蛋白質(zhì)分離、純化

1、會計學(xué)1蛋白質(zhì)分離、純化蛋白質(zhì)分離、純化一、鹽析一、鹽析鹽析鹽析：蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會沉淀析出。：蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會沉淀析出。 常用常用硫酸銨硫酸銨進行沉淀。進行沉淀。分級沉淀分級沉淀：通過調(diào)節(jié)硫酸銨的濃度可以使不同的蛋：通過調(diào)節(jié)硫酸銨的濃度可以使不同的蛋 白質(zhì)分階段沉淀下來。白質(zhì)分階段沉淀下來。優(yōu)點優(yōu)點：價格便宜、蛋白質(zhì)沉淀完全、溶解過程發(fā)熱少等。：價格便宜、蛋白質(zhì)沉淀完全、溶解過程發(fā)熱少等。不足不足：沉淀后蛋白質(zhì)中含有大量硫酸銨，對后續(xù)純化過程：沉淀后蛋白質(zhì)中含有大量硫酸銨，對后續(xù)純化過程 產(chǎn)生不良影響。產(chǎn)生不良影響。v二、有機溶劑分級沉淀二、有機溶劑分級沉淀有機溶劑如有

2、機溶劑如甲醇、乙醇、丙酮甲醇、乙醇、丙酮等（保持低等（保持低溫），能溫），能破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。的溶解度降低而沉淀。優(yōu)點優(yōu)點：蛋白質(zhì)沉淀不用脫鹽、有機溶劑去除容易。：蛋白質(zhì)沉淀不用脫鹽、有機溶劑去除容易。缺點缺點：容易引起蛋白質(zhì)分子的變性，實驗過程嚴格：容易引起蛋白質(zhì)分子的變性，實驗過程嚴格低溫。低溫。三、超速離心法三、超速離心法在強大的離心力的作用下，溶液中在強大的離心力的作用下，溶液中的不溶解的顆粒狀物質(zhì)會沉淀析出的不溶解的顆粒狀物質(zhì)會沉淀析出，從而使溶液和沉淀物質(zhì)分開。，從而使溶液和沉淀物質(zhì)分開。Protein的等電點（的等電點（P

3、I） 1、定義：使蛋白質(zhì)分子所帶正電荷與負電荷相等，即凈電、定義：使蛋白質(zhì)分子所帶正電荷與負電荷相等，即凈電荷為零時的溶液的荷為零時的溶液的pH值稱為值稱為PI(isoelectric point). 2、當、當pH值值 PI 時，蛋白質(zhì)帶負電荷時，蛋白質(zhì)帶負電荷 當當pH值值PI 時，蛋白質(zhì)帶正電荷時，蛋白質(zhì)帶正電荷 當當pH值值=PI 時，蛋白質(zhì)帶凈電荷為零時，蛋白質(zhì)帶凈電荷為零電泳分離電泳分離正極移動正極移動負極移動負極移動不移動不移動五五 透透 析析按照分子大按照分子大小進行分離小進行分離.分離取決于分離取決于透析袋截留透析袋截留的分子量。的分子量。透析液透析液濃縮的蛋白濃縮的蛋白混合

4、樣品混合樣品 透析袋透析袋 開始透析開始透析處于平衡狀態(tài)處于平衡狀態(tài)五、透五、透 析析加加壓壓蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)溶液半透膜半透膜支持膜的柵板支持膜的柵板超濾液超濾液帶網(wǎng)孔的帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子進入小分子進入葡聚糖珠內(nèi)葡聚糖珠內(nèi)大分子不大分子不能進入珠能進入珠內(nèi)，經(jīng)珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙之間縫隙流出流出凝膠過濾層析過程示意圖凝膠過濾層析過程示意圖溶脹：溶脹：稱取適量凝膠干粉，用約稱取適量凝膠干粉，用約1010倍蒸餾水浸泡倍蒸餾水浸泡2424小時以上，待凝膠充分溶脹后，傾去上層小時以上，待凝膠充分溶脹后，傾去上層懸浮物及蒸餾水。懸浮物及蒸餾水。堿洗：堿洗：用用0.5 M NaOH 0.5 M

