單細胞RNA測序揭示治療誘導(dǎo)的人類肺癌進化

1、單細胞RNA測序揭示治療誘導(dǎo)的人類肺癌進化導(dǎo)讀肺癌是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因，它表現(xiàn)出的異質(zhì)性使其具有適應(yīng)性，限制了治療的成功，且仍沒有被完全了解。本研究采用30名轉(zhuǎn)移性肺癌患者在靶向治療前和治療期間的49份臨床活檢進行單細胞RNA測序(scRNA-seq)。20000多個腫瘤微環(huán)境(TME)單細胞圖譜顯示了一個豐富而動態(tài)的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)。腫瘤細胞scRNA-seq檢測的靶癌基因超出了臨床檢測到的。作為殘留疾病(RD)治療后存活的癌細胞表達肺泡再生細胞信號，提示治療誘導(dǎo)了細胞狀態(tài)的原始轉(zhuǎn)變，而在治療引發(fā)的進展性疾病(PD)中出現(xiàn)的細胞則上調(diào)了犬尿氨酸、血纖維蛋白溶酶原和間隙連接通路。RD表現(xiàn)為

2、T淋巴細胞活躍和巨噬細胞減少，PD表現(xiàn)為免疫抑制的細胞狀態(tài)。scRNA-seq揭示的生物學(xué)特征是臨床結(jié)果的生物標(biāo)記，強調(diào)了治療是如何誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移性癌的多細胞生態(tài)系統(tǒng)而形成臨床結(jié)果。實驗設(shè)計結(jié)果1 靶向治療晚期NSCLC的scRNA-seq分析研究使用scRNA-seq測定49個樣本(45個肺腺癌，鱗狀細胞癌1例，癌旁組織3例TATs)(圖1A)，對應(yīng)30個患者。使用特定工作流程從小的組織樣本和手術(shù)切除部位中分離出可行的單細胞(圖1B)。樣本被分為三個獨立的時間點(TN, RD或PD)，并根據(jù)致癌驅(qū)動因素進一步細分(圖1C)。圖S1A中舉例說明RD樣本的采集時間。表S1中包含了更多的樣本細

3、節(jié)和患者人口統(tǒng)計信息。 經(jīng)質(zhì)控篩選后共保留23261個細胞的基因表達譜?；虮磉_歸一化之后，進行了主成分分析(PCA)，并在PCA空間上基于圖形的聚類對細胞進行聚類分析(n = 20)。由此產(chǎn)生的細胞簇被標(biāo)記為免疫細胞、基質(zhì)細胞(成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和黑素細胞)或上皮細胞(圖1D)。上皮細胞(n = 5,581)被切除并重新聚集成26個離散的上皮細胞簇(圖S1B)。每種類型的細胞數(shù)和每個樣品用于分析的詳細情況見表S1。 圖1 患者特點及實驗概述。 2 基于聚類的拷貝數(shù)變異解決非癌性上皮細胞的癌癥 考慮到癌癥和大量染色體改變之間的聯(lián)系，研究利用R

4、NA表達的拷貝數(shù)變異(CNV)將上皮細胞分為癌癥和非癌癥；與成纖維細胞和內(nèi)皮細胞(對照)相比，癌細胞在整個基因組中表現(xiàn)出更大的相對表達強度變化(圖S1C)。此分析包括三份TAT樣本，來源于這些樣本的大部分細胞被歸類為非癌性細胞(表S1)。研究比較不同治療時間點之間樣本(TN, RD, PD)的平均CNV評分，結(jié)果一致。非癌癥上皮細胞簇(n = 16)被進一步注釋為細胞亞型(圖S1D和S1E)。 正如其他人所指出的，研究發(fā)現(xiàn)癌細胞表達的獨特基因數(shù)量比非癌細胞高(圖S1F)。唯一表達基因數(shù)量的差異不能用測序深度來解釋(Pearson相關(guān)性系數(shù)為0.19)。 49個原始腫瘤活檢樣

