMS儀器一般由儀器一般由真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)、進(jìn)樣系進(jìn)樣系統(tǒng)統(tǒng)、電離源電離源、質(zhì)量分析

32、器質(zhì)量分析器和和檢測(cè)系檢測(cè)系統(tǒng)統(tǒng)構(gòu)成構(gòu)成2021年12月10日星期五84第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系1. 1.真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)質(zhì)譜儀中質(zhì)譜儀中所有部分所有部分均要處高度真空的條件下均要處高度真空的條件下( (10-4-10-6Pa10-4-10-6Pa), ), 其作用是其作用是減少離子碰撞損失減少離子碰撞損失。真空度過(guò)低，將會(huì)引起：。真空度過(guò)低，將會(huì)引起：a)a)大量氧會(huì)大量氧會(huì)燒壞離子源燈絲燒壞離子源燈絲b)b)引起引起其它分子離子反應(yīng)其它分子離子反應(yīng)，使質(zhì)譜圖復(fù)雜化，使質(zhì)譜圖復(fù)雜化c) c)干擾干擾離子源正常調(diào)節(jié)離子源正常調(diào)節(jié)d)d)用作加速離子的幾千伏高壓會(huì)引起用作加速離子的幾千伏

33、高壓會(huì)引起放電放電2021年12月10日星期五85第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系一般質(zhì)譜儀都采用一般質(zhì)譜儀都采用機(jī)械泵機(jī)械泵預(yù)抽空后預(yù)抽空后，再用高效率，再用高效率擴(kuò)散泵擴(kuò)散泵連續(xù)地運(yùn)行以連續(xù)地運(yùn)行以保持真空。現(xiàn)代質(zhì)譜儀采用保持真空?，F(xiàn)代質(zhì)譜儀采用分子泵分子泵可獲得更高的真空度可獲得更高的真空度2021年12月10日星期五86第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)對(duì)進(jìn)樣系統(tǒng)的要求：對(duì)進(jìn)樣系統(tǒng)的要求：重復(fù)性、不引起真重復(fù)性、不引起真空度降低空度降低 （1 1）間接進(jìn)樣）間接進(jìn)樣 適于適于氣體、沸點(diǎn)低且易揮發(fā)的液體、氣體、沸點(diǎn)低且易揮發(fā)的液體、中等蒸汽壓固體中等蒸汽壓固體。注入樣品。注

34、入樣品(10-100g)(10-100g)貯樣器貯樣器(1-3L)(1-3L)抽真空抽真空(1Pa)(1Pa)并加熱到并加熱到150015000C C樣品蒸汽分子樣品蒸汽分子( (壓力梯度壓力梯度) )漏隙漏隙高真空離子源高真空離子源2021年12月10日星期五872021年12月10日星期五88第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系（2 2）直接探針進(jìn)樣）直接探針進(jìn)樣適于適于高沸點(diǎn)液體及固體高沸點(diǎn)液體及固體樣品樣品 探針桿探針桿通常是一根規(guī)格為通常是一根規(guī)格為25cm25cm6mmi.d.,6mmi.d.,前前端有一容納樣品的端有一容納樣品的陶瓷小凹槽陶瓷小凹槽，當(dāng)探針插入或，當(dāng)探針插入或拉出時(shí)，

35、斜置的拉出時(shí)，斜置的封閉閥封閉閥就可將真空體系與外界就可將真空體系與外界大氣隔絕，大氣隔絕，通電發(fā)熱通電發(fā)熱，使樣品蒸發(fā)，對(duì)熱穩(wěn)定，使樣品蒸發(fā)，對(duì)熱穩(wěn)定的有機(jī)化合物一般可加熱到的有機(jī)化合物一般可加熱到200200300030000C C而不而不分解，通?？煞治龇纸猓ǔ？煞治龇菢O性分子非極性分子的分子量可達(dá)的分子量可達(dá)1000u1000u，中等極性分子量達(dá)中等極性分子量達(dá)300u300u2021年12月10日星期五892021年12月10日星期五90第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1) 1)引入引入樣品量小樣品量小， 樣品樣品蒸汽壓可以很低蒸汽壓可以很低2)2)可以分析可以分析復(fù)雜

