硫酸苯酚法與硫酸蒽酮法測多糖

1、硫酸苯酚法與硫酸蒽酮法測多糖植物體內(nèi)的碳素營養(yǎng)狀況以及農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)性狀，常以可溶性糖和淀粉的含量作為重要指 標，本實驗學習幾種定量測定可溶性糖和淀粉的方法。（一）苯酚法測定可溶性糖【實驗原理】植物體內(nèi)的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖。苯酚法測定可溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10- 100mg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長下有最大吸收峰， 故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈 敏度高，實驗時基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定160min以

2、上?！緦嶒瀮x器及試劑】1. 儀器：分光光度計、電爐、鋁鍋、20mL刻度試管、刻度吸管、記號筆、吸水紙適量。2. 試劑：（1）90%苯酚溶液：稱取 90g苯酚（AR，加蒸餾水10mL溶解，在室溫下可保存數(shù)月。（2） 9%苯酚溶液：取 3mL 90%苯酚溶液，加蒸餾水至 30mL,現(xiàn)配現(xiàn)用。（3）濃硫酸（比重1.84 ）。（4） 1 %蔗糖標準液：將分析純蔗糖在80C下烘至恒重，精確稱取1.000g。加少量水溶解， 移入100mL容量瓶中，加入 0.5mL濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度。（5） 100ug/L蔗糖標準液：精確吸取 1 %蔗糖標準液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。 【實驗步驟】1

3、. 標準曲線的制作：取20mL刻度試管11支，從0 10分別編號，按表27- 1加入溶液和水，然后按順序向試管內(nèi)加入1mL9%苯酚溶液，搖勻，再從管液正面以5 - 20s。加入5 mL濃硫酸，搖勻。比色液總體積為8 mL,在恒溫下放置30min。顯色。然后以空白為參比，在485nm波長下比色測定，以糖含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線，求出標準直 線方程。2可溶性糖的提取 取新鮮植物葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取 0.10 - 0.30g，共3 份，分別放入3支刻度試管中，加入 5-10mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取 30min（提取2次），提取液過濾入 25mL容量瓶中，

4、反復沖洗試管及殘渣，定容至刻度。3. 測定吸取0.5mL樣品液于試管中（重復 2次），加蒸餾水1.5mL,同制作標準曲線的步 驟，按順序分別加入苯酚、濃硫酸溶液，顯色并測定光密度。由標準線性方程求出糖的量，按下式計算測試樣品中糖含量。式中：C 一標準方程求得糖量（ug）a吸取樣品液體積（mLV提取液量（mL）n一稀釋倍數(shù)W一組織重量（g）（二）蒽酮法測定可溶性糖【實驗原理】糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊

5、糖與己糖，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等（因為反應液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖 而發(fā)生反應X所以用愈酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合 物總量。在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下，用意酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應用價值。但在測定水溶性碳水化合物時，則應注意切勿將樣品的未溶解殘渣加入反應液中，不然會因為細胞壁中的纖維素、半纖維素等與意酮試劑發(fā)生反 應而增加了測定誤差。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比 例不同造成

6、誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。糖類與蒽酮反應生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為630nm故在此波長下進行比色?！緦嶒瀮x器及試劑】1儀器：分光光度計、電爐、鋁鍋、20ml刻度試管、刻度吸管、記號筆、吸水紙適量。2. 試劑：（1） 蒽酮乙酸乙酯試劑：取分析純蒽酮1g,溶于50mL乙酸乙酯中，貯于棕色瓶中，在黑 暗中可保存數(shù)周，如有結晶析出，可微熱溶解。（2）濃硫酸（比重1.84 ）【實驗步驟】1. 標準曲線的制作：按方法一標準曲線的制作方法加入標準的蔗糖溶液，然后按順序向試管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯試劑和 5mL濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，逐管準確保溫1min取出后自然冷卻至室溫，以空白作參比，在630nm波長下測其光密度，以光密度為縱坐標，以糖含量為橫坐標，繪制標準曲線，并求出標準線性方程。2. 可溶性糖的提取同方法一第二步。3. 顯色測定：吸取樣品提取液 0.