專題二微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用知識(shí)點(diǎn)總結(jié)

1、專題二 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用知識(shí)點(diǎn)2.1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1培養(yǎng)基是人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的 不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基 質(zhì)，是進(jìn)行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。2. 培養(yǎng)基按物理性質(zhì)分為液體培養(yǎng)基（應(yīng) 用于工業(yè)或生活生產(chǎn)） 、固體培養(yǎng)基（應(yīng)用 于微生物的分離和鑒定）和半固體培養(yǎng)基 （常用于觀察微生物的運(yùn)動(dòng)及菌種保藏 等）。按成分分為合成培養(yǎng)基（用成分已知 的化學(xué)物質(zhì)配制而成，成分種類比例明確， 用于微生物的分離鑒定） 和天然培養(yǎng)基 （用 化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)配制而成， 用于實(shí) 際工業(yè)生產(chǎn)）。按用途分為選擇培養(yǎng)基（加 入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要微生物生 長(zhǎng)，促進(jìn)所需微生物的生長(zhǎng)） 和鑒

2、別培養(yǎng)基 （根據(jù)微生物的特點(diǎn)， 加入某種指示劑或化 學(xué)藥品，來(lái)鑒別不同類別的微生物） 。3. 培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括：水、無(wú)機(jī)鹽、 碳 源、氮源和生長(zhǎng)因子等。碳源包括 CO2、NaHC3O 等無(wú)機(jī)碳源和糖類、 石油、花生粉餅等有機(jī) 碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機(jī)碳源。 單質(zhì) 碳不能作為碳源。氮源包括 N2、NH3、NO3-、 NH4+等無(wú)機(jī)氮源和蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、 牛肉膏、蛋白胨等有機(jī)氮源。 只有固氮微生 物才能利用 N2。4. 培養(yǎng)基還需滿足 pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧 氣的要求。例：培養(yǎng)乳酸桿菌需添加維生素； 培養(yǎng)霉菌需將 pH 調(diào)至酸性；培養(yǎng)細(xì)菌需將 pH調(diào)至中性或微堿性；培養(yǎng)厭氧型微生物

3、需提供無(wú)氧的條件。5. 無(wú)菌操作技術(shù)包括：對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空 間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。 將用于微生物培養(yǎng)的器皿、 接種用具和培 養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。 為避免周圍環(huán)境中 微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附 近進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理 的材料用具與周圍的物品相接觸。6. 消毒與滅菌的區(qū)別是： 消毒指使用較為溫 和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi) 部一部分對(duì)人體有害的微生物 （不包括芽孢 和孢子），包括煮沸消毒法，巴氏消毒法 （酒精、氯氣、石炭酸）和紫外線消毒法。 滅菌指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外 所有的微生物，包括芽孢和孢子，包括灼 燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。7

4、. 滅菌方法： 接種環(huán)、接種針、 試管口等 使用灼燒滅菌法； 玻璃器皿、 金屬用具等 使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱； 培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用高壓蒸汽滅菌法， 所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋； 表面滅菌和 空氣滅菌等使用紫外線滅菌法， 所用器械是 紫外燈 。8. 制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（1）方法步驟：計(jì)算、稱量、溶化、滅菌、 倒平板。（2）倒平板操作的步驟包括：將滅過菌 的培養(yǎng)皿放在酒精燈火焰旁的桌面上， 右手 拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶， 左手拔出棉塞。 將錐形瓶的瓶口迅速通過火焰（灼燒滅菌， 防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基） 。將培養(yǎng) 皿打開一條稍大于瓶口的縫隙， 再將錐形瓶 中的培 養(yǎng)基 （約

5、1020mL）倒入培養(yǎng)皿， 立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。 等待平板冷卻凝 固然后，將平板倒過來(lái)放置， 使培養(yǎng)皿蓋在 下、皿底在上（目的：使培養(yǎng)基表面的水分 更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入 培養(yǎng)基，造成污染）。9. 倒平板時(shí)若不慎將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿 底上，則這個(gè)平板不能用來(lái)培養(yǎng)微生物， 原 因是空氣中的微生物會(huì)在皿蓋與皿底上生10. 純化大腸桿菌的原理是：用平板劃線法 和稀釋涂布平板法接種， 使聚集在一起的微 生物分散成單個(gè)細(xì)胞， 從而能在培養(yǎng)基表面 形成單個(gè)的菌落（生態(tài)學(xué)上稱種群） ，以達(dá) 純化菌種的目的。11. 平板劃線操作時(shí)第一步以及每次劃線之 前都要灼燒接種環(huán)的原因是： 前者避免接種

6、 環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物， 后者殺 死上次劃線殘留在環(huán)上的菌種， 使菌種逐漸 變少以便得到單個(gè)菌落。在劃線操作結(jié)束 時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)的原因是及時(shí)殺死 接種環(huán)上殘留的菌種， 避免細(xì)菌污染環(huán)境和 感染操作者。 在灼燒接種環(huán)之后， 要等其冷 卻后再進(jìn)行劃線的原因是避免接種環(huán)溫度 太高而殺死菌種。12. 涂布平板操作的步驟包括：將涂布器 浸在盛有酒精的燒杯中。 取少量菌液， 滴 加到培養(yǎng)基表面。將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃， 待酒精燃盡后，冷卻 810s。用涂布器 將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。13. 菌種的保存：頻繁使用，臨時(shí)保存接種 到固體斜面培養(yǎng)基，在 4下保存。長(zhǎng)期保 存菌

