最新年初級檢驗技師《微生物檢驗》講義第6章微生物檢驗概述

1、微生物檢驗概述臨床微生物檢驗即診斷微生物學(xué)，是在醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的范疇內(nèi)，側(cè)重研究感染性疾病快速、準(zhǔn)確地檢出病原體的策略與方法，為臨床診斷提供依據(jù)，并指導(dǎo)進一步合理用藥和防止感染繼續(xù)擴散的學(xué)科。臨床細菌實驗室的主要工作是從臨床標(biāo)本中分離出病原菌并進行準(zhǔn)確鑒定，同時指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用藥物，為臨床診斷、治療、預(yù)后和流行病學(xué)調(diào)查以及醫(yī)院內(nèi)感染的監(jiān)控提供可靠的依據(jù)。一、臨床微生物檢驗的目的和要求（一）臨床微生物檢驗的目的1. 為臨床感染性疾病的診斷提供病原學(xué)依據(jù)。2. 為臨床感染性疾病的治療提供參考用藥的信息。3. 為醫(yī)院感染提供病原微生物及其耐藥性動態(tài)信息。4. 改進或更新臨床微生物檢驗的方法。（二）臨床

2、微生物學(xué)檢驗的要求1. 快速、準(zhǔn)確地提出檢驗報告。2. 檢驗人員必須有較豐富的微生物學(xué)基礎(chǔ)知識和熟練、正確的操作技能，必須養(yǎng)成有菌觀點和無菌操作的習(xí)慣。3. 臨床微生物檢驗必須進行全面質(zhì)量控制，并參加和接受質(zhì)量控制考核。4. 重視實驗室消毒滅菌工作。（三）診斷試驗的選擇原則1. 選擇有鑒定價值的試驗要對兩種細菌進行鑒定，須選擇一項兩種菌呈現(xiàn)截然不同結(jié)果的試驗，即一種菌呈現(xiàn)陽性（陽性反應(yīng)的菌株陽性率須大于 90%），另一種菌為陰性（陰性反應(yīng)的菌株陽性率應(yīng)小于值。否則，就沒有鑒定價值。10%），這項試驗才有鑒定價2. 選擇簡易、快速、方便的試驗（ 1）鑒定一種細菌可能有多種特異的方法，只選擇其中一

3、或兩種達到目的即可，多選無意義。如金黃色葡萄球菌只選較簡單的凝固酶試驗就足夠了。（ 2）選擇操作簡便、快速的方法。（ 3）選用復(fù)合培養(yǎng)基， 一次操作可同時看幾個生化反應(yīng)， 如克氏雙糖鐵 （KIA ），動力靛基質(zhì)脲酶 （ MIU）等。3. 綜合考慮試驗的敏感性和特異性敏感性 =所有陽性結(jié)果數(shù)所有感染病人數(shù)，試驗敏感性越高，假陰性結(jié)果就越少。特異性總數(shù)未感染病人數(shù)，特異性越高，假陽性結(jié)果越少。試驗的敏感性和特異性是相互聯(lián)系的，試驗的敏感性增加，會使特異性下降，反之亦然。=陰性結(jié)果二、標(biāo)本的采集和運送對感染性疾病進行病原檢查和鑒定，須通過采集患者的標(biāo)本，經(jīng)系列實驗，才能獲得明確的病原學(xué)診斷。標(biāo)本質(zhì)量

4、直接影響診斷結(jié)果，不當(dāng)?shù)臉?biāo)本可導(dǎo)致假陰性、假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，因此，在標(biāo)本采集、送檢、保存等各個環(huán)節(jié)都要規(guī)范操作，嚴格控制，是確保實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提。（一） 標(biāo)本采集的一般原則1. 早期采集最好是病程早期、急性期或癥狀典型時，而且必須在使用抗生素或其他抗菌藥物之前采集。2. 無菌采集采集的標(biāo)本應(yīng)無外源性污染。在采集血液、腦脊液、胸腔積液、關(guān)節(jié)液等無菌標(biāo)本時，應(yīng)嚴格進行無菌操作；對于與外界相通的腔道，如竇道標(biāo)本應(yīng)由竇道底部取標(biāo)本，采集的標(biāo)本均應(yīng)盛于無菌容器內(nèi)。3. 根據(jù)目的菌的特性厭氧菌、需氧或兼性厭氧菌，以及L 型菌采用的方法不同。4. 采集適量標(biāo)本采集量不應(yīng)過少，而且要有代表性，同時有些標(biāo)