5、本中有44個發(fā)現(xiàn)了癌細胞，包括小部分來自于TAT樣本的細胞(占TAT獲得細胞總數(shù)的0.57%-1.8%)。鑒于TAT細胞可能代表了正常細胞和癌細胞之間的一種中間細胞狀態(tài)，它們出現(xiàn)頻率低。 將所有癌細胞(n = 3754)重新聚類，形成25個獨特的簇(圖S2A和S2B)。研究計算了每一個聚類簇中非癌癥和癌癥上皮細胞群中貢獻最大的單個患者的細胞數(shù)(患者占有率)(圖S2C-S2E)。大多數(shù)腫瘤細胞簇是源于患者，有很高的患者占有率，結(jié)果類似于之前的報告。相反，非癌細胞類型表現(xiàn)出較低的患者占有率(圖S2E)。因此，針對特定患者的惡性細胞聚類反映了個別患者腫瘤的獨特分子特征。 3 &#

6、160;scRNA-seq分析揭示了癌細胞表達基因改變的復(fù)雜性 基因改變可以與主要的靶向性致癌“驅(qū)動”改變共存(如致癌基因EGFR、ALK、KRAS)，也可能有助于促進腫瘤進展和限制治療。研究分析了每個癌細胞的scRNA-seq轉(zhuǎn)錄本以識別體細胞的變化(圖2A-2C；圖S2G-S2I)。49個活檢樣本中有44個樣本含有癌細胞，鑒定出20個樣本含有臨床已知的致癌驅(qū)動因子(圖2B；表S3)。所占百分比與scRNA-seq分析中可能出現(xiàn)的占有率一致。在沒有識別出臨床上已知的致癌驅(qū)動基因的24個樣本中，沒有細胞表達這些基因，因此不允許對這些基因進行突變檢測(圖S2H；表S3)。在20個樣本的

7、11個樣本(55%)中確定了臨床致癌基因，還確定了在同一患者腫瘤的臨床級批量核酸檢測中未檢測到的另一種致癌基因改變(即隱匿性基因改變)(圖2B；圖S2H)。LTS47就是一個例子。經(jīng)臨床級DNA分析，該腫瘤中存在EML4-ALK致癌基因重排。另外，scRNA-seq還顯示，該樣本含有KRAS G13D和KRAS G12C隱匿突變的癌細胞(圖S2F)?？紤]到scRNA-seq數(shù)據(jù)中可能存在的遺漏，研究人員不能斷定ALK融合和KRAS突變是否共存于同一細胞內(nèi)。然而，KRAS突變體細胞中沒有顯示ALK基因重排的跡象。該樣本是在經(jīng)過多種治療后從患者身上獲得的，這可能會導(dǎo)致多種耐藥機制的進化。致癌驅(qū)動基

8、因的缺失也是一種耐藥機制，但考慮到scRNA-seq的局限性，我們不能確定這種耐藥機制是否適用于本案例。 研究人員還查詢了COSMIC(癌癥體細胞突變目錄)中肺腺癌第1級突變的突變數(shù)據(jù)(表S2)。盡管發(fā)現(xiàn)的許多突變已經(jīng)包括在臨床小組中，但在對病人腫瘤進行的臨床分析中并沒有報道過(圖2C；圖S2I；表S2和S3)。雖然這可能反映了臨床檢測時活檢技術(shù)或腫瘤克隆性的差異，但這些結(jié)果也表明臨床級批量DNA檢測可能低估了腫瘤的異質(zhì)性。 為了評估存在多種致癌改變的患者的臨床結(jié)果，并確定本研究的研究結(jié)果更廣泛的轉(zhuǎn)化影響，使用了NSCLC數(shù)據(jù)庫的MSC-Impact。那些在scRNA-se

9、q圖譜中檢測到的1級COSMIC集中有大于或等于2個突變的患者(高突變)與那些腫瘤中有小于2個COSMIC 1級突變(低突變)的患者相比，其總體生存率(OS)顯著降低(p <0.01；圖S2J)。因此，scRNA-seq分析可以增加對癌細胞基因組異質(zhì)性的分析力度，并洞察轉(zhuǎn)錄突變的情況。 圖2 scRNA-seq可以推斷患者的突變狀態(tài)，并揭示癌細胞中復(fù)雜的突變情況。 4  TN和RD癌細胞的轉(zhuǎn)錄差異揭示了細胞狀態(tài)特異性的生物學(xué)過程 研究假設(shè)，在治療期間癌細胞中激活的生物過程可以識別在初始治療期間(包括RD)促進癌細胞適應(yīng)和生存的信號通路。比較了從TN

