自動生化分析技術(shù)教材

1、第五章 自動生化分析儀思考題： 1自動生化分析儀有哪些主要類型?其未來的發(fā)展趨勢是什么? 2分立式自動生化分析儀的主要結(jié)構(gòu)及各自的功能是什么? 3終點(diǎn)法的原理是什么?兩點(diǎn)終點(diǎn)法有什么優(yōu)點(diǎn)?固定時間法用來解決分析中的哪些問題？ 4連續(xù)監(jiān)測法的原理是什么?理論K值、實(shí)測K值和校準(zhǔn)K值分別是什么含義? 5干式生化分析儀的檢測原理及特點(diǎn)是什么? 6自動生化分析儀有哪些重要的參數(shù)? 7自動生化分析儀的校準(zhǔn)包括哪些內(nèi)容?8自動生化分析儀有哪些主要的操作?怎樣做好室內(nèi)質(zhì)控和報告審核?什么是危急值? 隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，用于疾病診斷的生物化學(xué)指標(biāo)越來越多，隨著實(shí)驗(yàn)室的樣本量大幅度增加，傳統(tǒng)的手工法在檢測速度和檢測

2、準(zhǔn)確度、靈敏度方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需求。隨著1957年第一臺自動生化分析儀的問世，生化檢驗(yàn)邁開了其自動化、智能化的步伐。經(jīng)過近60年的發(fā)展，臨床實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)逐步建立從采血管理、樣本運(yùn)輸、樣本準(zhǔn)備到樣本檢測、結(jié)果計算、數(shù)據(jù)傳輸和處理、檢驗(yàn)報告打印，再到檢測后樣本的保存和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總分析等幾乎所有環(huán)節(jié)的自動化，大大提高了工作效率，穩(wěn)定了檢驗(yàn)質(zhì)量。第一節(jié) 概 述 最初的生化檢驗(yàn)自動化分析只是用自動生化分析儀代替了人工加樣、加試劑、保溫、比色測定的工作，后來逐步向前期樣本準(zhǔn)備、受檢者信息錄入和后期檢測數(shù)據(jù)分析處理等領(lǐng)域發(fā)展，這就對實(shí)驗(yàn)室管理提出了新的要求，實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。所以，完整的生化自動化分

3、析系統(tǒng)不僅包括各種自動化儀器，還包括實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)通訊和數(shù)據(jù)庫技術(shù)。 一、自動生化分析技術(shù)的發(fā)展 (一)自動生化分析儀的主要類型 自動生化分析儀(automatic biochemical analyzer)是自動生化檢測系統(tǒng)最重要的組成部分。第一臺自動生化分析儀為單通道、連續(xù)流動式，只能以吸光度值形式報告結(jié)果，后來各種各樣的生化分析儀相繼發(fā)展，又出現(xiàn)了分立式、離心式和干化學(xué)式自動生化分析儀。目前臨床實(shí)驗(yàn)室主要使用分立式自動生化分析儀，干化學(xué)式分析儀普遍用于急診等領(lǐng)域。近十余年，廠商還研制生產(chǎn)了分析前自動化處理模塊和分析后自動化處理模塊，對生化檢驗(yàn)實(shí)現(xiàn)全程自動化。 (二)實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng) 實(shí)驗(yàn)室信息

4、系統(tǒng)(1aboratory information system，LIS)是借助計算機(jī)技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)、數(shù)字化與智能化技術(shù)等現(xiàn)代技術(shù)手段，對臨床實(shí)驗(yàn)室內(nèi)樣本信息和各種自動化儀器運(yùn)行信息進(jìn)行收集、處理、存儲、輸送、分析、應(yīng)用的綜合管理系統(tǒng)。LIS使實(shí)驗(yàn)室各獨(dú)立單元之間建立起聯(lián)系，使各種信息在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行傳輸和共享，提高了實(shí)驗(yàn)室的綜合效能。LIS往往與醫(yī)院信息系統(tǒng)(hospital information system，HIS)連接，它能夠配合醫(yī)生、護(hù)士工作站，完成檢驗(yàn)申請、樣本采集管理、樣本核收、檢驗(yàn)報告?zhèn)鬏數(shù)裙δ?，使?shí)驗(yàn)室信息更好更快地服務(wù)于臨床。 (三)自動生化分析技術(shù)帶來的變革 1提高臨床實(shí)

5、驗(yàn)室技術(shù)和管理水平 充分發(fā)揮條形碼技術(shù)及LIS的優(yōu)勢，減少人工操作環(huán)節(jié)，降低差錯率；調(diào)整工作流程，既極大地減輕了勞動強(qiáng)度，提高工作效率，降低人力成本，又實(shí)現(xiàn)了檢驗(yàn)過程的標(biāo)準(zhǔn)化，提高了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；優(yōu)化管理模式，實(shí)現(xiàn)對儀器設(shè)備、試劑耗材成本、數(shù)據(jù)資料等的全面監(jiān)督和控制。 2降低實(shí)驗(yàn)室的生物安全風(fēng)險 檢驗(yàn)過程的自動化減少了檢驗(yàn)技術(shù)人員與樣本和試劑直接接觸的頻率，有效避免了對操作者污染的機(jī)會。樣本和試劑在儀器內(nèi)部吸取和操作也減少了對環(huán)境的污染。 3提升實(shí)驗(yàn)室的服務(wù)水平 可實(shí)施樣本分杯來減少患者的用血量，同時也降低了傳統(tǒng)多管檢測的成本；檢驗(yàn)速度大大提高，縮短了患者候診時間；患者同等檢驗(yàn)費(fèi)用得到高質(zhì)

6、量的醫(yī)療服務(wù)。 (四)發(fā)展趨勢 自動生化分析儀已經(jīng)在全國大多數(shù)醫(yī)院得到普及應(yīng)用，基本實(shí)現(xiàn)了生物化學(xué)檢驗(yàn)的自動化。但隨著某些大型醫(yī)院檢驗(yàn)?zāi)芰Φ奶岣撸_展的檢驗(yàn)項(xiàng)目種類繁多，樣本量巨大，單個的儀器已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床對分析速度和服務(wù)質(zhì)量的要求。20世紀(jì)90年代中期，儀器制造商推出模塊式生化分析系統(tǒng)，將兩臺或兩臺以上的分析模塊組合在一起，這些分析模塊包含了分光光度法、離子選擇電極法的生化分析模塊和免疫比濁法、免疫化學(xué)發(fā)光法的免疫分析模塊，各分析模塊既有各自獨(dú)立的控制系統(tǒng)又有共用的控制系統(tǒng)，樣本通過傳送帶在各模塊之間進(jìn)行傳遞并完成所有項(xiàng)目的測定。目前，生化檢驗(yàn)正向自動化程度更高的全實(shí)驗(yàn)室自動化(tot

7、al laboratory automation，TLA)方向發(fā)展。TLA將樣本前處理系統(tǒng)、樣本運(yùn)送系統(tǒng)、樣本分析系統(tǒng)(血細(xì)胞系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、生化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等)串聯(lián)起來，組成流水線，再加上LIS和計算機(jī)硬件，形成大規(guī)模的全檢驗(yàn)過程的自動化。但建設(shè)TLA系統(tǒng)所需費(fèi)用非常昂貴，對場地的要求也很高，且不同廠家的自動化儀器往往執(zhí)行不同的電子、通信標(biāo)準(zhǔn)及機(jī)械界面協(xié)議，給TLA的系統(tǒng)整合帶來諸多困難。美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI)和國際臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(ICCLS)正在致力于實(shí)驗(yàn)室自動化標(biāo)準(zhǔn)的研制。 由于自動生化分析技術(shù)的核心是自動生化分析儀，故本章的主要內(nèi)容介紹自動生化分析儀的結(jié)構(gòu)、原理、