36、有機(jī)物復(fù)雜有機(jī)物3)3)應(yīng)用更廣泛應(yīng)用更廣泛2021年12月10日星期五91第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系（3）色譜進(jìn)樣：）色譜進(jìn)樣：利用利用氣相氣相和和液相液相色色譜的分離能力，進(jìn)行多組份復(fù)雜混譜的分離能力，進(jìn)行多組份復(fù)雜混合物分析合物分析2021年12月10日星期五92第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系3 3 電離源電離源( (室室) ) 將引入的樣品轉(zhuǎn)化為將引入的樣品轉(zhuǎn)化為正離子，并使正離子，并使之加速，聚焦為離子束之加速，聚焦為離子束的裝置。的裝置。由于由于離子化所需要的能量隨分子不同差異離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對(duì)于很大，因此，對(duì)于不同的分子不同的分子應(yīng)選擇應(yīng)選擇不

37、同的離解方法不同的離解方法2021年12月10日星期五93第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系根據(jù)樣品根據(jù)樣品離子化方式離子化方式和和電離源能量電離源能量高低，通常高低，通?？蓪㈦婋x源分為：可將電離源分為：氣相源氣相源：先：先蒸發(fā)蒸發(fā)再再激發(fā)激發(fā)，適于，適于沸點(diǎn)低于沸點(diǎn)低于500500o oC C、對(duì)熱穩(wěn)定對(duì)熱穩(wěn)定的樣品的離子化，包括的樣品的離子化，包括電子轟擊源電子轟擊源、化學(xué)電離源、場(chǎng)電離源、火花源、化學(xué)電離源、場(chǎng)電離源、火花源解吸源解吸源：固態(tài)或液態(tài)樣品：固態(tài)或液態(tài)樣品不需要揮發(fā)而直接被不需要揮發(fā)而直接被轉(zhuǎn)化為氣相轉(zhuǎn)化為氣相，適用于分子量高達(dá)，適用于分子量高達(dá)10105 5的的非揮發(fā)性非揮發(fā)

38、性或或熱不穩(wěn)定性熱不穩(wěn)定性樣品的離子化。包括樣品的離子化。包括場(chǎng)解吸源、場(chǎng)解吸源、快原子轟擊源、激光解吸源、離子噴霧源和大快原子轟擊源、激光解吸源、離子噴霧源和大氣壓化學(xué)（熱噴霧）電離源氣壓化學(xué)（熱噴霧）電離源 等等2021年12月10日星期五94第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系硬源：硬源：離子化能量高離子化能量高，伴有，伴有化學(xué)鍵的斷化學(xué)鍵的斷裂裂，譜圖復(fù)雜，可得到，譜圖復(fù)雜，可得到分子官能團(tuán)分子官能團(tuán)的信的信息，如息，如電子轟擊，快原子轟擊電子轟擊，快原子轟擊軟源：軟源：離子化能量低離子化能量低，產(chǎn)生的，產(chǎn)生的碎片少碎片少，譜圖簡(jiǎn)單，可得到譜圖簡(jiǎn)單，可得到分子量分子量信息，如信息，如化學(xué)化

39、學(xué)電離源，場(chǎng)電離源，場(chǎng)解吸電離源，激電離源，場(chǎng)電離源，場(chǎng)解吸電離源，激光解吸電離源，電噴霧電離源，大氣壓光解吸電離源，電噴霧電離源，大氣壓化學(xué)（熱噴霧）電離源化學(xué)（熱噴霧）電離源 2021年12月10日星期五95第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系（1 1）電子轟擊源）電子轟擊源 （EIEI） 電子轟擊法是通用的電子轟擊法是通用的電離法電離法，是，是使用使用高能電子束高能電子束從試樣分子中撞出從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子正離子，即，即 M + e M + e M+2e M+2e 式中式中MM為待測(cè)分子，為待測(cè)分子，M+M+為分子離為分子離子或母體離子子或母體離子2021年12