10、到RD的腫瘤樣本中獲得的單個癌細胞的轉(zhuǎn)錄本(表S4)，并著重關(guān)注了RD癌細胞中629個上調(diào)的基因，可作為通路激活的替代證據(jù)，發(fā)現(xiàn)了許多與癌癥相關(guān)途徑相關(guān)的基因(表S5)。重要的是，研究還發(fā)現(xiàn)，與TN和PD相比，RD癌細胞表達的增殖標(biāo)記基因減少，這與預(yù)期一致，即在靶向治療期間，持續(xù)存在的癌細胞通常增殖較少(圖S3A)。 有趣的是，研究鑒定了一個由17個已建立的肺泡細胞基因標(biāo)記組成的肺泡細胞基因表達特征，在RD和TN時間點上其表達顯著增加(圖3A；圖S3B；表S2)。肺泡細胞由肺泡1型(AT1)和肺泡2型(AT2)亞型組成，構(gòu)成肺泡的內(nèi)襯。AT2細胞產(chǎn)生表面活性劑，可作為干細胞樣祖細胞，

11、在各種類型的肺損傷中變得活躍并增殖，被懷疑是癌基因驅(qū)動的肺癌的細胞來源。AT1細胞是肺泡中的優(yōu)勢細胞群，介導(dǎo)氣體交換，在受傷或死亡時，可釋放增殖和再生信號。AT1細胞包括HOPX+/IGFBP2+和HOPX+/IGFBP2-兩種亞型，后者代表維持細胞可塑性的細胞群，可增殖并轉(zhuǎn)化為AT2細胞，使損傷后組織再生。在RD癌細胞中檢測到的肺泡特征包括AT1和AT2相關(guān)基因(表S2)，包括AT2細胞的AQP4、SFTPB/C/D、CLDN18、FOXA2、NKX2-1和PGC，AT1細胞的AGER、HOPX和IGFBP2(圖S3B)。此外，研究在癌細胞中鑒定的肺泡細胞狀態(tài)并不是來自我們的癌細胞群中注釋錯

12、誤的非癌癥肺泡細胞(圖S3C)。 研究用正交方法驗證RD時肺泡細胞特征的激活。首先，使用由患者衍生的EGFR突變NSCLCs (PC9)組成的臨床前模型開發(fā)TN、RD和PD臨床狀態(tài)的類似物。通過RT-PCR，檢測了RD臨床樣本中顯著上調(diào)的肺泡細胞標(biāo)志基因NKX2-1的表達，發(fā)現(xiàn)與對照和獲得性耐藥狀態(tài)細胞相比，在維持狀態(tài)細胞中NKX2-1的表達顯著升高(圖3B)。這表明從臨床scRNA-seq分析中識別的肺泡特征可以在體外受控條件下復(fù)制。此外，免疫組化(IHC)分析顯示，與TN和PD臨床樣本相比，RD臨床樣本的質(zhì)膜上可誘導(dǎo)AQP4蛋白表達，AQP4是肺泡細胞特征的另一標(biāo)志物(圖3C；圖

13、S3D)。 在TCGA肺腺癌組織RNA-seq數(shù)據(jù)集中，測試肺泡特征是否為患者生存的臨床相關(guān)生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)，與腫瘤表現(xiàn)出較低表達的肺泡特征的患者相比，這些腫瘤的肺泡特征高表達與患者OS改善之間存在顯著相關(guān)性(圖3D；表S6)。 這些發(fā)現(xiàn)支持了RD癌細胞有明顯的肺泡基因表達特征的論斷，并與改善患者生存率相關(guān)。一個可能的模型是，RD癌細胞激活的肺泡特征反映了細胞損傷和修復(fù)特征，使人聯(lián)想到非癌癥的AT1和AT2細胞。這一特征的表達增加可導(dǎo)致治療期間細胞死亡的修復(fù)和逃避，以支持癌細胞的持久性，同時構(gòu)成一個較低的侵略性惡性狀態(tài)。這與RD代表了一種在臨床前模型中觀察到存活但不快速增殖