8、檢測方法、校準(zhǔn)程序和操作流程等。二、分立式自動生化分析儀的結(jié)構(gòu)與功能 分立式自動生化分析儀(discrete automatic biochemical analyzer)是按人工操作的方式編排程序，并以有序的機(jī)械操作代替手工操作，按程序依次完成加樣、加試劑、攪拌、反應(yīng)杯保溫孵育、吸光度檢測等各項(xiàng)操作。儀器由樣本和試劑處理系統(tǒng)、反應(yīng)系統(tǒng)、測定系統(tǒng)、清洗系統(tǒng)和計算機(jī)控制系統(tǒng)組成(圖5-1)。圖5-1 分立式自動生化分析儀的基本結(jié)構(gòu) (一)樣本和試劑處理系統(tǒng) 1樣本盤或樣本架 儀器放置樣本的方式有樣本盤和樣本架。樣本盤為圓盤狀，盤上有一圈或兩圈放置采血管或樣本杯的插孔，通過轉(zhuǎn)動控制不同樣本到特定位

9、置取樣。而樣本架類似于試管架，放置樣本后經(jīng)傳送帶運(yùn)送到特定位置進(jìn)樣。一臺分析儀配有許多樣本架，并可按顏色區(qū)分常規(guī)樣本、急診樣本、校準(zhǔn)樣本等，方便使用。采血管或樣本杯外壁可貼上包含樣本信息的條形碼，儀器即能讀取樣本信息如編號、患者資料、樣本類型、檢測項(xiàng)目等。 2試劑盤和試劑瓶 試劑盤跟樣本盤一樣為圓盤狀，安裝在具有冷藏功能的試劑倉內(nèi)。試劑盤可放置一定形狀的試劑瓶，不同分析儀試劑瓶的容量和形狀不同。試劑盤轉(zhuǎn)動使試劑瓶到達(dá)特定的位置吸取試劑。也有試劑倉按試劑架形式設(shè)計，放置大容量任意形狀的試劑瓶，試劑瓶不能轉(zhuǎn)動，但由每個試劑瓶內(nèi)引出一條試劑管路及其噴嘴，因而不同試劑間無交叉污染。大型分析儀通常有第一

10、和第二試劑倉，便于對同一檢測項(xiàng)目添加兩次試劑，個別分析儀還具有加入第三試劑的功能。 3取液裝置 樣本和試劑的吸取由帶定量吸液器和樣品針或試劑針的機(jī)械臂完成，根據(jù)計算機(jī)指令，機(jī)械臂轉(zhuǎn)動到指定樣本或試劑處，由吸液器準(zhǔn)確吸取，加入到反應(yīng)杯中。樣品針和試劑針具有多種功能：液面感應(yīng)功能，自動感應(yīng)液面水平，調(diào)整試劑針和樣品針下降的高度，還具有檢測試劑瓶中試劑剩余量的作用；樣本量不足時有些分析儀會報警，提示哪些項(xiàng)目未能檢測。防撞功能，遇到障礙時自動停止運(yùn)動并報警，避免損傷操作者和損壞機(jī)械臂。阻塞報警功能，當(dāng)樣品針遇到凝血塊等物質(zhì)阻塞時，儀器會報警、沖洗樣品針，并跳過當(dāng)前樣本對下一個樣本加樣。取液系統(tǒng)采取空氣

11、隔絕、清洗劑清洗、化學(xué)惰性液和去離子水沖洗等措施防止交叉污染，以去離子水沖洗最多見。 (二)反應(yīng)系統(tǒng) 1反應(yīng)盤和反應(yīng)杯 反應(yīng)盤為擱置反應(yīng)杯的圓盤狀裝置，檢測過程中做恒速圓周運(yùn)動，轉(zhuǎn)動到特定位置時短暫停止，在反應(yīng)杯中加入樣本、試劑或進(jìn)行攪拌混勻。反應(yīng)杯由透光性好的石英玻璃、硬質(zhì)玻璃或丙烯酸塑料制成，容量為80500ul不等，是樣本與試劑進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的場所。反應(yīng)杯同時用作比色杯，每完成一次比色分析后儀器自動反復(fù)沖洗、吸干、空白檢測，空白吸光度合格的比色杯可循環(huán)使用，不合格時儀器自動報警，提示更換比色杯。 2混勻裝置 在反應(yīng)杯中加入樣本與試劑后儀器自動混勻?；靹虻姆绞接袡C(jī)械振動、攪拌和超聲混勻等，目

12、前多采用攪拌方式，攪拌棒形狀為扁平棒狀或扁平螺旋狀，外表面的疏水材料能防止攜帶反應(yīng)液。超聲混勻可杜絕攜帶污染，極大程度減少泡沫產(chǎn)生。 3恒溫裝置 自動生化分析儀通過溫度控制系統(tǒng)使比色杯保持在恒定的溫度，生化反應(yīng)一般按照人體溫度設(shè)置在37，但某些分析儀也能提供有特殊需求的30和25，溫度波動不大于±O1。保持恒溫的方式有三種：水浴，即在比色杯周圍充盈有水，加熱器控制水溫，優(yōu)點(diǎn)是溫度均勻穩(wěn)定，缺點(diǎn)是需加防腐劑來保持水的潔凈，并要定期更換和清洗；空氣浴，即由加熱器加熱比色杯周圍的空氣，保養(yǎng)簡單，升溫快，但溫度的穩(wěn)定性和均勻性不太好；恒溫液循環(huán)間接加熱法，恒溫液采用不易蒸發(fā)的惰性液體，比色杯

13、與恒溫液之間有極小的空氣狹縫，恒溫液將縫隙的空氣加熱，溫度穩(wěn)定、均勻，不需要特殊保養(yǎng)，但恒溫液成本較高。 (三)測定系統(tǒng) 1光路系統(tǒng) 由光源、比色杯和分光元件(濾光片、棱鏡或光柵)等組成。理想的光源應(yīng)在檢測波長范圍內(nèi)產(chǎn)生恒定強(qiáng)度的光，噪聲低，不需預(yù)熱，長期穩(wěn)定。目前多數(shù)生化分析儀采用鹵鎢燈作為光源，工作波長為325850nm，在部分紫外區(qū)和整個可見光范圍內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的連續(xù)光譜，噪聲低，漂移小，但使用壽命較短，一般只有10001500小時。部分儀器采用氙燈，工作波長為28575Onm，因其為冷光源，壽命長，24小時開機(jī)可工作數(shù)年。比色杯(反應(yīng)杯)光徑為O.51cm，光徑小的節(jié)省試劑、減少樣本用量。

14、分光元件(多采用光柵)將復(fù)合光分解為單色光，生化分析儀按生化檢測項(xiàng)目的光譜分析要求，不同品牌的分析儀在340850nm范圍內(nèi)選擇1O16種固定的單色光。光柵分光方式有前分光和后分光兩種，前分光的光路系統(tǒng)為：光源分光元件單色光反應(yīng)液信號檢測器。后分光光路系統(tǒng)為：光源反應(yīng)液分光元件單色光信號檢測器，分光后取該分析儀所有的固定單色光同時通過各自的信號傳送通路(如光導(dǎo)纖維)傳輸?shù)綄?yīng)的信號檢測器。目前儀器多采用后分光，其優(yōu)點(diǎn)是可同時選用雙波長或多波長進(jìn)行測定，這樣可降低雜散光的干擾，提高檢測精度；同時，不需移動任何部件，減少故障率。 2信號檢測器 光路系統(tǒng)產(chǎn)生的光信號由信號檢測器接收，轉(zhuǎn)換成電信號并加

