堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定課件

1、 題目：堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 （創(chuàng)新實(shí)踐活動(dòng)論文）2015年4月24日·北京不同緩沖液對(duì)堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響摘要 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)主要研究酶催化的反應(yīng)速率以及影響反應(yīng)速率的各種因素，為了更好的發(fā)揮酶的高效性，就必須準(zhǔn)確把握酶促反應(yīng)的條件。本文重點(diǎn)研究不同緩沖液所配制的酶液對(duì)酶促反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)利用堿性磷酸酶溶解在TRIS，碳酸鈉，去離子水等緩沖液中為酶液，磷酸苯二鈉為基質(zhì)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到去離子水為最適緩沖液的結(jié)果，表明以去離子水為緩沖液所配制的酶液能使酶發(fā)揮最好的效果，具有研究意義。關(guān)鍵詞：堿性磷酸酶；緩沖液；動(dòng)力學(xué)參數(shù)；本試驗(yàn)以堿性磷酸酶為催化劑，磷酸苯二鈉為底物，在一定

2、溫度、pH及酶量的條件下，堿性磷酸酶催化磷酸苯二鈉轉(zhuǎn)化為苯酚；利用分光光度計(jì)測(cè)定在不同底物濃度下苯酚的生成量。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以加深對(duì)有關(guān)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基本知識(shí)的理解和記憶；并熟記利用雙倒數(shù)法測(cè)定酶Km值的原理，熟悉試驗(yàn)方法。1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器1.1 材料與試劑 實(shí)驗(yàn)中使用的主要試劑有 磷酸苯二鈉:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 分析純 醋酸鎂：天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心 分析純 醋酸：北京化工廠 分析純 堿性磷酸酶：北京化工廠 分析純 4-氨基安替比林：天津市永大化學(xué)試劑有限公司 分析純 鐵氰化鉀：北京化工廠 分析純 硼酸：北京化工廠 分析純 苯酚：天津市福晨化學(xué)試劑廠 分析純 三羥甲基氨基甲烷（

3、Tris）：北京化學(xué)試劑公司 分析純 NaOH：北京化工廠 分析純 碳酸鈉：天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司 分析純 碳酸氫鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠 分析純 實(shí)驗(yàn)中使用的主要溶液有 （1） 0.1 mol/L碳酸鹽緩沖溶液（pH=10）：碳酸鈉1.5875 g，碳酸氫鈉0.84 g，蒸餾水溶解至250 mL。（2） 0.04 mol/L基質(zhì)溶液：磷酸苯二鈉0.436 g（無(wú)結(jié)晶水），用煮沸冷卻的蒸餾水溶解至50 mL，盛于棕色瓶，冰箱內(nèi)保存。（3） 0.1 mol/L醋酸鎂溶液:醋酸鎂1.0725 g，蒸餾水溶解至50 mL。（4） pH 8.8Tris緩沖溶液：Tris 1.21 g，蒸餾水溶解至1

4、00 mL，取此溶液10 mL，加蒸餾水80 mL，再加0.1 mol/L醋酸鎂10 mL，混勻后用1%的醋酸調(diào)節(jié)pH值至8.8，用蒸餾水稀釋至100 mL即可。（5） 0.5 mol/L NaOH溶液：NaOH 5 g，蒸餾水溶解至250 mL。（6） 酶液：堿性磷酸酶1.25 mg，用pH 8.8的Tris 緩沖溶液配制50 mL，冰箱內(nèi)保存。堿性磷酸酶1.25 mg，用pH=10的碳酸鈉緩沖溶液配制50 mL，冰箱內(nèi)保存。堿性磷酸酶1.25 mg，用去離子水為緩沖溶液配制50 mL，冰箱內(nèi)保存。（7） 0.3%4-氨基安替比林液：4-氨基安替比林液0.3 g，碳酸氫鈉4.2 g，蒸餾水溶