40、月10日星期五96第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系水平方向水平方向：加熱燈絲與陽(yáng)極間：加熱燈絲與陽(yáng)極間( (加直加直流電壓流電壓70V) 70V) 高能電子束高能電子束沖擊樣沖擊樣品品正離子正離子垂直方向垂直方向：G3-G4G3-G4加速電極加速電極( (低電壓低電壓)- )- - 較小動(dòng)能較小動(dòng)能 -狹縫準(zhǔn)直狹縫準(zhǔn)直G4-G5G4-G5加加速電極速電極( (高電壓高電壓)- )- 較高動(dòng)能較高動(dòng)能 - - 狹縫狹縫進(jìn)一步準(zhǔn)直進(jìn)一步準(zhǔn)直 - - 離子進(jìn)入質(zhì)量分析器離子進(jìn)入質(zhì)量分析器2021年12月10日星期五972021年12月10日星期五98第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系EI特點(diǎn)1 使用最

41、廣泛，譜庫(kù)最完整2 電離效率高3 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便4 分子離子峰很弱或不出現(xiàn)：因?yàn)殡娮幽芰扛哌_(dá)70 eV，而大多數(shù)有機(jī)化合物的電離電位約為7-10 eV，因此除生成分子離子外，還要進(jìn)一步斷裂成碎片離子，約有10-20%的有機(jī)化合物（相對(duì)質(zhì)量較大，極性大，難氣化，熱穩(wěn)定性差的化合物）電離時(shí)缺少分子離子峰2021年12月10日星期五99第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系（2）化學(xué)電離源 (CI)原理：高能量的電子轟擊反應(yīng)氣體使之電離，電離后的反應(yīng)分子再與試樣分子碰撞發(fā)生分子離子反應(yīng)形成準(zhǔn)分子離子和少數(shù)碎片離子 作用過(guò)程：樣品分子在承受電子轟擊前，被一種反應(yīng)氣(通常是甲烷)稀釋?zhuān)♂尡壤s為103:

42、1，因此樣品分子與電子的碰撞幾率極小，所生成的分子離子主要由反應(yīng)氣分子組成47412021年12月10日星期五100第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系進(jìn)入電離源的樣品分子R-CH3大部分與CH5+碰撞產(chǎn)生(M+1)+離子；小部分與C2H5+反應(yīng)，生成(M-1)+離子；極微小部分發(fā)生復(fù)合反應(yīng)：2021年12月10日星期五101 這樣就形成了一系列這樣就形成了一系列準(zhǔn)分子離子準(zhǔn)分子離子QMQM+ +而出現(xiàn)而出現(xiàn)(M+1)(M+1)+ +，(M-1)(M-1)+ +，(M+17)(M+17)+ +，(M+29)(M+29)+ +等質(zhì)譜峰等質(zhì)譜峰+54+2524 CH + MMH +CH C H +M

43、MH +C H 產(chǎn)生M + 1峰+542+2526 CH + M(MH) +CH +H C H +M (MH) +C H 產(chǎn)生M - 1峰+55+2525 CH + M(MCH ) C H +M (MC H )產(chǎn)生M + 17峰產(chǎn)生M + 29峰質(zhì)子化反應(yīng)質(zhì)子化反應(yīng)復(fù)合反應(yīng)復(fù)合反應(yīng)2021年12月10日星期五102第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系CICI特點(diǎn)：特點(diǎn)：1 1 準(zhǔn)分子離子峰即準(zhǔn)分子離子峰即(M+1)+(M+1)+峰很強(qiáng)，可提供相峰很強(qiáng)，可提供相對(duì)分子質(zhì)量這一重要信息，從而可以推斷出對(duì)分子質(zhì)量這一重要信息，從而可以推斷出相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量 2 2 碎片峰較少，譜圖簡(jiǎn)單碎片峰較少

44、，譜圖簡(jiǎn)單，因?yàn)殡婋x樣品分，因?yàn)殡婋x樣品分子的不是高能電子流，而是能量較低的子的不是高能電子流，而是能量較低的二次二次離子離子，鍵斷裂的可能性較小，峰的數(shù)目隨之，鍵斷裂的可能性較小，峰的數(shù)目隨之減少減少3 3 使用使用CICI時(shí)需要將試樣時(shí)需要將試樣氣化氣化后進(jìn)入離子源，后進(jìn)入離子源，因此不適用于因此不適用于難揮發(fā)，熱不穩(wěn)定或極性較大難揮發(fā)，熱不穩(wěn)定或極性較大的有機(jī)物分析的有機(jī)物分析2021年12月10日星期五103過(guò)程：強(qiáng)電場(chǎng)過(guò)程：強(qiáng)電場(chǎng)分子電子的分子電子的量子隧道效應(yīng)量子隧道效應(yīng)* * 分子分子熱分解或碰撞熱分解或碰撞帶正電荷的碎片離子帶正電荷的碎片離子陽(yáng)陽(yáng)極排斥出并加速進(jìn)入質(zhì)量分析器極排