15、以放大，再通過模數(shù)轉(zhuǎn)換電路將模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，傳送到微處理器，后者按各測定項(xiàng)目的分析參數(shù)選擇其中一個(單波長)或兩個波長(雙波長)的吸光度值，用于計算樣本結(jié)果。 (四)清洗系統(tǒng) 在檢測過程中，樣品針、試劑針和攪拌棒在用于下一個樣品、試劑或反應(yīng)杯前都要進(jìn)行清洗，多數(shù)為去離子水沖洗。在完成一批樣本的檢測后，則自動使用清洗劑徹底清洗。分析儀也有比色杯沖洗裝置，反應(yīng)杯在完成一次化學(xué)反應(yīng)和吸光度檢測后被清洗，具體步驟是：由廢液針吸走反應(yīng)杯內(nèi)廢液，加入清洗劑洗滌并抽干，再經(jīng)數(shù)次去離子水沖洗、抽干，然后做該空白杯的吸光度檢查，若通過檢查則此反應(yīng)杯可繼續(xù)循環(huán)使用。每一步清洗都非常重要，其效果直接影響檢測

16、的準(zhǔn)確度。 (五)計算機(jī)控制系統(tǒng) 自動生化分析儀配置的計算機(jī)具有多種處理功能，包括自動開關(guān)機(jī)、系統(tǒng)自檢、樣本和試劑識別、分析測定、結(jié)果計算、數(shù)據(jù)儲存和輸出、自動維護(hù)和保養(yǎng)等功能。部分操作系統(tǒng)固化了檢測程序，所有參數(shù)均無法更改，也有部分操作系統(tǒng)采用開放式設(shè)計，用戶可自行設(shè)置分析參數(shù)，故可根據(jù)自己的需求選擇試劑，以及在分析儀上增加一些新項(xiàng)目。三、干化學(xué)式生化分析儀的結(jié)構(gòu)和功能 干化學(xué)式生化分析儀(dry chemistry automatic biochemical analyzer)與配套干片試劑組成一個檢測系統(tǒng)，采用的是干化學(xué)分析技術(shù)，即將生化檢測所需的試劑固定在具有多層復(fù)合膜結(jié)構(gòu)的載體上，形

17、成固相試劑，稱為干片試劑。在干片試劑上滴加液態(tài)樣本，樣本中的水將固化于載體上的試劑溶解，再與樣本中的待測成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 1干化學(xué)式生化分析儀主要結(jié)構(gòu) 其主要結(jié)構(gòu)包括取樣裝置、干片試劑、恒溫裝置、檢測系統(tǒng)、計算機(jī)控制系統(tǒng)。儀器的檢測原理多為反射光光度法、熒光反射光度法和差式電位法，靈敏度和準(zhǔn)確性達(dá)到甚至優(yōu)于分立式自動生化分析儀，在使用時不需配制試劑，而是使用廠家已經(jīng)配備好的干片試劑，操作簡便，速度快。 2干片試劑的基本結(jié)構(gòu) 干片試劑最早只有簡單的二層膜，后來改進(jìn)為三層膜，目前發(fā)展至比較完善的多層膜。多層膜按檢測原理分為三種類型：基于反射光度法的多層膜、基于差示電位法的離子選擇電極多層膜、基于

18、熒光技術(shù)和競爭免疫技術(shù)的熒光反射多層膜。多層膜的基本結(jié)構(gòu)是：下層為支持層，為承載和支持功能；上層為擴(kuò)散層，能使標(biāo)本均勻分布，并過濾大分子，將溶血、脂血及膽紅素血的干擾降到最低；中間各層根據(jù)檢測原理不同分別固定多種試劑或熒光標(biāo)記的抗體或抗原，或離子選擇性電極及電極液等(圖5-2)。圖5-2干片試劑模式圖 3干化學(xué)式生化分析儀的獨(dú)特性能 干化學(xué)式生化分析儀具有很多獨(dú)特的性能。首先，一次性吸樣頭的使用有效避免濕化學(xué)中使用同一樣品針帶來的樣本間攜帶污染，試劑固定在干片上避免因加樣帶來的試劑間的交叉污染，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，并使所需硬件設(shè)施變得簡單，不需使用去離子水，儀器還省去了裝載試劑、比色杯、攪

19、拌器、沖洗等裝置，讓管路系統(tǒng)變得簡單，提高了分析速度。其次，干化學(xué)式生化分析儀由于結(jié)構(gòu)較為簡單，其保養(yǎng)維護(hù)工作也簡單了很多；同時無廢液排出，具有高環(huán)保節(jié)能效果。最重要的特性是能夠消除可能干擾目標(biāo)化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)，所有干片試劑都有濾出大分子蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的能力，還有一些干片試劑增加了額外的過濾步驟，能消除維生素C等對化學(xué)反應(yīng)的干擾。但是，由于干片試劑對環(huán)境要求比較高，尤其是空氣的溫度和濕度對檢測結(jié)果影響很大，而且干化學(xué)試劑成本相對要高很多，因此，目前多用于大、中型醫(yī)院的門診和急診。第二節(jié) 自動生化分析儀常用分析方法 實(shí)驗(yàn)室普遍使用的分立式自動生化分析儀其分析方法仍然是基于常規(guī)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基本方法

20、。除離子選擇電極模塊外，化學(xué)模塊的檢測系統(tǒng)分別采用分光光度法和透射比濁法分析待測物濃度，其反應(yīng)模式包括終點(diǎn)法(平衡法)和連續(xù)監(jiān)測法，各自又可分為吸光度升高的正向反應(yīng)和吸光度下降的負(fù)向反應(yīng)，固定時間法可以看成終點(diǎn)法的特殊形式。 一、終點(diǎn)法樣本中待測物與試劑發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)生成系統(tǒng)可檢測的產(chǎn)物，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時產(chǎn)物不再增加，吸光度不改變，根據(jù)平衡點(diǎn)吸光度的大小即能算出被測物濃度，這種方法稱為終點(diǎn)法(end assay)。圖5-3是終點(diǎn)法的時間吸光度曲線。多數(shù)化學(xué)反應(yīng)利用產(chǎn)物在某一波長處具有很強(qiáng)的光吸收，隨反應(yīng)的進(jìn)行吸光度升高，到終點(diǎn)時吸光度達(dá)到最大，稱為正向終點(diǎn)法；少數(shù)被測物本身在某波長處具有光

21、吸收，經(jīng)化學(xué)反應(yīng)后隨著被測物的消耗吸光度下降，稱為負(fù)向終點(diǎn)法，如氧化法測定血清膽紅素。終點(diǎn)法參數(shù)設(shè)置簡單，反應(yīng)時間較長，精密度較好。 圖5-3終點(diǎn)法附閩。吸光度曲線 1一點(diǎn)終點(diǎn)法 一點(diǎn)終點(diǎn)法(one point end assay)在反應(yīng)達(dá)到平衡時選擇一個測光點(diǎn)的吸光度計算待測物濃度。例如，選取圖5-3中反應(yīng)達(dá)到平衡后的某點(diǎn)作為測光點(diǎn)，則待測物濃度的計算公式為：Cu=Au×CsAsAu×K，式中Cu、Cs分別為待測物和標(biāo)準(zhǔn)液(校準(zhǔn)液)濃度，Au、As分別為待測物和標(biāo)準(zhǔn)液終點(diǎn)吸光度值。K為校準(zhǔn)系數(shù)。臨床常用于測定總蛋白、白蛋白等的濃度。 2兩點(diǎn)終點(diǎn)法 兩點(diǎn)終點(diǎn)法(two po

22、int end assay)常應(yīng)用于具有雙試劑的測定項(xiàng)目中。第一試劑(R1)通常只含緩沖液等成分，它與樣本一般不起特異性反應(yīng)，因此在第二試劑(R2)加入前，選擇某個時間點(diǎn)作為第一個測光點(diǎn)，此時的吸光度相當(dāng)于樣本空白(Am)。加入第二試劑后待測物開始反應(yīng)，并經(jīng)過一定時間反應(yīng)達(dá)到平衡，此時選擇第二個測光點(diǎn)測定吸光度(An)，兩個測光點(diǎn)吸光度之差用于計算待測物濃度，稱為兩點(diǎn)終點(diǎn)法，如圖5-4所示。計算公式為C=(An-a×Am) K (1) a=(Sv+R1v)(Sv+R1v+R2v) (2)式(1)中K為校準(zhǔn)系數(shù)。加入第二試劑后總體積不同，需根據(jù)體積進(jìn)行校正，式(1)、(2)中a為體積校

