載體系統(tǒng)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1第第2頁頁/共共65頁頁第1頁/共65頁第第3頁頁/共共65頁頁第2頁/共65頁第第4頁頁/共共65頁頁第3頁/共65頁單鏈切割單鏈切割連接單鏈切割單鏈切割連接共價閉合環(huán)形DNA（scDNA型）開環(huán)DNA（ocDNA）線性DNA（cccDNA）環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNADNA分子具有三種不同構(gòu)型分子具有三種不同構(gòu)型第第5頁頁/共共65頁頁第4頁/共65頁第第6頁頁/共共65頁頁第5頁/共65頁第第7頁頁/共共65頁頁第6頁/共65頁第第8頁頁/共共65頁頁第7頁/共65頁第第9頁頁/共共65頁頁第8頁/共65頁 轉(zhuǎn)化（transformation）： 是將異源DNA分子引入另一

2、細(xì)胞品系， 使受體細(xì)胞獲得新遺傳性狀的一種手段。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌常用方法：熱激法、電擊法 第第10頁頁/共共65頁頁第9頁/共65頁1.2.1 兩個概念兩個概念克隆載體克隆載體(cloning vector) : 使目的片段能在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制的載體使目的片段能在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制的載體;表達(dá)載體（表達(dá)載體（Expression Vector ）: 使目的基因能在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)為使目的基因能在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)為RNA或蛋白或蛋白質(zhì)的載體。質(zhì)的載體。第第11頁頁/共共65頁頁第10頁/共65頁（1 1）具有復(fù)制起點）具有復(fù)制起點（2 2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（3 3）具有若干限制酶單一識別

3、位點）具有若干限制酶單一識別位點（4 4）具有較小的相對分子質(zhì)量和較高）具有較小的相對分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)。的拷貝數(shù)。第第12頁頁/共共65頁頁第11頁/共65頁第第13頁頁/共共65頁頁第12頁/共65頁 1.2.4 天然質(zhì)粒用作載體的局限性天然質(zhì)粒用作載體的局限性天然質(zhì)天然質(zhì) 粒粒 相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量拷貝數(shù)拷貝數(shù)單一酶切位點單一酶切位點選擇性標(biāo)記選擇性標(biāo)記復(fù)制類型復(fù)制類型pSC1015.81069.09 kb13EcoR Itetr嚴(yán)緊嚴(yán)緊ColE14.210620EcoR I大腸桿菌素大腸桿菌素松弛松弛RSF21247.410610EcoR I (BamH I)ampr松弛松弛局

4、限性：局限性：分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位點少、位點少、選擇標(biāo)記不合適選擇標(biāo)記不合適第第14頁頁/共共65頁頁第13頁/共65頁常用的選擇標(biāo)記：常用的選擇標(biāo)記： 抗氨芐青霉素、抗四環(huán)素、抗氯霉素和抗卡那抗氨芐青霉素、抗四環(huán)素、抗氯霉素和抗卡那霉素等基因。霉素等基因。選擇標(biāo)記的應(yīng)用：選擇標(biāo)記的應(yīng)用： 利用質(zhì)粒編碼的可選擇標(biāo)記產(chǎn)物選擇目標(biāo)菌落。利用質(zhì)粒編碼的可選擇標(biāo)記產(chǎn)物選擇目標(biāo)菌落。第第15頁頁/共共65頁頁第14頁/共65頁第第16頁頁/共共65頁頁第15頁/共65頁pBR322質(zhì)粒載體的形體圖質(zhì)粒載體的形體圖第第17頁頁/共共65頁頁第16頁/共65

5、頁pBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來源質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來源TetrAmprOri第第18頁頁/共共65頁頁第17頁/共65頁pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點：質(zhì)粒載體的優(yōu)點： 具有較小的相對分子質(zhì)量具有較小的相對分子質(zhì)量(4363bp) 具有兩種抗菌素抗性基因可供作具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號轉(zhuǎn)化子的選擇記號(Ampr和和Tetr) 具有較高的拷貝數(shù)（具有較高的拷貝數(shù)（15個個,松弛型）松弛型）第第19頁頁/共共65頁頁第18頁/共65頁DNA連接酶連接酶pBR322質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體tetr基因插入失活效應(yīng)基因插入失活效應(yīng)第第20頁頁/共共65頁頁第19頁/共65頁第第21頁頁/共共65頁頁

6、第20頁/共65頁pUC18pUC19含四個部分：含四個部分：（1）來自）來自pBR322的質(zhì)粒的質(zhì)粒復(fù)制起點（復(fù)制起點（ori）；）；（2）ampr ; （3）大腸桿菌大腸桿菌半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因（基因（lacZ）的啟動子及）的啟動子及其編碼其編碼-肽鏈的肽鏈的DNA序列；序列；（4）多克隆位點）多克隆位點（MCS）lacZOriAmprMCS第第22頁頁/共共65頁頁第21頁/共65頁 Blue WhiteampramprInsertInsertNo insertLac ZLac Z第第23頁頁/共共65頁頁第22頁/共65頁 具更小的分子質(zhì)量具更小的分子質(zhì)量(2.69kb)(2.69

