荷瘤小鼠T細胞表面CD59分子的表達與T細胞信號轉導的相關性研究

1、荷瘤小鼠T細胞表面CD59分子的表達與T細胞信號轉導的相關性研究【關鍵詞】 荷瘤小鼠T細胞CD59分子T細胞信號CD59是一種以糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidy inositol, GPI)錨著于細胞膜表面的糖蛋白, 廣泛分布于造血細胞、 非造血細胞及多種組織細胞表面, 其主要功能是調(diào)節(jié)補體活化, 通過與補體攻膜復合物（membrane attack complex, MAC）裝配過程中的C8 和/或C9 結合從而抑制補體的活化1。有許多研究證實, CD59也參與T細胞的黏附及細胞信號的轉導2。荷瘤機體的T細胞往往出現(xiàn)活化信號轉導異常, 導致其功能低下, 甚至處于無反應狀

2、態(tài)3。最近有學者研究發(fā)現(xiàn)CD59在腫瘤患者的紅細胞上的表達明顯降低, 導致天然免疫的失衡4。但對于荷瘤機體內(nèi)T細胞CD59的表達情況及對T細胞活化的影響, 尚未見報道。本研究將通過建立小鼠HeLa細胞腫瘤模型, 對荷瘤機體T細胞的CD59表達情況及對T細胞活化的影響進行探討。1 材料和方法1.1 材料 HeLa細胞致瘤模型小鼠由本課題組前期建立; 淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限公司; 純化的CD59單克隆抗體（mAb）為BD Biosciences的產(chǎn)品; 熒光探針Fluo3/AM購自Biotium, HEPES(Solarbio); FITC標記山羊抗小鼠IgG(H2 / 9L

3、)為中杉金橋公司產(chǎn)品, FITC標記的抗小鼠CD25和PE標記的抗小鼠CD4均購自Biolegend公司。1.2 方法1.2.1 細胞制備 取前期HeLa細胞致瘤的小鼠和正常對照小鼠, 無菌分離兩組小鼠胸腺, 制備單細胞懸液, 淋巴細胞分層液獲取單個核細胞, 再經(jīng)尼龍柱處理獲取T淋巴細胞, 苔盼藍染色細胞活率95%以上。調(diào)整細胞密度為4×108/L, 加入100 mL/L胎牛血清, 青霉素、 鏈霉素各100 mL/L的RPMI1640培養(yǎng)液10 mL, 50 mL/L CO2 、 37培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.2.2 T細胞表面CD59表達 取1 mL兩組T細胞, PBS洗3遍, 滴于載玻片上

4、吹干, 950 mL/L乙醇固定5 min, 吹干; 加CD59mAb(1640), 10 L, 對照加IgG2a, 10 L, 37濕盒孵育45 min, PBS洗3遍, 5 min/次, 吹干; 加FITC標記的山羊抗小鼠IgG(HL)（1320）, 10 L, 37濕盒孵育45 min, PBS洗3遍, 5 min/次, 吹干; 熒光顯微鏡觀察。熒光的檢測及結果判定: 隨機選取5個視野, 根據(jù)特異熒光強弱依次用弱陽性（±）、 陽性（+）、 強陽性（）表示, 無特異性熒光的用陰性（-）表示, 并根據(jù)熒光強度記分: 陰性為0分, 弱陽性為1分, 陽性為2分, 強陽性為3分。1.2.

5、3 細胞內(nèi)Ca2+的測定 (1)Fluo3/AM負載細胞: 取前期準備的小鼠淋巴細胞, 經(jīng)苔盼藍染色細胞活率95以上, 調(diào)整細胞密度為5×109/L, HEPES緩沖液（pH7.4）洗3遍, 加10 mol/L Fluo3/AM , 100 L, 37孵育40 min。孵育后, 1 000 r/min, 離心10 min, 吸棄Fluo3/AM上清, HEPES緩沖液（pH7.4）洗3遍。加0.5 mL HEPES緩沖液, 待檢。(2) T細胞內(nèi)Ca2+的測定: 使用Nikon激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)的Ca2+, 按文獻方法5檢測。結果以未加處理因素前的熒光值為100%。1.2.4