23、正因子，式(2)中Sv、R1v、R2v分別為樣本、R1和R2的體積。目前全自動生化分析儀均具有自動校正反應(yīng)液體積的功能，不必手工進(jìn)行校正。圖5-4 兩點(diǎn)終點(diǎn)法時間-吸光度曲線 兩點(diǎn)終點(diǎn)法能有效消除樣本溶血(hemolysis)、黃疸(icterus)和脂濁(lipo-turbid)等造成的光吸收干擾。目前，大多數(shù)代謝物測定試劑盒為雙試劑型，如酶法測定葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯、尿酸、肌酐，以及化學(xué)法測定總蛋白、膽紅素、鈣、磷、鎂、鐵等；并且都能在加入R2后的25分鐘內(nèi)達(dá)到平衡，因此可設(shè)定兩點(diǎn)終點(diǎn)法。二、固定時間法終點(diǎn)法中有一種特殊情況稱為固定時間法，指在時間吸光度曲線上選擇兩個計算點(diǎn)，此兩點(diǎn)既

24、非反應(yīng)初始吸光度亦非終點(diǎn)吸光度，這兩點(diǎn)的吸光度差值用于結(jié)果計算，稱為固定時間法(fixed-time assay)。計算公式：C=(A2-A1)×K，K為校準(zhǔn)系數(shù)。在樣本中含有明顯干擾待測物反應(yīng)的物質(zhì)時，固定時間法能有效去除這些干擾物，提高特異性。某些干擾物比待測物更快與試劑發(fā)生反應(yīng)(稱為快反應(yīng)干擾物)，還有一些干擾物在待測物反應(yīng)完全后才開始發(fā)生反應(yīng)(稱為慢反應(yīng)干擾物)，分別選擇快反應(yīng)干擾物已完全消耗而待測物才剛剛開始反應(yīng)的時間點(diǎn)作為第一測光點(diǎn)，選擇待測物已經(jīng)反應(yīng)完全而慢反應(yīng)干擾物剛剛開始反應(yīng)的時間點(diǎn)作為第二測光點(diǎn)，兩個測光點(diǎn)吸光度的差值即為待測物的吸光度，這樣就能去除大部分的干擾物

25、質(zhì)，反應(yīng)曲線見圖5-5。圖5-5 固定時間法的時聞。吸光度曲線 在自動生化分析儀上，苦味酸法測定肌酐采用的即是固定時間法，丙酮酸、乙酰乙酸等快反應(yīng)干擾物在30秒內(nèi)絕大部分與堿性苦味酸發(fā)生反應(yīng)；3080秒內(nèi)堿性苦味酸主要與肌酐反應(yīng)，且此段時間一吸光度曲線的線性較好(故也可用連續(xù)監(jiān)測法測定肌酐)；在80120秒及以后，堿性苦味酸可與蛋白質(zhì)以及其他慢反應(yīng)干擾物反應(yīng)，故分析儀選擇反應(yīng)的3 O秒和80秒為測光點(diǎn)。固定時間法還用于溴甲酚綠法測定血清白蛋白。白蛋白與溴甲酚綠染料結(jié)合的速度很快，在1O秒時達(dá)到終點(diǎn)，而僅一球蛋白、-球蛋白的結(jié)合緩慢，從1O秒開始反應(yīng)至1O分鐘結(jié)束，因此，白蛋白的測光點(diǎn)為O秒和1

26、O秒。三、連續(xù)監(jiān)測法 連續(xù)監(jiān)測法(continuous monitoring assay)曾稱速率法(rate assay)，是在測定酶活性或用酶法測定代謝產(chǎn)物時，連續(xù)選取時間-吸光度曲線的線性期內(nèi)(圖5-6中陰影部分)4個以上測光點(diǎn)測定吸光度，計算單位時間吸光度變化值A(chǔ)min，此即為酶促反應(yīng)的初速度，其大小與被測酶活性成正比。也包括吸光度升高的正向連續(xù)監(jiān)測法和吸光度下降的負(fù)向連續(xù)監(jiān)測法。連續(xù)監(jiān)測法也可用于測定呈線性反應(yīng)的代謝物濃度，一般是采用酶法測定的代謝物。結(jié)果計算公式：酶活性(UL)=Aumin×K；代謝物濃度Cu=Aumin×K。 酶活性測定公式中的系數(shù)K包括理論K

27、值、實(shí)測K值和校準(zhǔn)K值三種。 1理論K值 若某酶活性測定沒有可用的校準(zhǔn)品，則計算酶活性的公式由酶活性的國際單位定義推算得出，即 式中為指示物質(zhì)的摩爾消光系數(shù)，Vt、Vs和b分別為反應(yīng)液總體積、樣本體積和比色杯光徑，自動生化分析儀的b一般會自動校正為1。常用指示物質(zhì)NADH(NADPH)和對硝基酚類等在一定條件下已經(jīng)被測定獲知，試劑說明書中均會提供，依此可計算出理論K值，作為分析參數(shù)輸入到分析儀中。因?yàn)槊感?zhǔn)品的制備和保存困難，故早期幾乎所有酶活性測定項(xiàng)目均沒有校準(zhǔn)品，因而多采用理論K值。 2實(shí)測K值 因波長和溫度的不同有所不同，故由試劑說明書提供的可能與實(shí)際所用分析儀所測不同，因而有必要獲得用

28、戶所用分析儀的實(shí)際，再計算K值，此為實(shí)測K值。實(shí)測K值的測定較麻煩，而且需要適時測定。 3校準(zhǔn)K值 酶活性測定過程中的分析條件如溫度、樣本、試劑以及吸光度檢測等可發(fā)生波動或偏差，如同時進(jìn)行校準(zhǔn)品測定，根據(jù)校準(zhǔn)品計算校準(zhǔn)K值：校準(zhǔn)K值=(酶活性UL)s(Amin)s。校準(zhǔn)K值通常優(yōu)于理論K值和實(shí)測K值，但其依賴于優(yōu)質(zhì)的酶校準(zhǔn)品，現(xiàn)在已有越來越多公認(rèn)的酶校準(zhǔn)品用于實(shí)驗(yàn)室，如ALT、AST、CK、LDH、GGT、ALP、AMY等。酶校準(zhǔn)品應(yīng)具有溯源性，并與所用試劑相配套。 四、比濁法 比濁法(turbidimetric assay)是通過測定微粒性物質(zhì)對光的散射或透射強(qiáng)度來測定物質(zhì)的濃度，主要用于測

29、定能形成懸浮體的顆粒物質(zhì)。當(dāng)光線通過一渾濁溶液時，懸浮的顆粒物質(zhì)一方面選擇性地吸收一部分光能，另一方面向各個方向散射了一部分光線，使透過溶液的光強(qiáng)度減弱。比濁法也采用終點(diǎn)法尤其是兩點(diǎn)終點(diǎn)法進(jìn)行檢測。比濁法可分為化學(xué)比濁法和免疫比濁法。 1化學(xué)比濁法 其基本原理是：待測物在一定條件下反應(yīng)形成不可溶的微細(xì)沉淀(微粒)，這些微粒的存在使透過的光減弱，通過檢測透光強(qiáng)度，計算出樣本中物質(zhì)的濃度，如采用三氯乙酸、磺基水楊酸法測定尿液、腦脊液中蛋白質(zhì)。該法靈敏度高，但影響濁度的因素很多，重復(fù)性較差。 2免疫比濁法 其基本原理是：抗原與抗體發(fā)生反應(yīng)形成的可溶性免疫復(fù)合物，通過某種方法使其自液相析出，形成微粒，