7、種用甘油管藏的方法。2.2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)1. 尿素是重要的農(nóng)業(yè)氮肥， 不能直接被植物 吸收。土壤中有一類細(xì)菌能合成脲酶， 將尿 素分解成氨， 被植物吸收利用。 尿素最初是 從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的。2. 實(shí)驗(yàn)室中微生物篩選的原理是： 人為提供 有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件 （包括營(yíng)養(yǎng)、 溫 度、PH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生 長(zhǎng)。3. 在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物 生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng) 的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。例如， 培養(yǎng)基 中不加入有機(jī)物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物； 培養(yǎng)基中不加入氮元素， 可以選擇培養(yǎng)能固 氮的微生物；加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng) 金黃

8、色葡萄球菌等。4. 測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布 平板法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)。5. 稀釋涂布平板法常用來(lái)統(tǒng)計(jì)樣品中活菌 的數(shù)目。原理是：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)， 培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落， 來(lái)源于樣品稀 釋液中的一個(gè)活菌。統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)， 就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。 為了 保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇 3-5 個(gè)菌落數(shù)在 30300 的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取平均值。6. 統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低， 原因是當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)， 平板 上看到的只是一個(gè)菌落， 因此， 統(tǒng)計(jì)結(jié)果一 般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來(lái)表示。7. 設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非 測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，

9、 提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的可信度。對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了被測(cè)試的條件 以外，其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)， 其作用是比 照試驗(yàn)組，排除任何其他可能原因的干擾， 證明確實(shí)是所測(cè)試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。8. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括實(shí)驗(yàn)方案， 所需儀器、材料、 用具和藥品，具體的實(shí)施步驟以及時(shí)間安排 等的綜合考慮和安排。9. 土壤取樣：鏟去表層土，在距地表約 3 8cm的土壤層從富含有機(jī)物、潮濕、 pH 7 的土壤中取樣。10. 樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長(zhǎng) 的菌落數(shù)目。 在實(shí)際操作中， 通常選用一定 稀釋范圍（細(xì)菌一般選用 104、105、106；放 線菌一般選用 103、 104、105；真菌一般選用 102、103 、

10、104）的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證 獲得菌落數(shù)在 30300 之間、適于計(jì)數(shù)的平 板。11. 不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌 30-37 1-2 天； 放線菌 25-28 5-7 天；霉菌 25-283-4 天。12. 每隔 24 小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目， 選取菌 落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果， 這樣可以防 止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。 一般來(lái)說， 在一定的培養(yǎng)條件下 （相同的培 養(yǎng)基、唯獨(dú)及培養(yǎng)時(shí)間） ，同種微生物表現(xiàn) 出穩(wěn)定的菌落特征（形狀、大小、隆起程度 和顏色基本一致）13. 每克樣品中的菌落數(shù) =（C/V）× M （C： 某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)

11、的平均菌落數(shù)； V： 涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積（ ml）；M： 代表稀釋倍數(shù)）14. 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚 紅指示劑， 培養(yǎng)某種細(xì)菌后， 如果 PH升高， 指示劑變紅，可初步鑒定該種細(xì)菌能分解尿 素為氨。2.3 分解纖維素的微生物的分離1. 纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的 高分子化合物， 是地球上含量最豐富的多糖 類物質(zhì)。棉花是自然界中纖維素含量最高的也富含纖維素天然產(chǎn)物，木材、作物秸稈等2. 纖維素酶是一種復(fù)合酶， 一般認(rèn)為它至少 包括三種組分，即 C1 酶、CX 酶和葡萄糖苷酶， 前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖， 第三種 酶將纖維二糖分解成葡萄糖， 為微生物的生 長(zhǎng)提

12、供營(yíng)養(yǎng)。3. 當(dāng)在含有纖維素的培 養(yǎng)基 中加入剛果紅 時(shí)，它能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合 物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后， 剛果紅 纖維素的復(fù)合物就無(wú)法形成， 培養(yǎng)基中會(huì)出 現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈， 根據(jù)是 否產(chǎn)生透明圈就可以來(lái)篩選纖維素分解菌， 這種方法叫做剛果紅染色法。4. 剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理： 剛果紅（染料）可以與像纖維素這樣的多糖 物質(zhì)形成紅色復(fù)合物， 但并不和水解后的纖 維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。5. 實(shí)驗(yàn)流程：土壤取樣選擇培養(yǎng) （此步是 否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少 來(lái)確定）梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖 維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落6

13、. 為確定得到的是纖維素分解菌， 需要進(jìn)行 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 的實(shí)驗(yàn)。纖維素酶的測(cè)定方 法，一般是對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖維素后 所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量的測(cè)定。7. 由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系， 在富含 纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對(duì) 提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的8. 將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相 對(duì)聚集，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生 存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約 10cm 左右腐殖土壤中。9. 剛果紅染色法種類：一種是先培養(yǎng)微生 物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)； 另一種是 在倒平板時(shí)就加入剛果紅。 前者的缺點(diǎn)是操 作繁瑣，加入剛果紅溶液會(huì)使菌落之間發(fā)生 混雜；其優(yōu)點(diǎn)是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本 上是纖維素分解菌的作用。 方法二的優(yōu)點(diǎn)是 操作簡(jiǎn)便， 不存在菌落混雜問題， 缺點(diǎn)是由 于纖維素和瓊脂、 土豆汁中都含有