45、斥出并加速進(jìn)入質(zhì)量分析器 r2.5m1mm第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系2021年12月10日星期五104第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系量子隧道效應(yīng)：量子隧道效應(yīng)： 就是依靠就是依靠強(qiáng)電場(chǎng)強(qiáng)電場(chǎng)(10(10-7-7-10-10-8-8VcmVcm-1 -1) )把尖端附近把尖端附近納米處的分子中的電子拉出來(lái)，或者說(shuō)納米處的分子中的電子拉出來(lái)，或者說(shuō)電子電子在強(qiáng)電場(chǎng)作用下要由陰極向陽(yáng)極移動(dòng)在強(qiáng)電場(chǎng)作用下要由陰極向陽(yáng)極移動(dòng)，從而，從而脫離樣品分子，形成正離子脫離樣品分子，形成正離子電極要求：電極要求： 電極為一尖銳的葉片或金屬絲（曲率半徑電極為一尖銳的葉片或金屬絲（曲率半徑2.5m2.5m），

46、其上長(zhǎng)滿），其上長(zhǎng)滿微針微針，故稱(chēng)，故稱(chēng)金屬胡須金屬胡須發(fā)射器。使用微碳針發(fā)射器。使用微碳針 ( (1m1m，WW絲上的苯絲上的苯基腈裂解生成基腈裂解生成) ) 構(gòu)成構(gòu)成多尖陳列電極多尖陳列電極可提高電可提高電離效率離效率 2021年12月10日星期五105第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系FIFI特點(diǎn)特點(diǎn)：場(chǎng)致電離源的能量約為：場(chǎng)致電離源的能量約為12eV12eV，因此，因此分子離子峰強(qiáng)度很大分子離子峰強(qiáng)度很大，也很，也很清楚，碎片峰較少也較弱，利于清楚，碎片峰較少也較弱，利于相相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定，缺乏分子結(jié)構(gòu)的測(cè)定，缺乏分子結(jié)構(gòu)信息信息2021年12月10日星期五106第二節(jié) 蛋白

47、質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系場(chǎng)解吸源 (FD)類(lèi)似于場(chǎng)電離源，它也有一個(gè)表面長(zhǎng)滿“ 胡須”(長(zhǎng)0.01mm)的陽(yáng)極發(fā)射器(Emitter) 過(guò)程：樣品溶液涂于發(fā)射器表面通電加熱蒸發(fā)除溶劑解吸樣品分子強(qiáng)電場(chǎng)分子電離奔向陰極引入質(zhì)量分析器 特點(diǎn)：特別適于非揮發(fā)性且分子量高的樣品，譜圖最為簡(jiǎn)單（解吸所需的能量遠(yuǎn)低于氣化所需的能量，所以有機(jī)化合物不會(huì)發(fā)生熱分解）；離子源的工作溫度略高于室溫，分子離子幾乎不具有過(guò)剩的能量，因此基本上不斷裂，分子離子峰的強(qiáng)度比FI強(qiáng)2021年12月10日星期五107第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系火花源 (Spark)針對(duì)金屬合金或離子殘?jiān)鼧悠返确菗]發(fā)性無(wú)機(jī)物的分析，類(lèi)似于AES

48、中的激發(fā)光源 過(guò)程： 30kV 脈沖電壓 - 火花 - 局部高熱 - 樣品元素蒸發(fā) - 原子或離子 - 經(jīng)加速進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行分離 特點(diǎn)：對(duì)于幾乎所有元素的靈敏度較高，可達(dá)10-9；可以對(duì)極復(fù)雜樣品進(jìn)行元素分析，信息比較簡(jiǎn)單，一般線性響應(yīng)范圍都比較寬，標(biāo)準(zhǔn)核準(zhǔn)比較容易。但由于儀器設(shè)備價(jià)格高昂，操作復(fù)雜，限制了使用范圍2021年12月10日星期五108第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系快原子轟擊快原子轟擊(FAB)(FAB)過(guò)程：過(guò)程：高速電子高速電子惰性氣體電離惰性氣體電離Ar+電電場(chǎng)加速場(chǎng)加速高能高能Ar+電荷交換室電荷交換室高能高能Ar原子原子撞擊涂有樣品的金屬板撞擊涂有樣品的金屬板能量轉(zhuǎn)