30、這些微粒具有對光的反射和折射能力，通過檢測散射光或透射光的強(qiáng)度，計算樣本中待測物的濃度(圖5-7)。免疫比濁法根據(jù)測定的光線不同分為免疫散射比濁法(immjuno-scatter turbidimeter)、免疫透射比濁法(immuno-transmissionturbidimeter)，在自動生化分析儀上只能采用免疫透射比濁法，即在光源的光路方向測定透光強(qiáng)度，測定的光通量與待測物質(zhì)的濃度成反比。該反應(yīng)的待測物濃度與吸光度之間不成線性，需要做多點(diǎn)校準(zhǔn)。免疫透射比濁法主要用于血清、腦脊液等體液中特種蛋白的測定，如ApoAI、ApoB、前白蛋白(PA)、hs-CRP、p2-MG，以及尿白蛋白(mA

31、lb)等。 使免疫復(fù)合物形成微粒的方法有促聚劑和交聯(lián)劑。在抗原抗體反應(yīng)的溶液中加入非離子性親水多聚體如聚乙二醇，能促進(jìn)免疫復(fù)合物的形成。另外，將待測物質(zhì)相對應(yīng)的抗體包被在直徑為1560nm的聚苯乙烯膠乳顆粒上，使抗原抗體結(jié)合物的體積增大，濁度增高，透射光和散射光的強(qiáng)度變化更為顯著，從而提高敏感性，這種方法稱為膠乳增強(qiáng)免疫比濁法。免疫透射比濁法抗原不能過量，如果樣本中待測物質(zhì)濃度過高，免疫復(fù)合物微粒將會變小，而且易發(fā)生解離，其濁度反而下降，因此免疫比濁法需要比較分析過程中后兩個吸光度的差別，如果后一點(diǎn)比前一點(diǎn)吸光度低，則表示抗原已過剩，需要稀釋樣本后重測。第三節(jié)啟動生化分析儀的參數(shù)設(shè)置 分析參數(shù)

32、是儀器工作的指令，自動生化分析儀在測定分析前，需要設(shè)置各項(xiàng)目的分析參數(shù)(analysis parameters)，如樣本和試劑用量、溫度、反應(yīng)時間、測定波長、檢測方法等。某些分析儀使用配套試劑時，其分析參數(shù)已經(jīng)固定在程序中，用戶不能更改甚至不可見，這些分析項(xiàng)目稱為封閉通道，而允許用戶修改或設(shè)定分析參數(shù)的分析項(xiàng)目稱為開放通道。 分析儀的分析參數(shù)分為基本分析參數(shù)(也稱通用分析參數(shù))和特殊分析參數(shù)(或稱質(zhì)量保證參數(shù))。 一、基本分析參數(shù) 1項(xiàng)目名稱 項(xiàng)目名稱是測定項(xiàng)目標(biāo)示符，常以項(xiàng)目的英文縮寫來表示。 2樣本量與試劑量 分析儀設(shè)置的樣本量、第一試劑和第二試劑量，有些還會有第三試劑量，需按照各種分析儀

33、的可加樣或試劑體積范圍、反應(yīng)液總體積范圍以及試劑樣本體積比來確定。各種分析儀的最小反應(yīng)液總體積80350ul不等，樣本量和試劑量由樣本體積分?jǐn)?shù)(sample volume fraction，SVF)來決定。SVF是樣本體積(Vs)與反應(yīng)總體積(Vt)的比值，即SVF=VsVt。SVF越大，靈敏度越高，但線性范圍越窄。因此要將SVF設(shè)定在一個合適的值，不宜隨意修改，否則會影響檢測靈敏度和檢測上限。 3試劑的選擇 反應(yīng)過程中一般加入一種或兩種試劑，分別稱為單試劑法和雙試劑法。 (1)單試劑：把某種生化反應(yīng)所需要的全部試劑科學(xué)地混合在一起，組合成一種試劑，檢測時只需將樣本加入試劑中混合，即可進(jìn)行相應(yīng)

34、的生化反應(yīng)，然后采用適當(dāng)方法檢測結(jié)果。 (2)雙試劑：將某些生化檢測項(xiàng)目所用到的試劑按照用途科學(xué)地分成兩類，分別配成兩種試劑(R1、R2)。通常加入R1后，可起到全部或部分消除某些內(nèi)源干擾的作用，R2為啟動樣本中待測物質(zhì)反應(yīng)的試劑，兩種試劑混合后才共同完成被檢測項(xiàng)目的生化反應(yīng)。 樣本和R1加入時間通常固定在反應(yīng)起始點(diǎn)，孵育一定的時間，在加入R2前測定吸光度A1(此即樣本空白吸光度)，然后加入R2，混勻，反應(yīng)時間根據(jù)分析方法是終點(diǎn)法或速率法進(jìn)行設(shè)置。不同分析儀R2的加入時間有所不同，某些分析儀只有一個固定時問，有些分析儀則有兩個時間點(diǎn)可選，可根據(jù)待測物的時間吸光度曲線確定。 在終點(diǎn)法中，單試劑抗

35、干擾能力差，會帶來分析誤差，而雙試劑消除了樣本的內(nèi)源性干擾(脂濁、溶血、黃疸等)和比色杯等光路帶來的影響，提高了分析的準(zhǔn)確度。同時，R1、R2分開保存，提高了試劑的穩(wěn)定性。 4溫度的選擇 生化分析儀通常有37，部分還有3O和25，一般將溫度設(shè)定在37。 5分析方法選擇 根據(jù)試劑說明書選擇檢驗(yàn)項(xiàng)目的分析方法為終點(diǎn)法或連續(xù)監(jiān)測法。此外，相關(guān)的設(shè)置還包括：終點(diǎn)法和連續(xù)監(jiān)測法包括減試劑空白或不減試劑空白，多選擇前者。色素原底物如發(fā)生自身水解，對反應(yīng)體系產(chǎn)生的空白速率應(yīng)在測定速率中減去，而某些內(nèi)源性干擾引起的速率包含在待測物的速率中無法減掉，只能通過設(shè)置一定的延遲時間或恰當(dāng)?shù)闹髯x數(shù)區(qū)間，加上雙波長檢測來

36、盡量避免。固定時間法需明確樣本中干擾物的特性。另外，還需設(shè)定反應(yīng)方向?yàn)檎蚍磻?yīng)還是負(fù)向反應(yīng)。 6測定時間選擇 生化反應(yīng)的時間是某個檢測項(xiàng)目所特有的，而且因所選用的分析方法不同而異。 (1)終點(diǎn)法：測定時間的選擇要充分考慮到干擾問題。一點(diǎn)終點(diǎn)法通常根據(jù)時間吸光度曲線設(shè)在反應(yīng)剛完成時，過早會由于反應(yīng)未達(dá)到終點(diǎn)而使檢測結(jié)果偏低，過晚易受到其他物質(zhì)的干擾。兩點(diǎn)終點(diǎn)法通常將加入R2前的時間點(diǎn)作為第一個測光點(diǎn)，第二個測光點(diǎn)的選擇與一點(diǎn)終點(diǎn)法相同。 (2)連續(xù)監(jiān)測法：需要設(shè)置延遲時間和監(jiān)測時間。延遲時間(delay time)指在速率法中試劑與樣本混勻開始到監(jiān)測期第一個測光點(diǎn)之間的時間段。設(shè)定延遲時間是為了

