腫瘤壞死因子α

1、腫瘤壞死因子摘 要 惡性腫瘤疾病目前仍是全世界需要共同面對(duì)的一個(gè)醫(yī)學(xué)難題，其發(fā)病隱匿，早期容易被忽視，而臨床患者多數(shù)已到中晚期，此時(shí)的疾病已很難治療。腫瘤壞死因子是一種能使腫瘤出血，并能抑制、 殺傷體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的蛋白類(lèi)物質(zhì)，1984年TNF基因的克隆開(kāi)辟了臨床試驗(yàn)的時(shí)代，是第一個(gè)用于腫瘤生物療法的細(xì)胞因子，但因其缺少靶向性且有嚴(yán)重的副作用，對(duì)該基因的研究與應(yīng)用形成了很大的障礙，目前很多研究人員正致力于該基因改造與應(yīng)用。關(guān)鍵詞 TNF、腫瘤1 TNF的生物學(xué)特征TNF按其結(jié)構(gòu)可以分為兩種：TNF與TNF。TNF是一種單核因子，主要由活化的單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，TNF是一種淋巴因子，由活化

2、的T細(xì)胞與NK細(xì)胞產(chǎn)生，目前研究多為T(mén)NF。人的TNF位于第6號(hào)染色體短臂上，與MHC緊密連鎖1，人的TNF基因大小為2.76kb，由4個(gè)外顯子與3個(gè)內(nèi)含子組成。TNF的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有多種形成，有二聚體、三聚體、五聚體，其中有生物活性的是三聚體。TNF位于TNF的5端，同樣由4個(gè)外顯子與3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，其中第4個(gè)外顯子與TNF高度同源，編碼80%-90%的成熟蛋白質(zhì)。2 TNF的來(lái)源與表達(dá)TNF在人體內(nèi)的來(lái)源途徑有很多，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等都可以在一定的條件下產(chǎn)生與釋放TNF。目前認(rèn)為T(mén)NF主要的生物合成場(chǎng)所有心、肝、肺、腎2。各種外來(lái)刺激如內(nèi)毒素脂多糖(LPS)、腸毒素

3、、霉菌抗原、某些寄生蟲(chóng)的溶解物、病毒顆粒等，均可以引起TNF的表達(dá)與釋放。在正常情況下，TNF只由心肌間質(zhì)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在某些病理狀態(tài)下，如感染或內(nèi)毒素的刺激下，心臟可以產(chǎn)生TNF，Giroir3等研究證實(shí)這一點(diǎn)，在這些應(yīng)激狀態(tài)下，成熟的心肌細(xì)胞同樣可以產(chǎn)生TNFmRNA及其蛋白質(zhì)，且產(chǎn)生的量同巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的差不多。Kleine等4證實(shí)，在生理狀態(tài)下，腦內(nèi)在結(jié)構(gòu)與功能方面與巨噬細(xì)胞相似的細(xì)胞如神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均可合成分泌TNF、IL-6等細(xì)胞因子。在炎癥情況下，這些細(xì)胞因子的水平明顯升高，且對(duì)中性粒細(xì)胞有明顯趨化作用5。有研究表明，有大約20%的惡性腫瘤的發(fā)生與慢性炎癥有關(guān)6

4、。3 TNF受體通過(guò)對(duì)TNF分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究表明，C-末端在TNF的生物學(xué)活性中起決定性作用。由于C-末端參與TNF高級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)成，只要切掉1個(gè)氨基酸就可使TNF喪失生物學(xué)活性。而N-末端的變化范圍較大，適當(dāng)改變其長(zhǎng)度并不影響其生物學(xué)活性，N-末端還與TNF對(duì)受體的結(jié)合能力密切相關(guān)，可能為與受體結(jié)合的部位。TNF生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮，有賴(lài)于其與靶細(xì)胞上的TNFR相結(jié)合，并通過(guò)受體后效應(yīng)將信號(hào)傳至胞核。TNFR存在于多種細(xì)胞表面，腫瘤細(xì)胞表面同樣也存在TNFR7，不同細(xì)胞表面上受體的數(shù)目以及親與力都有所不同，且這些差異不呈平行關(guān)系。TNF受體可分為2種，即TNFR與TNFR，兩類(lèi)TNFR均為糖蛋白