5、解至100 mL。（8） 0.3%鐵氰化鉀溶液：鐵氰化鉀1.25 g，硼酸3.75 g，各溶于100 mL蒸餾水中，溶解后混合至250 mL，盛于棕色瓶，冰箱內(nèi)保存。（9） 酚標(biāo)準(zhǔn)溶液：苯酚1.5 g，溶于0.1 mol/L鹽酸至1000 mL，為儲(chǔ)備液。取此儲(chǔ)備液25 mL，標(biāo)定后用蒸餾水稀釋至0.1 mg/mL 作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.2 儀器燒杯（100 mL）6量筒，移液管，試管，試管架分光光度計(jì) 型號(hào)UV2300 上海天美科學(xué)儀器有限公司電子天平 型號(hào) AL204-IC 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司恒溫水浴等 型號(hào) DF-101S 金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠2 試驗(yàn)方法與步驟2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲

6、線(xiàn)的制備取酚標(biāo)準(zhǔn)液0.00、0.05、0,10、0.20、0.30、0.40 mL于6支試管中，分別加蒸餾水至2.00 mL后，37水浴中保溫5 min，然后各加入0.5 mol/L NaOH溶液1.00 mL、0.3%4-氨基安替比林液1.00 mL、0.3%鐵氰化鉀溶液2.00 mL，混勻后室溫放置17 min，510 nm波長(zhǎng)處比色，并繪制標(biāo)注準(zhǔn)曲線(xiàn)。各管酚含量分別為0、5、10、20、30、40g。2.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定實(shí)驗(yàn)取干凈試管9支，編號(hào)，按表1,表2，表3正確操作。表1 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定試劑用量1試管號(hào)水/mL0.04mol/L基質(zhì)液/mL碳酸鹽緩沖液/mLpH8.8Tris 緩

7、沖溶液配制酶液/mL最終基質(zhì)濃度/（mmol/L）10.90.10.90.12.020.850.150.90.13.030.80.20.90.14.040.750.250.90.15.050.70.30.90.16.060.60.40.90.18.070.20.80.90.116.08-1.00.90.120.091.0-0.90.1-表2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定試劑用量2試管號(hào)水/mL0.04mol/L基質(zhì)液/mL碳酸鹽緩沖液/mLpH=10碳酸鈉緩沖溶液配制酶液/mL最終基質(zhì)濃度/（mmol/L）10.90.10.90.12.020.850.150.90.13.030.80.20.90.14.04

8、0.750.250.90.15.050.70.30.90.16.060.60.40.90.18.070.20.80.90.116.08-1.00.90.120.091.0-0.90.1-表3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定試劑用量3試管號(hào)水/mL0.04mol/L基質(zhì)液/mL碳酸鹽緩沖液/mL去離子水為緩沖溶液配制酶液/mL最終基質(zhì)濃度/（mmol/L）10.90.10.90.12.020.850.150.90.13.030.80.20.90.14.040.750.250.90.15.050.70.30.90.16.060.60.40.90.18.070.20.80.90.116.08-1.00.90.120

9、.091.0-0.90.1-加入酶液后，立即計(jì)時(shí)37水浴中保溫15 min。保溫結(jié)束后，立即加入0.5 mol/L NaOH溶液1.00 mL以終止反應(yīng)。各管分別加入0.3%4-氨基安替比林液1.0 mL及0.3%鐵氰化鉀溶液2.0 mL，充分混勻，放置10 min以9號(hào)管為對(duì)照，在510 nm處比色，并計(jì)算各管的酶活性。用雙倒數(shù)作圖法，在坐標(biāo)紙上作圖，求該酶的Km值。3 結(jié)果與討論3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 用分光光度計(jì)測(cè)量每個(gè)試管的透光率，再依據(jù)公式-logT計(jì)算吸光度的值，具體數(shù)值見(jiàn)表4 表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)參數(shù)值酚含量（g）透光率T%吸光度（ABS）01000538.60.4131030.20.