37、使比色杯中的混合溶液達(dá)到酶促反應(yīng)所需的溫度，使試劑中含有的工具酶充分激活，使內(nèi)源性干擾物被消耗。延遲時間由被測物質(zhì)濃度(或酶活性)、反應(yīng)速度、酶促反應(yīng)的級數(shù)和樣本中干擾物質(zhì)消除所需的時間決定。延遲期后酶促反應(yīng)在過量底物存在的情況下以恒定的速度進(jìn)行，此階段為線性反應(yīng)期，分析儀的監(jiān)測時間(monitoring time)即選在此期，至少監(jiān)測90120秒之間的不少于4個測光點(diǎn)(3個A)。 7波長選擇 (1)波長大小的選擇：測定波長的選擇要兼顧待測物和干擾物，使待測物在該波長下光吸收最大，同時使常見的干擾物在該波長下光吸收最小。其確定方法是以波長為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作吸收光譜曲線。試劑盒說明書會提

38、供波長參數(shù)。大多數(shù)檢驗(yàn)項(xiàng)目的分析原理不同，所生成的產(chǎn)物也不同，所以需要設(shè)定不同波長。試劑盒往往將一些通用化學(xué)反應(yīng)(如Trinder反應(yīng)、指示酶、指示試劑)與之偶聯(lián)，使產(chǎn)物的檢測能適應(yīng)儀器提供的單色光。 (2)單波長和雙波長的選擇：除了對波長大小的選擇，分析儀還要設(shè)置單波長法或雙波長法。單波長法(single waVelength method)是用一個波長檢測物質(zhì)的光吸收強(qiáng)度的方法，當(dāng)測定體系中只含有一種組分或混合溶液中待測物的吸收峰與其他共存物質(zhì)的吸收峰無重疊時，可選擇該方法。雙波長法(dual wavelength method)是指當(dāng)干擾物有較大吸收峰或溶液渾濁時會出現(xiàn)光散射和非特異性光

39、吸收，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要采用兩個不同的波長即測量波長(又叫主波長，primary wavelength)和參比波長(又叫次波長，secondwavelength)同時測定。使用次波長的目的是：消除噪聲干擾，從光源到比色杯、單色器、檢測器的整個光路系統(tǒng)中，均存在隨時間發(fā)生變化的不穩(wěn)定檢測信號，即噪聲。因?yàn)閮煞N波長檢測產(chǎn)生的噪聲基本相同，所以能消除噪聲干擾。減少樣本本身光吸收的干擾。當(dāng)樣本本身存在光吸收干擾如溶血、黃疸和脂濁時，采用雙波長方式檢測可部分消除這類干擾。對渾濁溶液可減少雜散光影響。 主、次波長的選擇有一定原則，主波長是被測物吸收峰所處的波長，應(yīng)選擇距被測物吸收峰最近處，盡量

40、避開來自試劑光吸收等的干擾。次波長的選擇原則是：使產(chǎn)物在主、次波長處的吸光度有較大差異，而干擾物在主、次波長處有盡可能相同的吸光度。 一、特殊分析參數(shù)的設(shè)置 1試劑吸光度檢查 (1)試劑空白吸光度：是檢查試劑質(zhì)量的指標(biāo)之一。每種試劑本身有一定吸光度(AB)，需在分析儀上設(shè)定AB的范圍，超出時儀器會報警，提示試劑變質(zhì)。如有些試劑久置后變渾濁，Trinder反應(yīng)中酚類物質(zhì)會逐漸氧化為醌類產(chǎn)物，使AB升高；另外，試劑中NADH可逐漸氧化為NAD+，其AB隨時間延長而下降。 (2)試劑空白速率：試劑空白速率(rate of reagent blank)在反應(yīng)溫度下，某些試劑于檢測過程的短時間內(nèi)可能發(fā)生

41、較為明顯的自身分解等變化，使測定結(jié)果偏高或偏低，設(shè)置此參數(shù)便能在待測物反應(yīng)的吸光度變化速率中減去試劑空白速率，從而消除或減少這類誤差。如色素原底物在37分解產(chǎn)生黃色產(chǎn)物，使測定結(jié)果出現(xiàn)正誤差。又如膽紅素對堿性苦味酸速率法測定肌酐有負(fù)干擾，原因是：膽紅素在檢測波長505nm有較高吸光度，但在堿性環(huán)境中膽紅素被氧化其吸光度降低，因而在反應(yīng)過程所測的光吸收呈下降趨勢。若在加入R1后一段時間內(nèi)檢測試劑空白速率，即為膽紅素分解速率，加入R2后的反應(yīng)速率為肌酐和膽紅素共同反應(yīng)速率，兩者相減，便可消除膽紅素的負(fù)干擾。 2酶活性測定準(zhǔn)確度的監(jiān)測 (1)線性檢查：用于連續(xù)監(jiān)測法，設(shè)定一個非線性度對監(jiān)測時間進(jìn)行線

42、性判斷。通過將監(jiān)測時間內(nèi)的吸光度值進(jìn)行線性回歸，計算各點(diǎn)的方差，根據(jù)方差值的大小來判斷該監(jiān)測時間是否處于線性期。 (2)彈性速率設(shè)置：在酶活性測定中，當(dāng)酶活性太高，在監(jiān)測時間內(nèi)已不呈線性反應(yīng)時，有些儀器具有彈性速率功能可設(shè)置，即選擇監(jiān)測時間前的線性段吸光度值計算結(jié)果，使酶活性測定的線性范圍得以擴(kuò)大。 (3)底物消耗限值：在連續(xù)監(jiān)測法的測定項(xiàng)目中，可設(shè)置化學(xué)反應(yīng)后吸光度升高(正反應(yīng))或下降(負(fù)反應(yīng))的限值。超過此限值說明酶反應(yīng)的底物消耗過多，已不足以維持底物的零級反應(yīng)，則該檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，儀器能自動提示。 3樣本性狀監(jiān)測 樣本的溶血、脂濁、黃疸等會對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾，根據(jù)各自的光譜吸收特性，用雙

43、波長測定樣本在600nm570nm、700nm660nm和505nm480nm的吸光度比值來分別判斷樣本溶血、脂濁和黃疸程度，并可在檢驗(yàn)報告單中顯示這些信息。4線性范圍的選擇 只有當(dāng)反應(yīng)吸光度處于線性區(qū)間時，檢測結(jié)果才與吸光度變化成正比，因此需設(shè)定恰當(dāng)?shù)木€性范圍。設(shè)置線性范圍后，檢測結(jié)果若超過此范圍，分析儀將提示，且某些分析儀可自動將樣本減量或自動稀釋后重新測定。第四節(jié)檢測系統(tǒng)的校準(zhǔn)和性能評價 測定一個檢驗(yàn)項(xiàng)目除了涉及自動生化分析儀，還涉及儀器所使用的試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和檢測程序等，如有手工操作步驟，還應(yīng)包括操作人員，這些要素組成的分析測定系統(tǒng)稱為檢測系統(tǒng)(testing system)。實(shí)

44、驗(yàn)室在建好自己的檢測系統(tǒng)后，以及在檢測系統(tǒng)使用過程中，需定期進(jìn)行校準(zhǔn)，并對檢測系統(tǒng)性能做出評價，在確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、精密度、靈敏度等符合要求后，才能用于臨床標(biāo)本的檢測。 一、檢測系統(tǒng)的校準(zhǔn) 對于一個臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目，如果所用檢測系統(tǒng)中分析儀、試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和檢測程序中任何一個改變，都可能得到不同的檢測結(jié)果。所以衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心擬定的臨床實(shí)驗(yàn)室(定量測定)室內(nèi)質(zhì)控工作指南中明確指出：對檢測系統(tǒng)一定要進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)時要選擇合適的(配套的)校準(zhǔn)品；如有可能，校準(zhǔn)品應(yīng)能溯源到參考方法和(或)參考物質(zhì)；對不同的分析項(xiàng)目要根據(jù)其特性確立各自的校準(zhǔn)頻率。 1校準(zhǔn)的定義 校準(zhǔn)(calibration)