5、，兩類(lèi)受體胞外區(qū)域氨基酸序列相似度很高，但胞內(nèi)區(qū)域則完全不同。由于各種細(xì)胞表達(dá)TNFR存在差異，使得TNF對(duì)各種細(xì)胞的作用不同，一般來(lái)說(shuō)，受體數(shù)目越高越容易受到TNF的損傷。TNFR還存在2種可溶性形式，為從細(xì)胞膜上通過(guò)蛋白酶水解下來(lái)的受體片段。它們通過(guò)與TNF結(jié)合而影響TNFR與TNF的功能及其含量變化，且影響效果是顯著的。采用表面等離子體共振技術(shù)研究表明，TNF與其可溶性受體的親與常數(shù)遠(yuǎn)高于一般的抗原與抗體結(jié)合的親與力8。4 TNF的生物學(xué)活性 TNF在體內(nèi)、體外均能殺死某些腫瘤細(xì)胞，或抑制其增殖作用。TNF殺傷腫瘤的機(jī)理還不十分清楚，與補(bǔ)體或穿孔素殺傷細(xì)胞相比，TNF殺傷細(xì)胞沒(méi)有穿孔現(xiàn)象

6、，而且殺傷過(guò)程相對(duì)比較緩慢。TNF能夠增加過(guò)氧化物陰離子產(chǎn)生，增強(qiáng)ADCC功能，刺激細(xì)胞脫顆粒與分泌髓過(guò)氧化物酶，促進(jìn)中性粒細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上，從而刺激機(jī)體局部炎癥反應(yīng)。TNF促進(jìn)T細(xì)胞MHC類(lèi)抗原表達(dá)，增強(qiáng)IL-2依賴(lài)的胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)IL-2、CSF與IFN-等淋巴因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)有絲分裂原或外來(lái)抗原刺激B細(xì)胞的增殖與Ig分泌。5 TNF與臨床 TNF是目前發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子。在許多疾病，如心血管疾病、惡病質(zhì)與敗血癥休克所致的多器官功能衰竭、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、炎癥性腸病、移植物抗宿主病與骨髓造血紊亂綜合癥等的病理生理過(guò)程中起著重要的作用9。TNF除了

7、對(duì)腫瘤細(xì)胞本身具有細(xì)胞毒性之外，它也能摧毀實(shí)體瘤周?chē)难苌掀そM織，并且通過(guò)血栓的形成，阻斷腫瘤的血液營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，最終導(dǎo)致腫瘤的出血性壞死、消退或消失。超過(guò)一定濃度的TNF具有明顯的抗新生血管形成作用。TNF能明顯降低實(shí)體瘤周?chē)g隙組織的壓力，擴(kuò)大腫瘤周?chē)掀そM織的間隙，改變周?chē)艿耐ㄍ感?，使化療的藥物到達(dá)靶組織周?chē)Ａ硗?，TNF通過(guò)對(duì)人體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)從而加強(qiáng)自身的抗腫瘤作用。TNF導(dǎo)致的心肌機(jī)能障礙包括鈣平衡的改變、直接的細(xì)胞毒作用、氧化張力、興奮-收縮耦聯(lián)破壞、心肌細(xì)胞凋亡等。 研究表明，嚴(yán)重的充血性心力衰竭、心肌梗死、心肌炎、擴(kuò)張性心肌病、心臟移植排斥反應(yīng)與進(jìn)行心肺旁路手術(shù)患者的血漿T

8、NF水平顯著升高。6 TNF的制備 常用制備TNF的方法有體內(nèi)法、體外法與基因工程法。體內(nèi)法將卡介苗與LPS注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，誘導(dǎo)體內(nèi)TNF的產(chǎn)生。外周血單個(gè)核細(xì)胞在重組白介素-2與有絲分裂原刺激下，或在十四酰沸波乙酸酯與LPS作用下均能產(chǎn)生TNF，此法可在體外大量收集細(xì)胞培養(yǎng)物，實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)。分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，極大的促進(jìn)了人TNF的制備工作。人TNF的氨基酸序列已弄清楚，并克隆出編碼TNF蛋白質(zhì)的cDNA。利用基因工程法可獲得高活性、高純度的TNF?；蚬こ谭ㄖ苽?) 改造TNF的分子結(jié)構(gòu)分析hTNF的空間結(jié)構(gòu)是研究新型hTNF的前提。具有生物活性的hTNF其空間結(jié)構(gòu)是3個(gè)TNF單體以邊