49、能量轉(zhuǎn)移給樣品分子移給樣品分子電離電離引入質(zhì)量分析器引入質(zhì)量分析器2021年12月10日星期五109第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系底物：實(shí)驗(yàn)時(shí)通常預(yù)先將試樣和底物調(diào)和并涂在金屬靶（常用銅靶）上。常用的底物有甘油、硫代甘油、三乙醇胺等，性能良好的底物應(yīng)是相對(duì)分子質(zhì)量小、沸點(diǎn)高、對(duì)試樣的質(zhì)譜干擾小等2021年12月10日星期五110第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系FAB特點(diǎn)：無(wú)需氣化，整個(gè)過(guò)程可在室溫下進(jìn)行，有較強(qiáng)的分子離子峰，適合于高極性，大相對(duì)分子質(zhì)量，低蒸氣壓，熱穩(wěn)定性差的試樣，試樣用量少并可回收2021年12月10日星期五111第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系電噴霧電離源（ESI)電噴霧

50、電離源主要應(yīng)用于LC-MS聯(lián)用，它是LC和MS之間的接口裝置，又是電離源 原理：主要部件是兩層套管組成的電噴霧噴嘴，內(nèi)層是LC流出物，外層是霧化氣（常用氮?dú)猓瑖娮焐霞与妷?，在霧化的同時(shí)，樣品電離，形成帶有高電荷微粒的霧，再使用N2氣簾阻擋中性的溶劑分子，只讓樣品離子在電壓梯度下進(jìn)入質(zhì)量分析器2021年12月10日星期五112第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系特點(diǎn)：適用于強(qiáng)極性，大分子量的樣品分析如肽，蛋白質(zhì)，糖等；產(chǎn)生的離子帶有多電荷；主要用于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀2021年12月10日星期五1132021年12月10日星期五114第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系大氣壓化學(xué)電離源（大氣壓化學(xué)電離源

51、（APCI)APCI)原理：原理：結(jié)構(gòu)和電噴霧電離源相似，不同結(jié)構(gòu)和電噴霧電離源相似，不同在于噴嘴下放在于噴嘴下放一針狀放電電極一針狀放電電極，通過(guò)它，通過(guò)它的的高壓放電高壓放電，使空氣中某些分子產(chǎn)生，使空氣中某些分子產(chǎn)生H3O+, N2+,O2+,O+H3O+, N2+,O2+,O+離子，這些離子，這些離子離子再再和和分析物分析物分子發(fā)生分子發(fā)生分子離子反應(yīng)分子離子反應(yīng)使它們使它們離子化，離子化，形成形成質(zhì)子轉(zhuǎn)移，加成物質(zhì)子轉(zhuǎn)移，加成物等等準(zhǔn)分準(zhǔn)分子離子子離子2021年12月10日星期五115特點(diǎn)：特點(diǎn)：APCIAPCI主要產(chǎn)生的是主要產(chǎn)生的是單電荷離子單電荷離子，所，所分析的化合物的分析的

52、化合物的相對(duì)分子量相對(duì)分子量通常小于通常小于100010002021年12月10日星期五116第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系激光解吸源（LD)原理：利用一定波長(zhǎng)的脈沖激光照射樣品，使樣品電離。被分析物質(zhì)放在涂有基質(zhì)的靶上，激光于極短時(shí)間照射，基質(zhì)吸收能量并且把能量傳給被分析物質(zhì)，和它們一起蒸發(fā)到氣相并使樣品分子電離2021年12月10日星期五117第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系特點(diǎn)：也稱(chēng)為基質(zhì)輔助激光解吸電離源（MALDI），屬于軟電離技術(shù)，特別適宜飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（TOF），激光電離源必須有合適基質(zhì)才能有好的離子產(chǎn)率，常用基質(zhì)有2，5二羥基苯甲酸，芥子酸，煙酸等，適宜分析生物大分子2021

