人白介素24cDNA克隆、突變糾正和原核表達

1、人白介素24 cDNA克隆、突變糾正和原核表達 作者：魏麗麗，李成華，袁成福，陳濟，丁嵩濤，劉革力，易發(fā)平，宋方洲【摘要】 目的 獲取人白介素24(IL24)cDNA，構(gòu)建原核表達載體以表達含有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白GSTIL24。方法 以人外周血單核細胞(PBMC)總RNA為模板，RTPCR擴增IL24 cDNA，克隆入原核表達載體pGEX4T2，測序結(jié)果顯示在IL24 cDNA第223位GA，370位TC，從而導(dǎo)致其編碼蛋白的氨基酸發(fā)生改變：A75T，H124Y，通過二次PCR將其糾正，重組載體pGEXIL24轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，異丙基D硫代半乳糖苷(IPTG)誘

2、導(dǎo)表達，SDSPAGE，Western blot檢測顯示有融合蛋白GSTIL24表達。結(jié)果 通過RTPCR及二次PCR得到人IL24 cDNA，構(gòu)建其原核表達載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在相對分子量約為50 000處有融合蛋白表達。結(jié)論 IL24的重組載體在大腸桿菌BL21(DE3)可以表達GSTIL24融合蛋白。 【關(guān)鍵詞】 白介素24；二次PCR；突變糾正；融合蛋白；克隆；原核表達白細胞介素24(interleukin24, IL24)是1995年由美國哥倫比亞大學(xué)的Jiang等1研究發(fā)現(xiàn)的，它能選擇性地抑制廣譜癌細胞生長，促進凋亡，并具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力。經(jīng)復(fù)制缺陷腺病毒攜帶的IL2 / 17

3、24已經(jīng)進入II期臨床試驗，研究結(jié)果顯示：療效顯著而毒副作用很少2。因此，IL24有望成為腫瘤基因治療的一種新的候選基因。我們擬通過RTPCR方法獲取IL24 cDNA，構(gòu)建其原核表達載體，并誘導(dǎo)其表達，為進一步的研究奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料大腸桿菌E.coli DH5，E.coli BL21(DE3)為本室保存。pGEX4T2(4970bp)購自Amersham公司。淋巴細胞分離液購自鼎國公司。Trizol，BamH，Xho，pyrobestTM DNA polymerase，DNA連接試劑盒,引物的合成和重組質(zhì)粒測序由TaKaRa公司完成。RT試劑盒購自TOYOBO公司。DNA

4、 marker、小量質(zhì)粒純化抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。小分子量蛋白marker購自博大泰克公司?？构入赘孰腟轉(zhuǎn)移酶(glutathione S transferase,GST)抗體及其二抗購自Merck公司。1.2 IL24的基因克隆通過淋巴細胞分離液分離健康人靜脈血的外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，用Trizol提取其總RNA,通過RTPCR擴增IL24 cDNA，RT反應(yīng)體系： 2L RNA，1L olig dT(20)，9L RNasefree dd H2O 70 5min，冰浴10min，

5、再加入4L 5×RT buffer，2L dNTPs， 1L RNase inhibitor，1L莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukaemia virus, MMuLV)反轉(zhuǎn)錄酶30 10min，42 20min，99 10min。根據(jù)GenBank中人IL24基因序列(登錄號：NM 006850)通過DNAStar軟件設(shè)計IL24引物，并在引物的5端引入酶切位點，上游引物a：5CGGGATCCATGAATTTTCAACAGAGGCTG3，下游引物b：5CCGCTCGAGCTAGACATTCAGAGCTTGTAG3(劃線部分分別為BamH和Xho的酶切位點)，

6、管家基因G3PDH (glyceraldehyde 3phosphate dehydrogenase)引物序列：Primer R：5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3；Primer F：5ACCACAGTCCATGCCATCAC3，擴出的片段長450bp。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 8.4L，10×PCR buffer 2L, dNTPs(2.5mmol/L)1.6L，引物a、b各2L，PrimerR、 F各0.4L，cDNA 3L，DNA聚合酶0.2L，94 5min，94 30s，56 30s，72 1min (30)，72 10min。1.3 原核表達載體的構(gòu)建將PCR

