透射電鏡樣品制備方法(共4頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上透射電鏡樣品制備方法由于電子束穿透能力限制，必須把標(biāo)本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用，這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術(shù)是最基本、最常用的制備技術(shù)。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似，需要經(jīng)過取材、固定、脫水、滲透、包埋聚合、切片及染色等步驟。一 取材的基本要求組織從生物活體取下后，如果不立即進行適當(dāng)處理，會由于細(xì)胞內(nèi)部的各種酶作用，出現(xiàn)細(xì)胞自溶現(xiàn)象。此外還可能由于污染，微生物在組織內(nèi)繁殖使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)遭受破壞，因此，為了細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持天然狀態(tài)，必須做到快、小、準(zhǔn)、冷。（1） 動作迅速，

2、組織從活體取下后應(yīng)在最短的時間內(nèi)（爭取1分鐘內(nèi)）投入2.5%戊二醛固定液。（2） 所取組織的體積要小，一般不超過1mm*1mm*1mm。也可將組織修成1mm*1mm*2mm大小長條形。因為固定劑的滲透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內(nèi)部將不能得到良好的固定。（3） 機械損傷要小，解剖器械應(yīng)鋒利，操作宜輕，避免牽拉、挫傷與擠壓。（4） 操作最好在低溫（04）下進行，以降低酶的活性，防止細(xì)胞自溶。（5） 取材部位要準(zhǔn)確。二 取材方法將取出的組織放在潔凈的蠟版上，滴一滴預(yù)冷的固定液，用新的、鋒利的刀片將組織切下并修小，然后用牙簽或者鑷子將組織塊移至盛有冷的固定液的1.5ml離心管中。如果組織塊帶有較多

3、的血液和組織液，應(yīng)先用PBS洗幾遍，然后切成小塊固定。1. 動物及人體組織的取材（在冰浴上進行）動物組織的取材，應(yīng)麻醉（1%戊巴比銨5ml/kg體重腹腔注射）或斷頭急性處死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小塊組織，放在干凈的紙板上，滴一滴冷卻的固定液，用新的、無油污的鋒利雙面刀片將材料切成大約1mm寬，23mm長的小塊并從中選出受損傷較小的小條，再將其切成1mm3的小塊，最后用牙簽將這些小塊逐一放入盛有預(yù)冷的、新鮮固定液的1.5ml管內(nèi)，放入冰箱冷藏室低溫固定（04）2-4小時或以上。*固定結(jié)束后，將固定液用PBS稀釋三倍，樣品于該溶液中在4冰箱保存。送樣前請用PBS浸泡清洗3次，貼好標(biāo)簽送

4、至電鏡室。2. 體外培養(yǎng)細(xì)胞的取材（在冰浴上進行）培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞取材時，先倒出部分培養(yǎng)液，然后用刮刀輕輕刮下瓶壁上的細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心機4低速離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘，使細(xì)胞聚成團塊，棄去上清，沿壁小心加入新鮮的固定液，保持細(xì)胞成團狀態(tài)，于4冰箱中固定2小時以上。*固定結(jié)束后，將固定液用PBS稀釋三倍，樣品于該溶液中在4冰箱保存。送樣前請用PBS浸泡清洗3次，貼好標(biāo)簽送至電鏡室。對于血液及其他細(xì)胞懸浮液，不宜直接固定，可在取材后將其放入離心管，以2000-4000轉(zhuǎn)/分的速度離心10-15分鐘，待樣品在離心管底部集結(jié)成團塊狀后，用吸管吸出上清液，再緩緩滴入固定液稍

5、加固定，然后用刮鏟將樣品取出并切割成小塊，再行固定。3. 植物組織取材植物組織的取材比較容易，它的細(xì)胞離體后變化不像動物細(xì)胞那么迅速，但植物細(xì)胞的細(xì)胞壁阻礙著固定液的迅速滲透，因此，植物材料的取材宜切成薄片狀或牙簽狀，經(jīng)適當(dāng)?shù)墓潭ê笤偾谐尚》綁K。*固定結(jié)束后，將固定液用PBS稀釋三倍，樣品于該溶液中在4冰箱保存。送樣前請用PBS浸泡清洗3次，貼好標(biāo)簽送至電鏡室。4. 細(xì)菌及藻類等樣品取材 對于不易成團的樣品，需先清洗，加入固定液后吹散，于4冰箱中固定2小時，固定結(jié)束后，PBS清洗3次，繼續(xù)按照文獻瓊脂鑄模法制備透射電鏡樣品（白煥紅）內(nèi)描述方法進行瓊脂預(yù)固定。再將瓊脂預(yù)包埋后的樣品于4冰箱中固定

6、過夜。 *固定結(jié)束后，將固定液用PBS稀釋三倍，樣品于該溶液中在4冰箱保存。送樣前請用PBS浸泡清洗3次，貼好標(biāo)簽送至電鏡室。緩沖液配方磷酸鹽緩沖液（三個步驟） 1. 磷酸鹽緩沖液（0.2M）甲液：0.2M的磷酸氫二鈉溶液乙液：0.2M的磷酸二氫鈉溶液Na2HPO42H2O 35.61g(Na2HPO47H2O) 53.65g(Na2HPO412H2O) 71.64gNaH2PO4H2O 27.60g( NaH2PO42H2O) 31.21g加蒸餾水溶解成 1000ml加蒸餾水溶解成 1000ml2. 按下表混合甲、乙兩液既得所需pH的0.2M緩沖液 0.2M磷酸鹽緩沖液的配制pH6.46.66.87.07.27.47.67.88.0甲液(ml)乙液(ml)26.573.53