7、kb)和更和更 高的拷貝數(shù)高的拷貝數(shù)(500 - 700(500 - 700個個) ) 適于組織化學(xué)方法檢測重組體適于組織化學(xué)方法檢測重組體 具多克隆位點具多克隆位點MCSMCS區(qū)段區(qū)段第第24頁頁/共共65頁頁第23頁/共65頁1.5 穿梭質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體（shuttle plasmid vector） 是一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制是一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點和選擇記號，因而可在兩種不同的寄起點和選擇記號，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。第第25頁頁/共共65頁頁第24頁/共65頁大腸桿菌大腸桿菌- -釀酒酵母釀酒酵母穿梭質(zhì)

8、粒載體穿梭質(zhì)粒載體第第26頁頁/共共65頁頁第25頁/共65頁第第27頁頁/共共65頁頁第26頁/共65頁能能在在體體外外轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄克克隆隆基基因因的的質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體第第28頁頁/共共65頁頁第27頁/共65頁（1 1）不穩(wěn)定性類型）不穩(wěn)定性類型 分離不穩(wěn)定性分離不穩(wěn)定性 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性（2 2）影響穩(wěn)定性主要因素）影響穩(wěn)定性主要因素 新陳代謝負(fù)荷新陳代謝負(fù)荷 拷貝數(shù)差度拷貝數(shù)差度第第29頁頁/共共65頁頁第28頁/共65頁2.1 噬菌體的結(jié)構(gòu)及其核酸類型2.2 噬菌體的生命周期2.3 噬菌體載體2.4 M13噬菌體載體第第30頁頁/共共65頁頁第29頁/共65頁2.1 2.1 噬菌

9、體的結(jié)構(gòu)及其核酸類型噬菌體的結(jié)構(gòu)及其核酸類型 不同種類的噬菌體顆粒，在結(jié)構(gòu)上有很大差別。不同種類的噬菌體顆粒，在結(jié)構(gòu)上有很大差別。 三種不同基本類型：三種不同基本類型： 無尾部的二十面體型無尾部的二十面體型 具尾部的二十面體型（大多數(shù)噬菌的構(gòu)形）具尾部的二十面體型（大多數(shù)噬菌的構(gòu)形） 線狀體型線狀體型第第31頁頁/共共65頁頁第30頁/共65頁T2噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖第第32頁頁/共共65頁頁第31頁/共65頁 第第33頁頁/共共65頁頁第32頁/共65頁2.2 2.2 噬菌體的生命周期噬菌體的生命周期（1 1）溶菌生長周期噬菌體（烈性噬菌體）溶菌生長周期噬菌體（烈性噬菌體）（2

10、2）溶源生長周期噬菌體（溫和噬菌體）溶源生長周期噬菌體（溫和噬菌體）第第34頁頁/共共65頁頁第33頁/共65頁（1）烈性噬菌體的生活周期）烈性噬菌體的生活周期第第35頁頁/共共65頁頁第34頁/共65頁E.coli T4E.coli T4噬菌體的生命周期（以分鐘記）噬菌體的生命周期（以分鐘記）第第36頁頁/共共65頁頁第35頁/共65頁裂解循裂解循環(huán)環(huán)溶源態(tài)溶源態(tài)（2）溫和噬菌體）溫和噬菌體的生活周期的生活周期第第37頁頁/共共65頁頁第36頁/共65頁cI OR PR PL OL基因基因早期左向轉(zhuǎn)錄早期左向轉(zhuǎn)錄早期右向轉(zhuǎn)錄早期右向轉(zhuǎn)錄基因基因噬菌體的阻遏噬菌體的阻遏-操縱基因系統(tǒng)操縱基因系

11、統(tǒng)CI=阻遏基因；阻遏基因； P=啟動子；啟動子；O=操縱基因；操縱基因；L=左向；左向；R=右向右向注：注：cI基因和基因和cro基因編碼的蛋白質(zhì)，同兩個操縱基因（基因編碼的蛋白質(zhì)，同兩個操縱基因（OL， OR）之間的相互作用決定是發(fā)生溶菌反應(yīng)還是溶源反應(yīng)，如這兩個操之間的相互作用決定是發(fā)生溶菌反應(yīng)還是溶源反應(yīng)，如這兩個操縱基因都已擺脫了阻遏狀態(tài)，則進(jìn)入溶菌周期?？v基因都已擺脫了阻遏狀態(tài)，則進(jìn)入溶菌周期。第第38頁頁/共共65頁頁第37頁/共65頁2.3 2.3 噬菌體載體噬菌體載體第第39頁頁/共共65頁頁第38頁/共65頁2.3.1 噬菌體的分子生物學(xué)概述 噬菌體顆粒中的噬菌體顆粒中的D