5、本還要注意在不同時間采集不同部位標(biāo)本。5. 安全采集采集標(biāo)本時不僅要防止皮膚和黏膜正常菌群對標(biāo)本的污染，同時也要注意安全，防止傳播和自身感染。（二）標(biāo)本的處理一些對環(huán)境敏感的細菌如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血桿菌等應(yīng)保溫并立即送檢，而其他所有的標(biāo)本采集后最好在2h 之內(nèi)送到實驗室。若不能及時送檢，標(biāo)本應(yīng)置于一定環(huán)境中保存。一般情況下，用于細菌培養(yǎng)的標(biāo)本保存時間不應(yīng)超過24h。厭氧性標(biāo)本應(yīng)放在專門的運送瓶或試管內(nèi)運送，有時可直接用抽取標(biāo)本的注射器運送。病人標(biāo)本中可能含有大量致病菌，不管標(biāo)本運送距離遠近，都必須注意安全防護。標(biāo)本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必須包裝好，防止送檢過程中倒翻或碰

6、破流出。對于烈性傳染病標(biāo)本運送時更要特別嚴格，必須按規(guī)定包裝，由專人運送。三、微生物檢驗臨床微生物學(xué)實驗室接到標(biāo)本后應(yīng)立即進行微生物檢驗。主要包括直接鏡檢、檢測特異性抗原或病原體成分、進行分離培養(yǎng)和鑒定、體外藥敏試驗等，各種檢查方法的比較見表5-9-1 。表 5-9-1 微生物檢查方法、判斷和速度方法鑒定類型速度直接鏡檢初步診斷5 10min免疫熒光（直接法）快速診斷1 2h乳膠凝集快速診斷15 30min對流免疫電泳快速診斷2h氣 - 液相色譜鑒定1.5 2hPCR快速診斷數(shù)小時DNA探針診斷、鑒定13 天微量鑒定系統(tǒng)鑒定3 6h常規(guī)法確定診斷數(shù)天或以上（一）直接鏡檢標(biāo)本經(jīng)涂片、染色、鏡檢，

7、有些標(biāo)本如尿液、腦脊液等經(jīng)過離心濃縮后鏡檢，其初步結(jié)果對疾病診斷有參考價值。直接鏡檢對于確定進一步檢出步驟及鑒定方法也很有幫助。另外，直接鏡檢還可評價標(biāo)本是否符合檢驗要求。（二）快速診斷快速檢測病原體成分主要是指特異性抗原和核酸檢測。特異性抗原檢測包括免疫熒光技術(shù)、膠乳凝集試驗、酶免疫技術(shù)、對流免疫電泳、化學(xué)發(fā)光測定等。核酸檢測包括核酸雜交、PCR技術(shù)。其他快速檢測法還有氣一液相色譜法、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光測定法和基因或蛋白芯片技術(shù)等。（三）直接藥敏試驗直接藥敏試驗即在分離培養(yǎng)病原體的同時，直接將臨床標(biāo)本接種于平板，用抗生素紙片作藥物敏感性試驗，在 18 24h 內(nèi)可獲得結(jié)果。但因其在試驗時接種

8、量難以標(biāo)準(zhǔn)化，且對混有雜菌和混合感染的標(biāo)本不易明確其結(jié)果，故分離出純培養(yǎng)物后應(yīng)再作體外藥物敏感試驗。（四）常規(guī)檢驗1. 分離培養(yǎng)通常由正常無菌部位采取的標(biāo)本接種血平板，置于空氣或含5%10%CO2的氣缸中培養(yǎng)，大部分細菌可于 24 48h 生長良好。若原始培養(yǎng)為陰性，但據(jù)鏡檢結(jié)果和臨床信息提示可能有病原菌存在，則應(yīng)再采集大量標(biāo)本，離心濃縮或溶解離心法處理，取沉淀接種營養(yǎng)豐富的需氧或厭氧培養(yǎng)基來培養(yǎng)。對于存在正常菌群部位采集的標(biāo)本，分離時應(yīng)采用選擇培養(yǎng)基以利于病原菌生長，也可加某些抗生素抑制污染菌的生長。對于某些感染標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)的細菌，如尿路感染的尿液中檢出大腸埃希菌，可能是病原菌，也可能是污染菌