14、的緩慢循環(huán)癌細胞的永久細胞狀態(tài)的觀點是一致的(如圖S3A所示)，它是絕對耐藥性引發(fā)侵襲性腫瘤進展的前導(dǎo)。 肺泡的分子特征和細胞損傷修復(fù)的特征是值得關(guān)注的。在本研究的RD中，WNT/-catenin相關(guān)通路基因SUSD2和CAV1表達增加(表S5)。研究使用IHC分析SUSD2和CTNNB1 (-catenin)蛋白表達(圖S3E和S3F)來驗證觀察到的轉(zhuǎn)錄變化。與本研究的scRNA-seq結(jié)果一致，與TN和PD相比，RD狀態(tài)中膜SUSD2和核CTNNB1 (-catenin)顯著增加。此外，在兩個臨床試驗(奧希替尼: NCT03433469或克唑替尼: NCT03088930)中，從

15、EGFR(AZ)或ROS1(NC)接受新輔助TKI治療的患者中獲得的成對TN和RD樣本中，CTNNB1核定位的比較如圖S3G所示。SUSD2是WNT通路激活的下游靶點，而CAV1可促進-catenin (CTNNB1)的核定位和WNT/-catenin通路的轉(zhuǎn)錄激活。在NSCLCs中，WNT/-catenin信號通路有助于細胞損傷后的腫瘤發(fā)生、修復(fù)和再生。AT2細胞的自我更新和損傷反應(yīng)特異性依賴于WNT/-catenin信號通路。此外，在EGFR突變的NSCLC中，WNT/-catenin通路的激活可能限制EGFR抑制劑的反應(yīng)，并可能在體外EGFR抑制劑治療期間促進永久細胞群的存活?？偟膩碚f，

16、RD狀態(tài)以細胞損傷和存活信號為特征，這些信號部分通過WNT/-catenin通路發(fā)揮作用，可能具有治療靶向性。 臨床數(shù)據(jù)表明，在原發(fā)性EGFR或ALK靶向治療中，WNT/-catenin激活在治療早期參與促進RD和耐藥細胞的發(fā)展。為了進一步探索WNT通路研究結(jié)果的治療潛力，研究使用患者來源的PC9細胞作為EGFR突變的NSCLC模型，使用H3122細胞作為ALK融合驅(qū)動的NSCLC模型。研究測試了這一假設(shè)，即預(yù)先阻斷WNT/-catenin信號通路以及致癌EGFR或ALK，這將減少在初始治療中存活的細胞數(shù)量，并在治療開始時增加反應(yīng)強度。親代細胞分別用EGFR或ALK TKI (奧希替

17、尼或艾樂替尼)的IC50(導(dǎo)致細胞數(shù)量減少50%的抑制劑濃度)劑量處理。兩種不同的WNT/-catenin通路抑制劑XAV939和PRI-724用四種先前報道的濃度或聯(lián)合治療進行測試。體外實驗結(jié)果支持了本研究的假設(shè)，證明前期抑制WNT/-catenin通路與同源TKI結(jié)合導(dǎo)致明顯的細胞融合且劑量依賴下降和反應(yīng)強度增加(圖3G-3J；圖S3H-S3O)。 5 通過scRNA-seq分析TN和PD之間的轉(zhuǎn)錄差異揭示了免疫調(diào)節(jié)和細胞侵襲是癌癥進展的關(guān)鍵特征 接下來本研究討論了靶向治療期間TME的演變。免疫細胞(n = 13431)被聚類并注釋(圖4A；表S1和S4)。與

18、腫瘤細胞聚類(主要是患者特異性的)相比(圖S2C和S2D)，免疫細胞類型聚類顯示了較低的患者占有率(圖4B)。這與在患者和樣本中在比較TN和PD樣本的癌細胞時，研究發(fā)現(xiàn)PD癌細胞中有901個差異基因上調(diào)(表S4)。在這些基因中，確定了參與犬尿氨酸通路的基因以及與腫瘤發(fā)生和炎癥相關(guān)的多個基因和通路(表S5)。 研究觀察到在PD和TN癌細胞中，參與犬尿氨酸通路的IDO1、KYNU和QPRT基因表達增加(圖3K；圖S3P；表S2)這些基因的表達可導(dǎo)致免疫抑制行為，說明PD腫瘤內(nèi)的癌細胞可能直接抑制免疫系統(tǒng)的活性。該通路介導(dǎo)PD腫瘤的免疫抑制，識別該通路具有重要的潛在治療意義，因為IDO1在