45、也稱定標(biāo)，是指在規(guī)定條件下，為確定測量儀器或測量系統(tǒng)所指示的值、實(shí)物量具或參考物質(zhì)所代表的值與相對應(yīng)的由標(biāo)準(zhǔn)所復(fù)現(xiàn)的量值之間關(guān)系的一組操作。按美國臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案(Clinical Laboratory ImprovementAmendment 88，CLIA88)可以簡化校準(zhǔn)的定義為：測試和調(diào)整分析儀器的輸出，建立樣本測量值(如吸光度)與樣本實(shí)際濃度的相關(guān)關(guān)系的過程。 為了得到準(zhǔn)確可靠的測定結(jié)果，并使測定結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)室之間具有可比性，必須建立標(biāo)準(zhǔn)的檢測系統(tǒng)。很多儀器廠商為自己的生化分析儀提供配套的試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品，而且建立了完善的測定程序，但因?yàn)槌杀鞠鄬^高，目前國內(nèi)大部分實(shí)驗(yàn)室使

46、用的是自建的檢測系統(tǒng)，必然會影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，阻礙了不同醫(yī)院之間檢驗(yàn)結(jié)果的互認(rèn)。 2校準(zhǔn)方法 如果實(shí)驗(yàn)室采用的是標(biāo)準(zhǔn)檢測系統(tǒng)，其校準(zhǔn)品和校準(zhǔn)方法由廠商提供。如果是自建的檢測系統(tǒng)必須建立校準(zhǔn)方法，包括：選擇合適的校準(zhǔn)品及校準(zhǔn)品的數(shù)量、類型和濃度。如有可能，校準(zhǔn)品應(yīng)追溯到參考方法或已知值的參考物質(zhì)。確定校準(zhǔn)驗(yàn)證的頻度。根據(jù)不同檢測項(xiàng)目在檢測系統(tǒng)中的穩(wěn)定性不同而確定不同的校準(zhǔn)頻度，如每日校準(zhǔn)、每周校準(zhǔn)、每月校準(zhǔn)、每兩月校準(zhǔn)，甚至每六個月進(jìn)行一次校準(zhǔn)等。一般要求至少半年校準(zhǔn)一次，但如果檢測系統(tǒng)更換了重要部件、進(jìn)行了大的維護(hù)，或者改變了試劑的種類、批號(如果實(shí)驗(yàn)室能說明改變試劑批號并不影響結(jié)果，則可

47、以不校準(zhǔn))，或質(zhì)控反映出異常趨勢或偏移，都需要及時校準(zhǔn)。 生化分析儀的校準(zhǔn)類型有單點(diǎn)校準(zhǔn)、兩點(diǎn)校準(zhǔn)和多點(diǎn)校準(zhǔn)。大多數(shù)檢測項(xiàng)目的校準(zhǔn)曲線呈直線且通過原點(diǎn)，用單個濃度的校準(zhǔn)液即可；若校準(zhǔn)曲線呈直線但不通過原點(diǎn)，則需要用兩個濃度的校準(zhǔn)液做兩點(diǎn)校準(zhǔn)，當(dāng)校準(zhǔn)曲線不呈直線而為曲線時，應(yīng)做多點(diǎn)校準(zhǔn)，并按其線形選擇不同的曲線方程進(jìn)行擬和，如雙曲線、拋物線、冪函數(shù)、指數(shù)函數(shù)、對數(shù)函數(shù)等方程。多數(shù)生化分析儀已設(shè)置數(shù)種曲線方程，可將多點(diǎn)校準(zhǔn)的結(jié)果自動進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到曲線擬合方程，樣本的檢測結(jié)果便可通過此方程計算。 3校準(zhǔn)品 校準(zhǔn)品(calibration material)或校準(zhǔn)物，是含有已知量的待測物，用以校準(zhǔn)

48、檢測系統(tǒng)的測定值。它與分析方法及試劑、儀器相關(guān)聯(lián)。校準(zhǔn)品的作用是為了給檢測結(jié)果賦值，并減少或消除儀器、試劑等造成的系統(tǒng)誤差。20世紀(jì)50年代都用標(biāo)準(zhǔn)液（標(biāo)準(zhǔn)品）來校準(zhǔn)，忽視了標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)液有完全不同的基質(zhì)狀態(tài)，使用標(biāo)準(zhǔn)液會產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)（檢體中的非測定物質(zhì)對測定量的影響，使檢測結(jié)果偏離真值），后來采用人血清基質(zhì)制備的校準(zhǔn)品，以減少基質(zhì)效應(yīng)造成的誤差。在實(shí)際工作中要注意，不能用定值質(zhì)控血清代替校準(zhǔn)品用于校準(zhǔn)，因?yàn)橘|(zhì)控血清的定值遠(yuǎn)達(dá)不到校準(zhǔn)品的要求。校準(zhǔn)品具有專用性，它只能專用于指定的檢測系統(tǒng)，如果用于其他檢測系統(tǒng)，將會嚴(yán)重影響檢驗(yàn)質(zhì)量，使患者樣本的檢測結(jié)果不可靠，更不具有溯源性。目前臨床對校準(zhǔn)品專用

49、性認(rèn)識不足，所以校準(zhǔn)品亂用現(xiàn)象十分普遍。對于自建檢測系統(tǒng)的校準(zhǔn)，最實(shí)用的方法是利用患者新鮮樣本(其實(shí)是最佳校準(zhǔn)品)和方法學(xué)比較為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)移，或者在自建檢測系統(tǒng)校準(zhǔn)后，將某批號校準(zhǔn)品重新定值，然后用新靶值來做此檢測系統(tǒng)的校準(zhǔn)。 4酶活性測定的校準(zhǔn) 以往臨床上血清酶的測定廣泛使用連續(xù)監(jiān)測法、通過理論K值或?qū)崪yK值計算酶活性。此方法具有快速、低成本等優(yōu)點(diǎn)，但其最大的問題就是各實(shí)驗(yàn)室采用的檢測系統(tǒng)不同，使酶活性測定的室間變異明顯大于其他項(xiàng)目。為解決此問題，國際臨床化學(xué)委員會(IFCC)先后提出了兩種解決方案：推薦統(tǒng)一的測定方法即標(biāo)準(zhǔn)檢測系統(tǒng)；用校準(zhǔn)品對各檢測系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)一校準(zhǔn)。但酶的測定尚未建立

50、標(biāo)準(zhǔn)檢測系統(tǒng)，IFCC提出使用公認(rèn)的酶校準(zhǔn)品來校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的檢測系統(tǒng)，采用校準(zhǔn)K值計算樣本中的酶活性，使血清酶測定結(jié)果更具有可比性。 目前采用人血清基質(zhì)的二級校準(zhǔn)品(有證參考物質(zhì)，CRM)產(chǎn)量低，價格昂貴，只適合作為基準(zhǔn)和研究用，一些廠家已研發(fā)出可溯源到CRM的臨床校準(zhǔn)品。在酶的檢測中更要強(qiáng)調(diào)校準(zhǔn)品的專一性，不同的檢測系統(tǒng)的酶校準(zhǔn)品不能混用。 二、檢測系統(tǒng)主要的性能指標(biāo) 一般來說，評價檢測系統(tǒng)的性能即是評價生化分析儀的性能。當(dāng)前，生化分析儀的生產(chǎn)廠商很多，規(guī)格和型號也很多，評價與合理選用這些儀器就顯得格外重要。常用評價自動生化分析儀性能的指標(biāo)是精密度和準(zhǔn)確度、分析速度、實(shí)用性等。 1準(zhǔn)確度和精密