9、或正常菌群，其臨床意義的確定有賴于定量培養(yǎng)法。分別取0.1ml 涂布于血瓊脂平板或傾注培養(yǎng)， 35 24h 后計算每毫升或每克標(biāo)本所含細菌數(shù)。2. 鑒定分離出的細菌一般應(yīng)經(jīng)過細菌形態(tài)、菌落特點、生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗、動物接種等鑒定。目前尚有某些微量鑒定系統(tǒng)，其鑒定快速、簡便，值得推廣。3. 體外藥物敏感性試驗常用方法包括抑菌試驗、殺菌試驗、聯(lián)合藥敏試驗和檢測細菌產(chǎn)生的抗生素滅活酶等。（五）報告直接鏡檢要求2h 內(nèi)報告，說明標(biāo)本是否合格，發(fā)現(xiàn)微生物的情況和特點；初步鑒定和直接藥敏結(jié)果于24h 或次晨報告，報告可能的病原菌和直接藥敏結(jié)果；最后鑒定和細菌藥敏結(jié)果一般不超過3d，還規(guī)定除血培養(yǎng)外，所有

10、送檢標(biāo)本必須在24h 內(nèi)預(yù)報。四、血清學(xué)診斷用已知抗原檢測病人血清中抗體。人體感染病原體后經(jīng)過一定時間產(chǎn)生特異性抗體，這種抗體在體內(nèi)一般可持續(xù)數(shù)月或更長，故檢測抗體可用于病原體診斷，在作血清學(xué)診斷時，一般要在病程早期和晚期分別采血清標(biāo)本雙份檢查，抗體效價呈4 倍或以上增長才有價值。除非檢測IgM，單份血清一般診斷意義不大。五、臨床微生物實驗室安全措施和質(zhì)量保證（一）實驗室感染來源1. 在檢驗操作過程中的各個環(huán)節(jié)都可能產(chǎn)生危險的微生物氣溶膠。2. 接觸感染材料或使之附著于衣服帶出室外以及其他偶然事故如菌液滴落于物體表面，注射時不慎刺破皮膚等。針對以上感染源，若不進行正當(dāng)防護或及時處理均易引起實驗

11、室感染。故臨床微生物工作者應(yīng)注意個人防護，檢驗時必須穿工作服、戴口罩、帽子，根據(jù)需要戴防護眼鏡和橡膠手套，離去時更衣、洗手。實驗室臺面在工作完畢或被感染材料污染時應(yīng)立即用消毒液處理。（二）感染性廢棄物的處理1. 任何污染材料未經(jīng)消毒不能拿出實驗室。2. 液體廢棄物必須收集在防漏、未破的容器內(nèi)，經(jīng)高濃度的化學(xué)消毒劑處理。3. 對剩余標(biāo)本、接種過的培養(yǎng)基、菌種等丟棄前均需適當(dāng)消毒。4. 動物房的廢物在處理前及動物籠被清洗前均需消毒，最好經(jīng)高壓蒸氣滅菌。5. 對于任何有污染的銳器如針頭、注射器、玻片等在處理前不要用手接觸。（三）微生物實驗室的室內(nèi)質(zhì)控微生物實驗室的室內(nèi)質(zhì)控包括：1. 對細菌檢驗人員的

12、要求；2. 操作手冊；3. 儀器設(shè)備的功能監(jiān)測；4. 培養(yǎng)基的質(zhì)量控制；5. 試劑、染色液以及抗生素的質(zhì)量控制；6. 標(biāo)本檢驗的質(zhì)量控制；7. 標(biāo)準(zhǔn)菌株的來源和保存及室內(nèi)質(zhì)量的全面控制。六、動物試驗（一）動物試驗種類、原理動物實驗主要用于分離和鑒定病原微生物，檢測細菌毒性產(chǎn)物，觀察病原微生物的致病性。常用實驗動物有大鼠、小鼠、豚鼠、家兔及綿羊等。（二）試驗動物選擇原則和動物接種法1. 試驗動物選擇原則選擇合適的試驗動物是十分必要的，主要包括對待試微生物感染敏感性、動物的遺傳種系特征及動物體內(nèi)和體表微生物群鑒定，以及動物年齡、體重、性別和數(shù)量等。進行動物試驗時應(yīng)根據(jù)實際情況選擇敏感動物和選用等級