7、產(chǎn)物和pGEX4T2載體分別用BamH/Xho雙酶切，膠回收試劑盒純化，TaKaRa連接試劑盒連接16 30min，轉(zhuǎn)化E.coli DH5感受態(tài)，酶切鑒定，將陽性克隆送TaKaRa公司測序。1.4 IL24 cDNA點突變的糾正223位G突變?yōu)锳，設(shè)計其糾正引物c、d；370位T突變?yōu)镃，設(shè)計其糾正引物e、f, c：5TCTTTCACAGCCCAGAAGGCT 3，d：5AGCCTTCTGGGCTGTGAAAGA 3，e：5TCTATTGTGGTAGTTTTTGAA 3，f：5TTCAAAAACTACCACAATAGA 3(標有下劃線的堿基是糾正點突變位置)，采用高保真DNA polymer

8、ase，通過PCR糾正突變。223位突變的糾正步驟：分別擴增ac、bd片段，擴增條件為94 5min，94 30s，56 30s，72 45s(30)，72 10min，膠回收后，回收的片段分別稀釋10倍做為模板等量加入第二次擴增體系，再加引物a、b，94 5min，94 30s，56 30s，72 1min (30)，72 10min。370位突變的糾正步驟除在分別擴增ae、bf片段時的退火溫度改為54，其他相同。將最后的PCR產(chǎn)物與載體pGEX4T2分別經(jīng)BamH/Xho雙酶切后連接。酶切鑒定后測序，正確的載體命名為pGEXIL24。1.5 誘導(dǎo)表達和SDSPAGE分析將測序正確的重組載體

9、轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，37過夜生長，以1100比例轉(zhuǎn)接含有終濃度為100mg/L氨卞青霉素的2×YT培養(yǎng)液中，37振蕩培養(yǎng)至A600nm為0.6時，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，30繼續(xù)培養(yǎng)3h；離心收集菌體，裂解沉淀，用BioRad垂直平板電泳儀以60g/L的濃縮膠及150g/L的分離膠跑SDSPAGE，通過考染分析結(jié)果。1.6 Western blot鑒定IPTG誘導(dǎo)的表達產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，0.5g/L脫脂奶粉室溫封閉1h，抗GST單抗(12000)室溫孵育2h，TBST洗膜3次(每次15min)，羊抗小鼠IgGHRP(11

10、0000)室溫孵育1.5h，TBST洗膜3次(每次15min)，DAB閉光顯色1min。2.1 IL24基因的擴增以人PBMC的總RNA為模板，通過RTPCR擴增得到一條與IL24 cDNA大小相符的條帶，出現(xiàn)在2、3泳道，大小為450bp的條帶是管家基因G3PDH的產(chǎn)物(圖1)。2.2 原核表達載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物和pGEX4T2載體分別用BamH/Xho雙酶切，膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，酶切鑒定初步顯示構(gòu)建成功(圖2)，測序結(jié)果與GenBank中人IL24基因序列(登錄號：NM 006850)比對后發(fā)現(xiàn)：IL24基因的第223位G突變?yōu)锳、370位T突變?yōu)镃，并導(dǎo)致其編碼的氨基酸的改變：75位的

11、丙氨酸(A)變?yōu)樘K氨酸(T),124位的組氨酸(H)變?yōu)槔野彼?Y)。2.3 IL24基因點突變糾正針對突變位點設(shè)計引物，通過二次PCR糾正， PCR產(chǎn)物再經(jīng)BamH/Xho雙酶切與被相同雙酶切的pGEX4T2連接，構(gòu)建好的載體經(jīng)測序證實突變糾正成功(圖3)。2.4 GSTIL24融合蛋白的誘導(dǎo)表達鑒定正確的重組載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)后，離心收集菌體，SDSPAGE分離，通過考染分析結(jié)果(圖4)，在相對分子量約為50000處有一新生條帶。2.5 GSTIL24的Western blot鑒定經(jīng)IPTG誘導(dǎo)帶有重組表達蛋白的菌體裂解液和未誘導(dǎo)菌體裂解液經(jīng)SDSPAG