19、許多癌癥中上調(diào)。多項臨床試驗試圖使用IDO1抑制劑作為單一療法以及與免疫檢查點抑制劑或激素療法聯(lián)合使用來阻斷這一通路，盡管成功程度有限。在使用PC9細胞的體外模型中，QPRT在獲得性EGFR抑制劑治療(即類似于臨床PD)時也表現(xiàn)出表達增加(圖3L)，強化了該通路在治療的選擇性壓力下癌癥發(fā)展的斷言。為了進一步證明犬尿氨酸通路的臨床相關(guān)性，我們再次使用TCGA肺腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)集。腫瘤中此標(biāo)志物高表達，是患者OS較差的生物標(biāo)志物(圖3M；表S6)。這與此途徑的激活導(dǎo)致免疫抑制和免疫系統(tǒng)無法有效地監(jiān)視和根除癌細胞的觀點相一致。 6 從RD到PD，癌細胞的scRNA-seq譜

20、發(fā)生變化 研究比較了RD患者和PD患者樣本的癌細胞，以闡明在RD導(dǎo)致PD的過程中發(fā)生的差異，并發(fā)現(xiàn)在RD或PD中總共有2182個基因表達顯著升高(NRD = 1121，NPD = 1061)(表S4)。RD的差異過表達基因是與肺泡細胞特征、細胞生長、分化、細胞運動和腫瘤抑制相關(guān)的基因(表S5)。RD癌細胞過表達表面活性基因(SFTPB/C/D和SFTA3)，這是肺泡細胞特征的一部分(圖3A；圖S3B)。此外，NKX2-1和NFIX在RD癌細胞中過表達，并與細胞活性下降相關(guān)。NKX2-1的低表達導(dǎo)致分化的喪失和腫瘤播種能力的增強。這一研究和之前RD癌癥細胞分析的共同結(jié)果表明，細胞的損傷

21、-修復(fù)和再生狀態(tài)可能促進癌癥細胞的惰性，增加腫瘤控制和改善臨床結(jié)果。 相反，PD腫瘤細胞的過表達與侵襲、細胞間互作、分化及免疫調(diào)節(jié)的基因相關(guān)(表S5)。纖溶酶原激活途徑中的幾個基因(ANXA2, PLAT, PLAUR, PLAU)(圖3N)及纖溶酶原抑制基因SERPINE1 (PAI1)明顯過表達(圖3O；圖S3Q)。ANXA2和PLAUR是纖溶酶原活化級聯(lián)中的受體蛋白，通過降解細胞外基質(zhì)參與炎癥、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。ANXA2或PLAU分別與PLAT (uTa)或PLAU (uPa)結(jié)合時啟動信號傳導(dǎo)。然后，纖溶酶原通過PLAT和/或PLAU的活性降解為纖溶酶，導(dǎo)致金屬蛋白酶的

22、激活和纖維蛋白的降解。SERPINE1在許多癌癥亞型中表達增加，并在細胞粘附、侵襲、腫瘤血管化、放射抵抗和免疫抑制中發(fā)揮重要作用。在TCGA肺腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)集中，纖溶酶原激活信號的高表達與患者OS的惡化有關(guān)(圖3P；表S6)。同樣，在這個獨立數(shù)據(jù)集中，SERPINE1的高表達與較差的OS相關(guān)(圖3Q；表S6)。EGFR抑制劑治療可以誘導(dǎo)SERPINE1和EGFR突變體的表達，在EGFR抑制劑治療期間SERPINE1 (PAI1)血漿水平超過2倍的患者證明其生存期較短?？偟膩碚f，本研究的scRNA-seq分析闡明了纖溶酶原活化級聯(lián)在臨床預(yù)后不良和靶向治療耐藥中的臨床相關(guān)性和潛在作用。&#