53、年12月10日星期五118第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系4質(zhì)量分析器作用：將不同離子碎片按質(zhì)荷比 m/z 分開(kāi)，將相同m/z的離子聚集在一起，組成質(zhì)譜 質(zhì)量分析器類(lèi)型：磁分析器、飛行時(shí)間、四極桿、離子捕獲等2021年12月10日星期五119第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系磁分析器磁分析器原理：原理：主要部分是一對(duì)主要部分是一對(duì)電磁鐵電磁鐵( (常用扇形常用扇形), ),當(dāng)離子源中產(chǎn)生的當(dāng)離子源中產(chǎn)生的離子束離子束( (通常是正離通常是正離子束子束) )經(jīng)加速電場(chǎng)加速后經(jīng)加速電場(chǎng)加速后, ,以一定的速度進(jìn)以一定的速度進(jìn)入垂直于離子運(yùn)動(dòng)方向的入垂直于離子運(yùn)動(dòng)方向的均勻磁場(chǎng)均勻磁場(chǎng)時(shí)時(shí), ,正正離

54、子在離子在磁場(chǎng)施加的向心力磁場(chǎng)施加的向心力的作用下的作用下, ,改變改變運(yùn)動(dòng)方向運(yùn)動(dòng)方向( (磁場(chǎng)不改變離子的運(yùn)動(dòng)速度磁場(chǎng)不改變離子的運(yùn)動(dòng)速度) )作作圓周運(yùn)動(dòng)，圓周運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)軌道半徑與運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)軌道半徑與運(yùn)動(dòng)速度、磁場(chǎng)強(qiáng)度、離子的質(zhì)荷比有關(guān)磁場(chǎng)強(qiáng)度、離子的質(zhì)荷比有關(guān)2021年12月10日星期五1202021年12月10日星期五121第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系設(shè)離子的電荷為設(shè)離子的電荷為z,z,質(zhì)量為質(zhì)量為m,m,加速電場(chǎng)的電壓加速電場(chǎng)的電壓為為U,U,進(jìn)入磁場(chǎng)時(shí)的運(yùn)動(dòng)速度為進(jìn)入磁場(chǎng)時(shí)的運(yùn)動(dòng)速度為v v, ,則則 212zUmv如果磁場(chǎng)強(qiáng)度為如果磁場(chǎng)強(qiáng)度為H,H,運(yùn)動(dòng)軌道半徑為運(yùn)動(dòng)軌

55、道半徑為R,R,則由于離則由于離子作圓周運(yùn)動(dòng)的子作圓周運(yùn)動(dòng)的離心力等于磁場(chǎng)力離心力等于磁場(chǎng)力，因此：，因此： 2mvHzvR2021年12月10日星期五122第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系合并上述兩式，可得：合并上述兩式，可得：222mH RzU磁分析器質(zhì)譜方程式磁分析器質(zhì)譜方程式 通過(guò)連續(xù)改變通過(guò)連續(xù)改變H H、R R、U U這三個(gè)參數(shù)中的任這三個(gè)參數(shù)中的任一個(gè)并保持其余兩個(gè)不變的方法一個(gè)并保持其余兩個(gè)不變的方法, ,就可以使就可以使不不同質(zhì)荷比同質(zhì)荷比的離子的離子順序順序到達(dá)檢測(cè)器產(chǎn)生信號(hào)而到達(dá)檢測(cè)器產(chǎn)生信號(hào)而獲得質(zhì)譜圖獲得質(zhì)譜圖 2021年12月10日星期五123第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究

56、的技術(shù)體系(a)固定H和U，改變R，即通過(guò)移動(dòng)檢測(cè)器狹縫位置來(lái)收集不同R處的離子或以感光板照相技術(shù)記錄的不同m/z的離子得到色譜圖(b)現(xiàn)代質(zhì)譜儀通常是保持R不變，通過(guò)掃描電場(chǎng)U或磁場(chǎng)H，使不同m/z離子依次通過(guò)固定狹縫來(lái)獲得質(zhì)譜圖2021年12月10日星期五124第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系單聚焦質(zhì)量分析器原理：以一定發(fā)散角度和能量/速度的離子，進(jìn)入質(zhì)量分析器后，一方面會(huì)使離子束按質(zhì)荷比的大小分離（順序到達(dá)檢測(cè)器）；另一方面能量/速度相同的，角度不同的相同質(zhì)荷比離子，以相同的半徑（R=mv/zH）到達(dá)檢測(cè)器即重新會(huì)聚起來(lái)，成為方向聚焦；能量/速度不同的相同質(zhì)荷比離子則以不同的半徑到達(dá)檢測(cè)