12、E電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用檢測GST標簽蛋白的抗體檢測融合蛋白的表達。結(jié)果顯示在融合蛋白的相應(yīng)位置出現(xiàn)特異條帶，而在未誘導(dǎo)、空載體誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的泳道未出現(xiàn)雜交帶(圖5)。3 討 論IL24是IL10家族的新成員，可抑制廣譜癌細胞的生長，促進凋亡。它是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個對正常的組織細胞沒有毒性的細胞因子。它的抑癌機制不是很清楚，可以通過調(diào)節(jié)依賴雙鏈RNA的蛋白激酶(doublestranded RNA dependent protein kinase, PKR)、p38有絲分裂原活化蛋白激酶 (p38 mitogenactivated protein kinase, p38MAPK)、

13、連接素(catenin) 、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3kinase, pI3K)、胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extra celluar signalregulated kinase 1/2, ERK1/2)和應(yīng)激活化蛋白激酶CJun氨基端激酶1/2(stressactivated protein kinase CJun Nterminal Kinase1/2, JNK1/2)等信號通路，抑制DNA的修復(fù); 干擾線粒體功能；促進活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)合成；抑制腫瘤血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移能力而抑制癌細胞的生長。由復(fù)制缺陷腺病毒攜帶

14、的IL24(AdIL24)現(xiàn)已進入期臨床實驗，治療效果顯著而沒有明顯的毒副作用2。但是，AdIL24對一些腫瘤細胞的作用效果不好，如85%-95%胰腺癌細胞具有Kras突變，研究發(fā)現(xiàn)僅用AdIL24轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞，沒有抑制生長和促進凋亡的作用，而用細菌表達純化的GSTIL24處理胰腺癌細胞后，可直接特異性誘導(dǎo)癌細胞凋亡而不管其Kras狀態(tài)3；腎細胞癌系(A498，UOK121N)缺乏柯薩奇病毒和腺病毒受體，所以可抵抗腺病毒的感染，而用GSTIL24處理后可以以劑量依賴的方式抑制腎癌細胞的增殖，對正常的腎組織無影響4。GSTIL24也具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的特性，它可以幫助闡明IL24的作用

15、機制，并有可能應(yīng)用于腫瘤治療5。IL24在人的外周血單核細胞表達6，所以我們通過提取PBMC的總RNA，通過RTPCR獲取IL24 cDNA，然后將其連入原核高效表達載體pGEX4T2。該載體可以經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在IL24蛋白的N端連上GST標簽，融合蛋白可以通過親和層析方法純化，為進一步研究其作用機制提供便利。我們構(gòu)建的重組載體經(jīng)測序證實在IL24 cDNA第223位GA,370位TC，從而導(dǎo)致其編碼蛋白的氨基酸發(fā)生改變：A75T，H124Y。因此，這兩個突變?yōu)橛幸馔蛔?，突變位點位于IL24成熟肽的編碼區(qū)內(nèi)，極有可能改變IL24蛋白的空間構(gòu)象，影響IL24與下游信號分子的相互作用，進而影響其

16、對腫瘤細胞的作用效果7。所以，我們通過設(shè)計針對突變位點的引物，通過二次PCR方法將其成功糾正。測序正確的重組載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，檢測到有GSTIL24融合蛋白表達，為我們進一步的研究打下了良好的基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I】 1Jiang H, Lin JJ, Su ZZ, et al. Substraction hybridization identifies a novel melanomadifferentiationassociated gene, mda7, modulated during human melanoma differentiation,growth and progressi

17、on J. Oncogene,1995,11(12):24772486.2Fisher PB.Is mda7/IL24 a magic bullet for cancer? J. Cancer Res, 2005,65 (22):1012810138.3Su Z, Lebedeva IV, Gopalkrishnan RV, et al. A combinatorial approach for selectively inducing programmed cell death in human pancreatic cancer cells J. PNAS, 2001, 98(18):10

18、33210337.4Yacoub A, Mitchell C, Brannon J, et al. MDA7 (interleukin24) inhibits the proliferation of renal carcinoma cells and interacts with free radicals to promote cell death and loss of reproductive capacity J. Mol Cancer Ther, 2003, 2(7):623632.5 Sauane M , Gopalkrishnan RV, Choo HT, et al. Mechanistic aspects of mda7/IL24 cancer cell selectivity analysed via a bacterial fusion protein J. Oncogene, 2004, 23(46)