23、160;此外，本研究發(fā)現(xiàn)與RD腫瘤細胞相比，PD腫瘤細胞中有幾種間隙連接蛋白過表達(圖3R；表S2)。間隙連接蛋白是一種完整的膜蛋白，允許細胞間的離子、代謝物和次級信使在胞內(nèi)交換。一些蛋白已被鑒定為腫瘤抑制因子，但研究發(fā)現(xiàn)TCGA肺腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)集中GJB2/3/5高表達(圖S3R；表S6)與較差的生存率有關(guān)(圖3S)。這些結(jié)果表明，不僅在本研究數(shù)據(jù)分析中，而且在NSCLC中也普遍存在促腫瘤效應(yīng)。 在癌細胞中，研究發(fā)現(xiàn)了一個臨床相關(guān)的復(fù)雜性，表達突變可能影響治療反應(yīng)。此外，對不同治療時間點的單個癌細胞的轉(zhuǎn)錄譜進行評估，確定了幾種臨床相關(guān)的細胞狀態(tài)變化(圖S4A)。研究發(fā)現(xiàn)，癌

24、基因驅(qū)動突變的類型(EGFR或ALK)(圖S4B-S4K)和活檢部位(原發(fā)或轉(zhuǎn)移)所確定的治療時間點特征大多持續(xù)存在。雖然我們發(fā)現(xiàn)這些癌細胞的特征是強大的，但必須承認(rèn)樣本之間存在患者異質(zhì)性(圖S4L-S4O)。 圖3 不同處理時間點之間的基因表達差異分析，揭示了處理階段的特異性轉(zhuǎn)錄特征。 7 個別病人在治療期間腫瘤的縱向scRNA-seq分析 由于大多數(shù)腫瘤在TKI治療期間會有50%或以上的退化率(盡管不完全)，因此在治療前和治療期間對晚期肺癌患者進行連續(xù)的臨床腫瘤活檢是有挑戰(zhàn)性的。然而，從一名患者(TH226)的同一原發(fā)腫瘤的3個治療時間點獲得了樣本，

25、該患者的腫瘤包含標(biāo)準(zhǔn)的EGFR 19外顯子缺失致癌突變，并使用EGFR抑制劑奧希替尼進行治療(圖S5A-S5C)。在3個活檢中，研究通過癌細胞中EGFR 19外顯子驅(qū)動突變和其他幾個突變的scRNA-seq RNA表達進行鑒定(圖S5D)。 當(dāng)將TH226與其余的scRNA-seq數(shù)據(jù)集進行比較時，發(fā)現(xiàn)了重疊的差異表達基因和特征(表S4；圖S5E-S5H)。有趣的是，還發(fā)現(xiàn)與鱗狀細胞分化相關(guān)的許多基因(KRT16、KRT14、KRT6A、KRT5、CLCA2、PKP1、ANXA8、DSG3)，在PD時比TN和RD時過表達(圖S5I；表S4和表S5)。因為病人在腹膜透析時的肺腫瘤活檢顯

26、示，從之前的活檢顯示的純腺癌組織學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)轺[狀細胞癌(圖S5C)。鱗狀細胞癌的組織學(xué)轉(zhuǎn)變是EGFR突變的NSCLCs對EGFR抑制劑耐藥的機制之一。因此，scRNA-seq能夠提供高分辨率、基因和通路的水平，以了解癌癥藥物治療過程中產(chǎn)生的生物學(xué)和組織學(xué)可塑性。 8  PD與RD相比，TME內(nèi)骨髓和淋巴樣浸潤倒轉(zhuǎn) 發(fā)現(xiàn)常見免疫細胞表型的期望一致。比較了所有3個時間點的免疫細胞組成，表示為部分免疫細胞豐度載體之間的相關(guān)性。RD內(nèi)的免疫組成與其他兩種處理狀態(tài)的差異最大(圖S6A)。在所有的治療時間點，T細胞和巨噬細胞都是優(yōu)勢細胞群，并在腫瘤反應(yīng)和耐藥過程中表現(xiàn)出

27、相對豐度倒置，進一步研究了這一發(fā)現(xiàn)，如下所述(圖4C)。與TN或PD樣本相比，在RD時TME中T細胞占所有免疫細胞的更大比例(TN為27%，RD為46%，PD為31%)。巨噬細胞浸潤呈相反的模式，與TN和PD相比，RD時巨噬細胞減少(TN為37%，RD為21%，PD為37%)。 在2例患者中，研究檢查了在不同治療時間點獲得的匹配腫瘤活檢的免疫細胞(TH226和TH266，分別圖S6B和S6C)。在對TH266患者進行的2次腫瘤活檢中，巨噬細胞和T細胞均顯示巨噬細胞的比例降低，而T細胞從TN到RD的比例增加，結(jié)果與整個數(shù)據(jù)集相匹配(圖S6D)。TH226表現(xiàn)出與治療初期RD時巨噬細胞比