10、522018.90.7243011.20.951407.91.102依據(jù)表4的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖得到公式y(tǒng)=0.0312x。相關(guān)系數(shù)較小的可能原因?yàn)椋簶?biāo)準(zhǔn)樣受到污損，人為操作有誤，一起不穩(wěn)定等。3.1.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定實(shí)驗(yàn)按照2.2進(jìn)行動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，并依據(jù)表5的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，處理結(jié)果見(jiàn)表6,7,8。利用表6,7,8的數(shù)據(jù)，以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，酶促反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖2,3,4。計(jì)算出動(dòng)力學(xué)參數(shù)，得到動(dòng)力學(xué)方程1/V=Km/（Vmax*Cs）+1/Vmax。表5 不同酶液的T% pH 8.8 Tris 緩沖溶液配制的酶液的T%pH

11、=10的碳酸鈉緩沖溶液配制的酶液的T%去離子水為緩沖溶液配制的酶液的T%0.7110.6910.7200.7020.6820.7090.6750.6580.7060.6670.6470.7050.6770.6360.6850.640.6230.6660.6290.5910.6550.6170.5840.645111表6 pH 8.8 Tris 緩沖溶液配制的酶液的數(shù)據(jù)TABSDC1/Cs1/V0.7110.1484.7400.7900.518.90.7020.1544.9260.8230.3318.20.6750.1715.4810.9140.2516.40.6670.1765.6410.94

12、00.215.90.6770.1695.4170.9030.1616.70.640.1946.2181.0360.12514.50.6290.2016.4421.0740.063140.6170.2106.7311.1220.0513.3100-圖2 pH 8.8 Tris 緩沖溶液配制的酶液的雙倒數(shù)圖讓y=0，則x=-1.085，Km=0.9217mmol/l。表7 pH=10的碳酸鈉緩沖溶液配制的酶液的數(shù)據(jù)TABSDC1/Cs1/V0.6910.1615.1600.8600.517.50.6820.1665.3210.8870.3316.90.6580.1825.8330.9720.251

13、5.40.6470.1896.0581.0100.214.90.6360.1976.3141.0520.1614.30.6230.2066.6031.1010.12513.70.5910.2297.3401.2230.06312.20.5840.2347.5001.2500.0512.0100-圖3 pH=10的碳酸鈉緩沖溶液配制的酶液的雙倒數(shù)圖讓y=0，則x=-0.935，Km=1.0695mmol/l。表8 去離子水為緩沖溶液配制的酶液的數(shù)據(jù)TABSDC1/Cs1/V0.7200.1434.5830.7640.519.60.7090.1494.7760.7960.3318.90.7060.

14、1514.8400.8070.2518.50.7050.1524.8720.8120.218.50.6850.1645.2560.8760.1617.20.6660.1775.6730.9460.12515.90.6550.1845.8970.9830.06315.20.6450.1906.0901.0150.0514.7100-圖4 去離子水為緩沖溶液配制的酶液的雙倒數(shù)圖讓y=0，則x=-1.3504，Km=0.7405mmol/l。 3.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論以上結(jié)果表明：用去離子水為緩沖溶液配制的酶液最合適，用pH 8.8的Tris 緩沖溶液配制的酶液次之，用pH=10的碳酸鈉緩沖溶液配制的酶液最不合適。此次實(shí)驗(yàn)，受限于實(shí)驗(yàn)環(huán)境，設(shè)備條件，人為操作等因素的影響，對(duì)于這三種酶液的具體情況還有待研。 3.3 體會(huì)通過(guò)這次試驗(yàn)，我更加深入的了解了不同緩沖液配置的酶液對(duì)于酶促反應(yīng)速率的影響，且對(duì)于反應(yīng)操作也更加得心應(yīng)手，不足之處在于酶液的配置及保存都有很?chē)?yán)格的要求，受外界環(huán)境因素的影響較大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差， 希望之后通過(guò)文獻(xiàn)的查閱，實(shí)驗(yàn)條件的改善，人員操作的謹(jǐn)慎能更加準(zhǔn)確的測(cè)定其效果。參考文獻(xiàn)1 史凌云，周婷，徐成，張媛媛，趙小峰，高夢(mèng)，於露，賀玲 .正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)堿性磷酸酶活性測(cè)定的優(yōu)化J