9、對(duì)面形式形成的近似三角錐形的三聚體，結(jié)構(gòu)與功能研究表明，刪去N端前7個(gè)氨基酸殘基不影響hTNF三聚體空間結(jié)構(gòu)。相反，在刪去N端7個(gè)氨基酸的同時(shí)增加N端的堿性氨基酸，可以增強(qiáng)形成活性三聚體的能力，從而提高h(yuǎn)TNF的抗腫瘤活性10。何曉龍等11構(gòu)建了3種hTNF的衍生物。這三種衍生物比以往報(bào)道的單獨(dú)缺失N端氨基酸或單獨(dú)增強(qiáng)N端堿性氨基酸引起的活性升高要大得多，說(shuō)明兩種突變?cè)谔岣逿NF的細(xì)胞毒活性方面具有協(xié)同作用，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。2) 制備TNF融合蛋白1. 具有TNF抗腫瘤活性與靶細(xì)胞專(zhuān)一性的融合蛋白借助于細(xì)胞因子與其受體的特異性，hTNF融合蛋白可以導(dǎo)向殺傷那些表達(dá)受體的腫瘤細(xì)胞。劉麗等

10、12針對(duì)TNF在腫瘤治療劑量下產(chǎn)生的嚴(yán)重毒副作用及一些腫瘤細(xì)胞白介素-6受體明顯增高的事實(shí)，采用PCR技術(shù)將TNF突變體與人IL-6成熟肽鏈編碼區(qū)cDNA通過(guò)人工接頭進(jìn)行融合，并將融合的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)活性檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，該融合蛋白在具有TNF的對(duì)L929細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用與結(jié)合IL-6受體的能力，在高表達(dá)IL-6受體的人骨髓瘤細(xì)胞上測(cè)得的細(xì)胞毒活性教同樣位點(diǎn)突變的TNF高約3倍。國(guó)內(nèi)比較成功的例子是抗肝癌單鏈抗體融合TNF的雙功能抗體。陳波等13將hTNF同帶有肝細(xì)胞特異結(jié)合位點(diǎn)的乙肝病毒表面抗原pre(1-65)肽段進(jìn)行融合表達(dá)，并在融合蛋白之間加入了連接肽段或凝血酶酶切

11、位點(diǎn)，獲得了TNF與preS1融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物，該產(chǎn)物具有TNF的對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。2. 具有雙重活性的融合蛋白構(gòu)建融合蛋白不僅要考慮其靶向性，還要增加其功能。IL-2與TNF是引人注目的抗腫瘤活性因子，兩者在抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)方面具有協(xié)同作用。顏世慶等14利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建了包括編碼IL-2前導(dǎo)肽與TNF成熟肽序列的融合基因，表達(dá)的融合基因產(chǎn)物在體內(nèi)與體外都對(duì)腫瘤細(xì)胞的生成具有抑制作用。 高長(zhǎng)壽等15將人降鈣素基因相關(guān)肽與hTNF高效融合表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白既有CGRP的結(jié)合活性，又有hTNF的活性。7 檢測(cè)方法生物學(xué)檢測(cè)方法：常用TNF對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的強(qiáng)弱來(lái)判斷它的活

12、性。檢測(cè)TNF對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的指標(biāo)主要有:胎盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)法,中性紅細(xì)胞攝入法,結(jié)晶紫染色法,MTT法，熒光素標(biāo)記法等。免疫學(xué)檢測(cè)方法:免疫學(xué)檢測(cè)主要是根據(jù)TNF分子本身具有抗原性的特點(diǎn),與抗TNF 抗體發(fā)生特異性結(jié)合,具有較高的靈敏度與特異性。與生物學(xué)檢測(cè)相比,免疫學(xué)檢測(cè)方法由于不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),從而大大簡(jiǎn)化了操作過(guò)程,使得臨床檢測(cè)TNF成為可能。近幾年基因工程的迅速發(fā)展，也為免疫學(xué)檢測(cè)方法提供了大量高純度的TNF標(biāo)準(zhǔn)品。8 結(jié)語(yǔ) TNF是由激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種生物活性的多肽細(xì)胞因子，與機(jī)體免疫反應(yīng)、急性期反應(yīng)及炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，它可通過(guò)激活細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)而誘

13、發(fā)全身炎性反應(yīng)，導(dǎo)致血液動(dòng)力學(xué)改變、心肌抑制、微血管損傷及急性肺 間質(zhì)損傷等。運(yùn)用正確適當(dāng)?shù)目筎NF治療將可能成為一種新的治療疾病的方法，但其臨床應(yīng)用價(jià)值還有待于進(jìn)一步的證實(shí)。參 考 文 獻(xiàn)1 Nedwin GE，Naylor SL，Sakaguchi AY，et al. Human lymphotoxin and chromosomal localization. Nucleic Acids Res，1985，13：63612 Kapadia S ，Lee J,Torre-Amione G ,et al. Tumor necrosis factor alpha gene and protei

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