51、度 影響檢測結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度的因素很多，除了環(huán)境和人為因素，主要與生化分析儀的硬件性能密切相關(guān)，各部件的精密度是準(zhǔn)確度的前提，如取液系統(tǒng)的計量是否精準(zhǔn)、反應(yīng)溫度控制是否穩(wěn)定、光源的強(qiáng)度和穩(wěn)定性是否得到保證等。樣品針、試劑針、攪拌棒和反應(yīng)杯的交叉污染是影響準(zhǔn)確度和精密度的重要因素，清洗裝置的沖洗效果也決定了分析儀的精密度和準(zhǔn)確度。另外，儀器正確的參數(shù)設(shè)置、合理的校準(zhǔn)方案也是保證精密度和準(zhǔn)確度的必要條件。 2分析速度 分析速度是指1小時內(nèi)完成的測試數(shù)(所有已測定樣本的項(xiàng)目數(shù)之和)，用testsh來表示。分析速度與加樣周期、測試循環(huán)周期和反應(yīng)盤的大小有關(guān)。不同分析儀的分析速度可相差甚遠(yuǎn)。分析速度主

52、要由加樣周期和測試循環(huán)決定。 (1)加樣周期：加樣周期(sampling cycle)是指從樣品針采集前一個樣本開始到采集下一個樣本開始所需的時間，加試劑周期與加樣周期相應(yīng)。加樣周期決定了分析儀的工作速度，加樣周期越短，分析速度越快。單針加樣的分析儀，如加樣周期為10秒，理論上每小時可取樣360次，則其工作速度為360testsh；若加樣周期為45秒，則理論工作速度為800testsh。采用雙針加樣、雙圈反應(yīng)盤的分析儀有兩套陣列式光電檢測器，能進(jìn)行內(nèi)、外圈反應(yīng)杯同時加樣。目前單個分析單元的常規(guī)項(xiàng)目理論測試速度已達(dá)到2000testsh。 (2)測試循環(huán)周期：測試循環(huán)是指反應(yīng)杯從前一次使用開始到

53、下一次使用開始所需的時間，與待測物和試劑的總反應(yīng)時間有關(guān)，總反應(yīng)時間越短，分析速度越快。3實(shí)用性 生化分析儀實(shí)用性必須考慮幾個方面：檢測能力，如分析儀能開展的檢測項(xiàng)目的類型、通道數(shù)、開放程度、試劑瓶容量、批處理樣本數(shù)、單色光個數(shù)；便捷性，如最小加樣量和比色杯最小反應(yīng)液量越小則受檢者的采血量越小，樣本預(yù)稀釋、急診檢驗(yàn)、復(fù)查功能等使操作變得方便，還要考慮程序軟件的操作是否靈活、方便；檢測成本，如耗材消耗量、光源燈和比色杯壽命、用水量等，都是用戶應(yīng)該綜合考慮的內(nèi)容。第五節(jié) 自動生化分析儀的操作流程 自動生化分析儀完成安裝、參數(shù)設(shè)置、調(diào)試和評價后，即能用于臨床檢測。其日常操作由實(shí)驗(yàn)室制定的儀器標(biāo)準(zhǔn)操作

54、規(guī)程(standard operate protocol，SOP)進(jìn)行規(guī)定，操作人員必須熟悉儀器性能，嚴(yán)格按照SOP文件規(guī)范操作，并按實(shí)驗(yàn)室擬定的校準(zhǔn)規(guī)則和性能檢定程序定期進(jìn)行校準(zhǔn)和性能檢定，才能盡可能得到準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果，也才能保證儀器長時間地保持良好的性能并延長儀器的使用壽命。生化分析儀的操作步驟包括儀器準(zhǔn)備、質(zhì)控品檢測、樣本檢驗(yàn)、結(jié)果分析和報告審核、維護(hù)保養(yǎng)等。 一、儀器準(zhǔn)備 要使生化分析儀運(yùn)行性能最佳，對工作環(huán)境、實(shí)驗(yàn)用水和操作人員素質(zhì)都有相應(yīng)要求，所以儀器運(yùn)行前的準(zhǔn)備工作很重要。要保證穩(wěn)定的電壓，環(huán)境溫度在1825，實(shí)驗(yàn)用水一般要達(dá)到級純水，酶活性測定和電解質(zhì)分析等應(yīng)選用I級純水。 生

55、化分析儀開機(jī)前，操作人員首先檢查實(shí)驗(yàn)用水、清潔液、稀釋液等是否足量，廢液憑是否清空，一切準(zhǔn)備就緒后打開儀器電源。開機(jī)后儀器進(jìn)行白檢，通過儀器自帶的多個傳感器檢測加樣針、試劑針、比色杯、攪拌棒、沖洗臺的位置和運(yùn)動是否正常，加樣針、試劑針是否需要特別清潔處理。隨后要審查每種試劑可完成的測試數(shù)是否足夠滿足當(dāng)天使用(這需要充分了解每個檢驗(yàn)項(xiàng)目的日平均水平)，不夠的要補(bǔ)充或裝載試劑，但不宜過多以免試劑殘留時間過長導(dǎo)致試劑變質(zhì)。 二、室內(nèi)質(zhì)控分析 影響檢驗(yàn)質(zhì)量的因素如操作人員、儀器、試劑、實(shí)驗(yàn)方法、環(huán)境等無時無刻不在變化，因而決定了檢驗(yàn)結(jié)果具有變異性，這種變異超出一定的幅度范圍(按質(zhì)控規(guī)則判定)就不可接受

56、。質(zhì)量控制是保證檢驗(yàn)結(jié)果可靠性的重要手段，室內(nèi)質(zhì)控(internal quality control，IQC)是各臨床實(shí)驗(yàn)室為了監(jiān)測和評價本室工作質(zhì)量，以決定常規(guī)檢驗(yàn)報告能否發(fā)出所采取的一系列檢查、控制手段，主要目的是檢測和控制本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作的精密度，以提高本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作中批間和日間樣本檢測結(jié)果的一致性。因此，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該在每個分析批次中帶上質(zhì)控品同時檢測，根據(jù)質(zhì)控規(guī)則判斷是否在控，確定每個質(zhì)控項(xiàng)目在控后才能發(fā)出該批次的樣本檢驗(yàn)報告。 1設(shè)定均值和標(biāo)準(zhǔn)差 在開始室內(nèi)質(zhì)控前，首先要設(shè)定質(zhì)控品的均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)。均值和標(biāo)準(zhǔn)差必須在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用自己現(xiàn)行的測定方法，作為樣本進(jìn)行檢測后統(tǒng)計得出

57、，不能給予特殊處理。臨床上多使用非定值質(zhì)控品，使用定值質(zhì)控品時要明確，其標(biāo)定值只能作為確定均值的參考。根據(jù)質(zhì)控品的均值和標(biāo)準(zhǔn)差繪制Levey-J-ennings控制圖(單一濃度水平)，或?qū)⒉煌瑵舛人嚼L制在同一圖上的Z-分?jǐn)?shù)圖，將原始質(zhì)控結(jié)果記錄在質(zhì)控圖上。 (1)質(zhì)控圖暫定均值和標(biāo)準(zhǔn)差的建立：在使用新批號質(zhì)控品前為了確定均值，將新批號與當(dāng)前使用的質(zhì)控品一起進(jìn)行測定。首先確定儀器狀態(tài)良好，然后分批檢測20次，獲得至少20個數(shù)據(jù)。這20個數(shù)據(jù)可以是：20天，一天一次測定；1O天，一天兩次測定；5天，一天四次測定。不可以少于5天。根據(jù)至少20次質(zhì)控品測定結(jié)果，計算出均值(元)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)。對數(shù)據(jù)進(jìn)行異常值檢驗(yàn)，如果發(fā)現(xiàn)異常值(數(shù)據(jù)超出叉士3s范圍)，需將此數(shù)據(jù)剔除，再重新計算余下數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以此暫定均值和標(biāo)準(zhǔn)差作為下一個月室內(nèi)質(zhì)控圖的均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控；一個月結(jié)束后，將該月的在控結(jié)果與前20個