6、 流式細胞術檢測T淋巴細胞CD25表達 T細胞中加入1 mg/L CD59mAb, 37孵育48 h。調(diào)整細胞密度2×108/L, 吸取250 L不同組細胞懸液平均分放1、 2、 3號EP管中, 設置對照組和同型對照組, 加入FITC標記的抗小鼠CD25, PE標記的抗小鼠CD4, 各10 L, 混勻后, 4避光作用30 min, 50 g/L白蛋白PBS洗2次, 5 min/次。多聚甲醛固定, 避光保存, 24 h內(nèi)流式細胞儀進行分析。1.2.5 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)以x±s, 兩樣本比較采用雙樣本t檢驗, 全部統(tǒng)計處理均在SPSS10.0軟件上進行。2 結果2.1 T細

7、胞CD59表達 分別觀察對照組和實驗組T細胞表面CD59特異熒光的表達, 實驗組熒光表達明顯減弱, 差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05, 表1）。表1 兩組T細胞CD59表達的比較（略）2.2 CD59mAb對兩組T細胞Ca2+i的影響 加入CD59mAb后, 靜息T細胞中Ca2+i明顯升高, 1 min正常對照組即升至(452.7±65)%, 而荷瘤組升至（287.1±56）%, 兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01, 表2）。2.3 CD59mAb作用下小鼠T細胞CD25的表達 小鼠T淋巴細胞靜息狀態(tài)下很少表達CD25分子, 經(jīng)CD59mAb刺

8、激48 h后, CD25表達增加。荷瘤組CD25表達比正常組明顯減少, 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05, 圖1）。表2 CD59mAb對小鼠T細胞Ca2+i的影響（略）bP<0.01 vs非腫瘤模型.圖1 小鼠T細胞CD25的表達（略）3 討論 近年來研究發(fā)現(xiàn), 荷瘤宿主T細胞信號轉導缺失, 導致其功能低下甚至處于無反應狀態(tài)。T細胞表達的CD59具有細胞信號轉導的功能, 而有關其在腫瘤機體內(nèi)的變化及作用機制, 尚未見報道。我們的實驗顯示, 荷瘤小鼠T細胞CD59的熒光表達較正常對照組減弱, 差別有統(tǒng)計學意義, 初步證實荷瘤小鼠T細胞CD59表達減少。為進一步研究CD

9、59表達減少對T細胞信號轉導的影響, 我們用CD59mAb交聯(lián)CD59, 發(fā)現(xiàn)Ca2+i明顯升高, 且荷瘤組Ca2+i升高幅度遠低于正常組, 差異顯著。Ca2+為胞內(nèi)第二信使, 其與鈣調(diào)蛋白（CaM）結合形成Ca2+CaM復合物, 激活其靶酶, 向下游傳遞信號6。Ca2+i升高說明CD59經(jīng)特異抗體交聯(lián)后產(chǎn)生信號, 并將其傳至胞內(nèi), 且信號強弱與T細胞表達CD59的量有關。 CD25是T細胞中期活化抗原, 靜息T細胞表達少, 活化后則大量誘導表達7。我們用CD59mAb刺激T淋巴細胞表達CD25, 結果顯示, 正常小鼠T細胞CD25表達強于荷瘤小鼠T細胞（P<0.05）, 可能是

10、荷瘤小鼠T細胞CD59表達減少甚至缺失, 細胞信號轉導受抑, 導致T細胞活化減少。 綜上結果顯示, 荷瘤組T細胞CD59表達減少, 導致T細胞信號轉導受抑、 活化減弱。CD59在T細胞信號轉導中發(fā)揮重要作用?！緟⒖嘉墨I】 1 Farkas I, Baranyi L, Ishikawa Y, et al. CD59 blocks not only the insertion of C9 into MAC but inhibitsion channel formation by homologous C5b8 as well as C5b9J. Physiol, 2002, 539(Pt2): 5

11、37-545.2 Korty PE, Brando C, Shevach EM, et al. CD59 functions as a signal transducing molecule for human T cell activationJ. Immunol, 1991, 146(2): 4092-4098.3 陳詩書. 醫(yī)學細胞與分子生物學M. 上海: 上海醫(yī)科大學出版社, 1995: 566.4 郭 峰, 錢寶華, 花美仙, 等. 腫瘤患者紅細胞天然免疫分子CD35、 CD59相關性研究J. 中國免疫學雜志, 2004, 20(2): 136-137.5 李明春, 雷林生, 梁東升, 等. 靈芝多糖對小鼠腹腔巨噬細胞漿游離Ca2+濃度的影響J. 中國藥學雜志, 1999, 34（12）: 805-807. 6 Fraser JD, Straus D, Weiss A. Signal transduction events leading to T cell lymphokine gene expressionJ. Immunol Today, 1993, 14(7): 357-362.7 GonzalezGarcia A,