13、動物。2. 動物接種法主要有皮內(nèi)接種法、皮下接種法、肌肉接種法、靜脈接種法、腹腔接種法和腦內(nèi)接種法。接種后應(yīng)每日觀察 12 次，并按試驗要求作詳細試驗記錄。（三）動物試驗的應(yīng)用1. 分離和鑒定病原菌有些微生物必須通過動物試驗進行分離，如立克次體及某些病毒等，結(jié)核分枝桿菌的致病性也只有動物試驗才能最終確定。2. 細菌毒素檢測用動物試驗檢測細菌毒素是了解病原微生物毒力和致病力的一個重要方面，常用方法有白喉棒狀桿菌毒力試驗、破傷風(fēng)梭菌毒力保護試驗、大腸埃希菌腸毒素檢測。七、免疫檢測技術(shù)微生物學(xué)中常用的免疫檢測技術(shù)包括凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體結(jié)合試驗、免疫熒光技術(shù)、酶免疫測定及皮膚反應(yīng)等。八、發(fā)光分析

14、技術(shù)是依賴酶或化學(xué)反應(yīng)釋放能量引起發(fā)光的檢測方法。具有操作簡便、快速、敏感度高、無污染特點。九、鱟試驗鱟變形細胞溶解物試驗簡稱鱟試驗。其基本原理是內(nèi)毒素可激活鱟試劑中凝固酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟堂?，使凝固蛋白原生成凝固蛋白，產(chǎn)生凝膠。凝膠的形成速度及其堅固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)。鱟試驗陽性表明有革蘭染色陰性菌或內(nèi)毒素血癥，也可用于生物制品或注射液的內(nèi)毒素污染檢測。十、分子生物學(xué)在病原微生物中的應(yīng)用（一）分子生物學(xué)概念分子生物學(xué)是一門從分子水平上研究生物的生命活動及其規(guī)律的科學(xué)，是當(dāng)代生命科學(xué)中的前沿學(xué)科。檢驗醫(yī)學(xué)領(lǐng)域毫無例外地得益于分子生物學(xué)的滲透，利用核酸大分子的遺傳信息庫，為診斷疾病提供了先進技術(shù)。（

15、二）基因診斷概念基因診斷是指應(yīng)用基因工程技術(shù)對生物體的基因組DNA片段及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行定性和定量分析，進而對人體狀態(tài)和疾病作出診斷?；蛟\斷技術(shù)可克服病原微生物的傳統(tǒng)檢測方法靈敏度低、特異性低及速度慢等不足之處，并可用于流行病學(xué)的大量現(xiàn)場篩查工作。習(xí)題不屬于微生物分子生物學(xué)檢測技術(shù)的是A.PCRB.ELISAC. 核酸雜交D. 基因芯片技術(shù)E. 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)正確答案 B答案解析ELISA 是屬于抗原抗體檢測技術(shù)。習(xí)題常用的酸性染料有A. 堿性復(fù)紅B. 結(jié)晶紫C. 亞甲藍D. 伊紅E. 中國藍正確答案D答案解析伊紅是常用的酸性染料。習(xí)題標(biāo)本采集的一般原則不包括A. 早期采集B. 無菌采集C.

16、采集適量標(biāo)本D. 每天清晨采集E. 根據(jù)目的菌的特性選擇采集方法正確答案 D答案解析標(biāo)本采集的一般原則包括：早期采集、無菌采集、采集適量標(biāo)本、根據(jù)目的菌的特性選擇采集方法。習(xí)題微生物診斷試驗的選擇，正確的是A. 選擇有鑒定價值的試驗B. 只要快速、簡易即可C. 選擇多種特異性試驗D. 選擇高特異性試驗E. 選擇高敏感性試驗正確答案 A答案解析微生物診斷試驗要選擇有鑒定價值的試驗。習(xí)題一般標(biāo)本采集后最好幾小時內(nèi)送到實驗室A.1hB.2hC.3hD.4hE.5h正確答案B答案解析一般標(biāo)本采集后最好2h 內(nèi)送到實驗室。習(xí)題一般情況下，用于細菌培養(yǎng)的標(biāo)本保存時間不應(yīng)超過多少小時A.2hB.6hC.12hD.24hE.48h正確