5、NaOH 溶液浸泡半個小時，然后溶液浸泡半個小時，然后用蒸餾水洗至中性。用蒸餾水洗至中性。酸洗：酸洗：用用0.5 M HCl 0.5 M HCl 溶液浸泡半個小時，然后用溶液浸泡半個小時，然后用蒸餾水洗至中性。蒸餾水洗至中性。平衡：平衡：用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液pHpH與與起始緩沖液相同。起始緩沖液相同。1. 1. 將層析柱垂直固定，加入適將層析柱垂直固定，加入適量溶劑排走空氣。量溶劑排走空氣。2. 2. 將平衡好的凝膠攪勻，連續(xù)將平衡好的凝膠攪勻，連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至傾入柱中，待其自然沉降至1/41/31/41/3高時打開下端出口，高時打開下端

6、出口，讓溶劑慢慢流出，繼續(xù)侵入讓溶劑慢慢流出，繼續(xù)侵入凝膠至沉降到所需高度。裝凝膠至沉降到所需高度。裝柱時要注意操作壓。柱時要注意操作壓。3. 3. 用用3-53-5倍柱床體積的起始緩沖倍柱床體積的起始緩沖液走柱，使交換劑充分平衡液走柱，使交換劑充分平衡，柱床穩(wěn)定。，柱床穩(wěn)定。 裝裝 柱柱1. 1. 如圖裝好層析裝置，打開下端出如圖裝好層析裝置，打開下端出口，使溶液流出至剛好達到凝膠膠口，使溶液流出至剛好達到凝膠膠面面2. 2. 沿柱壁緩慢加入沿柱壁緩慢加入2ml2ml樣品，打開下樣品，打開下端出口，使樣品溶液流出至剛好達端出口，使樣品溶液流出至剛好達到凝膠膠面，再取少量起始緩沖液到凝膠膠面，

7、再取少量起始緩沖液洗滌柱壁。洗滌柱壁。3. 3. 打開起始緩沖液閥門，連續(xù)洗脫打開起始緩沖液閥門，連續(xù)洗脫。4. 4. 用自動部分收集器自動或手動收用自動部分收集器自動或手動收集，合并同一高峰各管。集，合并同一高峰各管。蛋白質(zhì)是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白質(zhì)也存在等電點（也存在等電點（pIpI），蛋白質(zhì)在溶液中帶電狀況同），蛋白質(zhì)在溶液中帶電狀況同氨基酸相同，取決于所處溶液的氨基酸相同，取決于所處溶液的pH pH 值。值。當當pI pHpI pHpI pH時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。注意注意：陽離子交換劑本身帶負電荷，陰離子交換

8、劑本身帶正電荷。：陽離子交換劑本身帶負電荷，陰離子交換劑本身帶正電荷。陽陽離離子子交交換換層層析析過過程程離子交離子交換樹脂換樹脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)低離子低離子強度洗強度洗脫液洗脫液洗高離子高離子強度洗強度洗脫液洗脫液洗加加樣樣平平衡衡液液洗洗收集收集含配體溶液含配體溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未結(jié)合的蛋白洗下未結(jié)合的蛋白混合蛋白樣品混合蛋白樣品平衡液平衡液帶有配體的樹脂帶有配體的樹脂珠（或膠粒）珠（或膠粒）分子量范圍分子量范圍 適用的凝膠濃度適用的凝膠濃度/(%)/(%) 10104 4 20-30 20-30 1-4 1-410104 4 15-20 15-20 1-5 1-510104

9、4-1-110105 5 10-15 10-15 1 110105 5 5-10 5-10 5 510105 5 2-5 2-5分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān) 聚丙烯酰胺凝膠的制備聚丙烯酰胺凝膠的制備 蛋白質(zhì)樣品準備蛋白質(zhì)樣品準備 點樣點樣 電泳電泳 染色與脫色染色與脫色 樣品回收樣品回收 在蛋白質(zhì)工程的相關(guān)研究中，不僅需要經(jīng)常測定蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)工程的相關(guān)研究中，不僅需要經(jīng)常測定蛋白質(zhì)含量，而且要對目標蛋白質(zhì)進行鑒定。含量，而且要對目標蛋白質(zhì)進行鑒定。豌豆肌動蛋白異型體豌豆肌動蛋白異型體I I圓二色譜圓二色譜 蛋白質(zhì)免疫印跡裝置蛋白質(zhì)免疫印跡裝置上面為三明治結(jié)構(gòu)側(cè)面觀，下面為三明治結(jié)構(gòu)頂面觀上面為三明治結(jié)構(gòu)側(cè)