28、例減少，PD時再次增加的模式相似(圖S6E)。使用免疫熒光染色對組織樣本進行了驗證(圖4D-4F；圖S6F)。此外，將NSCLCs的TCGA大容量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分解為部分免疫細胞類型，發(fā)現(xiàn)含有高比例巨噬細胞的TCGA樣本，其OS明顯更差(圖S6G)。這支持了研究觀察到的臨床相關(guān)性，并與之前的報道相一致，在手術(shù)切除早期NSCLCs的患者中巨噬細胞浸潤與不良預(yù)后相關(guān)，以及EGFR TKI治療期間生存率更差。 這些發(fā)現(xiàn)特別有趣，因為它們與PD-1抑制劑治療的黑色素瘤相似，盡管在肺癌的蛋白靶向治療的獨特背景下。具體來說，在PD-1抑制期間，研究觀察到黑色素瘤中CD8+ T細胞和自然殺傷(NK)細

29、胞數(shù)量的增加和M1巨噬細胞數(shù)量的減少。在不同的腫瘤組織和治療過程中，NK/T細胞和巨噬細胞可能有共同的反應(yīng)。因此，可能存在針對不同癌癥亞型和治療方式的靶向RD的保守方法，這是未來研究的一個領(lǐng)域。 圖4 每個腫瘤的腫瘤微環(huán)境在組成上的變化。 9 表達IDO1的巨噬細胞在PD時富集 從肺腫瘤活檢中獲得的巨噬細胞(n = 1,379)被分成5個不同的組(圖S7A)，每個組的基因差異表達(圖S7B；表S4)。此外，研究人員計算了5個巨噬細胞簇中來自3個治療組的細胞比例(圖5A)。 MF0在TN細胞中輕度富集，其特征是與免疫抑制表型相關(guān)的基因(C1QC、

30、GPNMB、APOE、TREM2、FOLR2)的表達(圖5B；圖S7B)。MF1和MF3在RD位點富集。巨噬細胞簇表達MF1與腫瘤浸潤骨髓源抑制細胞(FCN1、VCAN、S100A8、S100A9)以及THBS1和PTX3相關(guān)的特征，這些特征與炎癥的化解、傷口愈合和IL-1的抑制有關(guān)(圖5B；圖S7B)。MF3表達的基因與組織損傷的促炎性反應(yīng)(CLEC2D、IL7R、OGT)和促炎性信號傳導(dǎo)(FYN、DUSP4、FOXO1)有關(guān)。這一簇中的巨噬細胞表達CCL5，這是一種細胞因子，此前被認(rèn)為與HER2靶向治療后促進殘余HER2+乳腺癌存活有關(guān)。MF4由增殖的髓系細胞群組成(TOP2A、MKI67

31、)，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 在MF2組中，PD組巨噬細胞過多(圖5A)，且表達促炎性細胞因子CXCL9、CXCL10和CXCL11(圖5B；圖S7B)，有利于淋巴細胞聚集進入TME。該群中最顯著差異表達的基因還包括與冠苷酸結(jié)合的家族蛋白GBP1和GBP5，它們在IFN-活化的巨噬細胞中被誘導(dǎo)，并通過炎性小體組裝促進先天免疫系統(tǒng)內(nèi)的炎癥信號傳導(dǎo)(圖5B；圖S7B)。盡管MF2巨噬細胞中有促炎基因的表達，但PD組特異性巨噬細胞中最顯著的差異表達基因是IDO1(圖5B)。IDO1是由TME內(nèi)的炎癥誘導(dǎo)，并通過免疫抑制髓系細胞群、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)分化和免疫抑制細胞因子促進致敏環(huán)境。 10 免疫抑制T細胞表型在帕金森病的TME中占主導(dǎo)地位 T細胞和NK細胞(n = 2226)以巨噬細胞的方式進行分析，得到5個不同的T/NK細胞群(圖5C；圖S7C)。這些包括在TN樣本中富集的兩個種群(TC0、TC4)和在PD中富集的兩個種群(TC1、TC2)(圖5C和5D；圖S7D)。在RD腫瘤中，T細胞總體比例較高