57、器，無(wú)法聚焦2021年12月10日星期五125第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系特點(diǎn)：聚焦方向，無(wú)法聚焦能量，故其分辨率較低，一般為50002021年12月10日星期五126能量相同，方能量相同，方向不同的離子向不同的離子半徑相同半徑相同能量不同，方能量不同，方向不同的離子向不同的離子半徑不同半徑不同2021年12月10日星期五127第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系雙聚焦質(zhì)量分析器原理：為克服動(dòng)能或速度“分散”的問(wèn)題，即實(shí)現(xiàn)所謂的“速度聚焦”，在離子源和磁分析器之間加一靜電分析器，質(zhì)量相同能量不同的離子通過(guò)電場(chǎng)后會(huì)產(chǎn)生能量色散（不同能量以不同半徑運(yùn)動(dòng)），磁場(chǎng)對(duì)不同能量的離子也能產(chǎn)生能量色散，如果

58、能使電場(chǎng)和磁場(chǎng)對(duì)于能量產(chǎn)生的色散相互補(bǔ)償（大小相等，方向相反），就能實(shí)現(xiàn)能量聚焦2021年12月10日星期五128第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系磁場(chǎng)對(duì)離子的作用具有可逆性：由某一方向進(jìn)入磁場(chǎng)的質(zhì)量相同的離子，進(jìn)入磁場(chǎng)后，會(huì)以一定能量順序分開(kāi)；反之，從相反方向進(jìn)入磁場(chǎng)的以一定能量順序排列的質(zhì)量相同的離子，經(jīng)過(guò)磁場(chǎng)后會(huì)聚集在一起 2021年12月10日星期五1292021年12月10日星期五130第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系特點(diǎn)：一般商品化雙聚焦質(zhì)譜儀的分辨率可達(dá)150000，質(zhì)量測(cè)定準(zhǔn)確度可達(dá)0.03gg-1，即對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量為600的化合物可測(cè)至誤差上0.0002u2021年12月10

59、日星期五131第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系飛行時(shí)間分析器這種分析器的離子分離是非磁方式達(dá)到的，因?yàn)閺碾x子源飛出的離子動(dòng)能基本一致，在飛出離子源后進(jìn)入一長(zhǎng)約1m的無(wú)場(chǎng)漂移管，在離子加速后的速度為：mzUvzUmv2222021年12月10日星期五132第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系此離子達(dá)到無(wú)場(chǎng)漂移管另一端的時(shí)間為：t = L/ 故對(duì)于具有不同m/z的離子，到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間不一樣：由此可見(jiàn)，由此可見(jiàn)， t t 取決于取決于m/zm/z的平方根之差的平方根之差2021年12月10日星期五133第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系因?yàn)檫B續(xù)電離和加速將導(dǎo)致檢測(cè)器的連續(xù)輸出而無(wú)法獲得有用信息（因?yàn)榘磿r(shí)間

60、分離），所以TOF是以大約10KHz的頻率進(jìn)行電子脈沖轟擊法產(chǎn)生正離子，隨即用一具有相同頻率的脈沖加速電場(chǎng)加速，被加速的粒子按不同的（m/z）1/2的時(shí)間經(jīng)漂移管到達(dá)收集極上，并饋入一個(gè)水平掃描與電場(chǎng)脈沖頻率一致的示波器上，從而得到質(zhì)譜圖2021年12月10日星期五1342021年12月10日星期五135第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系特點(diǎn)： A)儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,操作容易,不需要磁場(chǎng)、電場(chǎng)等 B)無(wú)聚焦狹縫，靈敏度很高 C)可用于大分子的分析（幾十萬(wàn)原子量單位） D)掃描速度快(1000幅/s)，可用于研究快速反應(yīng)或與GC聯(lián)用 E)分辨率比磁分析器稍差，受飛行距離的限制2021年12月10日星期