12、NADNA是一線性雙鏈?zhǔn)且痪€性雙鏈DNADNA分分子，長子，長48 502bp48 502bp，兩端各有，兩端各有1212個堿基的個堿基的55凸出黏性末端是互補的。進(jìn)入細(xì)胞的凸出黏性末端是互補的。進(jìn)入細(xì)胞的DNADNA通過兩端的黏性末端環(huán)化。通過兩端的黏性末端環(huán)化。 噬菌體上有些基因可被取代而不影響其噬菌體上有些基因可被取代而不影響其生活周期。生活周期。第第40頁頁/共共65頁頁第39頁/共65頁第第41頁頁/共共65頁頁第40頁/共65頁第第42頁頁/共共65頁頁第41頁/共65頁噬菌體噬菌體DNADNA的核酸內(nèi)切限制酶的限制圖（的核酸內(nèi)切限制酶的限制圖（KbKb）第第43頁頁/共共65頁頁

13、第42頁/共65頁第第44頁頁/共共65頁頁第43頁/共65頁第第45頁頁/共共65頁頁第44頁/共65頁第第46頁頁/共共65頁頁第45頁/共65頁第第47頁頁/共共65頁頁第46頁/共65頁第第48頁頁/共共65頁頁第47頁/共65頁第第49頁頁/共共65頁頁第48頁/共65頁注意：噬菌載體作為載體，其重組噬菌體DNA大小只能： 38kb 52kb。體外包裝：噬菌載體 + 尾部蛋白 + 頭部蛋白 第第50頁頁/共共65頁頁第49頁/共65頁第第51頁頁/共共65頁頁第50頁/共65頁第第52頁頁/共共65頁頁第51頁/共65頁pHC796.4 kb柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體pHC79的形體圖

14、的形體圖由由pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒DNA與與噬菌體噬菌體DNA的的cos位點及其控制位點及其控制包裝作用的序列構(gòu)成包裝作用的序列構(gòu)成第第53頁頁/共共65頁頁第52頁/共65頁部分柯斯質(zhì)粒的基本特性部分柯斯質(zhì)粒的基本特性第第54頁頁/共共65頁頁第53頁/共65頁（4）具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重）具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。組的能力。廣泛應(yīng)用于基因組廣泛應(yīng)用于基因組DNA文庫的文庫的構(gòu)建。構(gòu)建。第第55頁頁/共共65頁頁第54頁/共65頁第第56頁頁/共共65頁頁第55頁/共65頁(如如EcoR I)38kb52kb應(yīng)用柯斯質(zhì)粒作載體構(gòu)建基因組文庫的一般程序應(yīng)用柯斯質(zhì)粒作載體構(gòu)建基因組文庫的

15、一般程序第第57頁頁/共共65頁頁第56頁/共65頁 由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型載體系列，稱為噬菌合而成的新型載體系列，稱為噬菌粒（粒（phagemid或或phasmid）第第58頁頁/共共65頁頁第57頁/共65頁噬菌粒噬菌粒質(zhì)粒質(zhì)粒單鏈?zhǔn)蓡捂準(zhǔn)删w菌體輔助噬菌體輔助噬菌體 大腸桿菌大腸桿菌寄主菌株寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101VXM13M13變異株變異株 XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue幾種常用的噬菌粒載體的

16、一般特征幾種常用的噬菌粒載體的一般特征第第59頁頁/共共65頁頁第58頁/共65頁pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和和pUC119噬菌粒載噬菌粒載體的分子體的分子結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)第第60頁頁/共共65頁頁第59頁/共65頁（1）無輔助噬菌體時）無輔助噬菌體時pUC118/pUC119的復(fù)制的復(fù)制親本親本pUC質(zhì)質(zhì)粒粒（2）有輔助噬菌體時）有輔助噬菌體時pUC118/pUC119的復(fù)制的復(fù)制M13輔助噬菌體的基因組輔助噬菌體的基因組pUC118/pUC119噬菌粒載體的兩種復(fù)制模噬菌粒載體的兩種復(fù)制模型型第第61頁頁/共共65頁頁第60頁/共65頁第第62頁頁/共共65頁頁第61頁/共65頁(8)(8) 可直接對克隆的基因進(jìn)行核苷可直接對克隆的基因進(jìn)行核苷酸測序。酸測序。第第63頁頁/共共65頁頁第62頁/共65頁(yeast artificial chromosome, YAC) 真核生物染色體的幾個最為重要的部位：真核生物染色體的幾個最為重要的部位： 端粒重復(fù)序列端粒重復(fù)序列（telomeric repeat ， TEL） 著絲粒著絲粒（centromere ， CEN） 自主復(fù)制序列自主復(fù)制序列（autonomously replication