基因文庫(kù)的建立

1、第四章第四章基因文庫(kù)的建立基因文庫(kù)的建立基因文庫(kù)(gene library) 基因組文庫(kù)(genomic library) cDNA文庫(kù)(cDNA library) 第一節(jié)基因組文庫(kù)的構(gòu)建 定義： 含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和。一. 基因組文庫(kù)的規(guī)模 N基因組文庫(kù)克隆總數(shù) P所需機(jī)率 N= f插入片段與基因組DNA長(zhǎng)度之比 二建立基因組文庫(kù)的一般程序 1載體DNA片段的制備 DNA分離純化 限制酶切 脫磷酸化反應(yīng) 2 供體DNA片段的制備總DNA分離純化 機(jī)械剪切法 分離特定大小DNA片段 酶法 部分酶切 分離特定大小DNA片段 完全酶切 ln（1-P）ln（1-f）3.

2、供體與載體供體與載體DNA連接連接要提高重組頻率，應(yīng)注意連接反應(yīng)體系中的總要提高重組頻率，應(yīng)注意連接反應(yīng)體系中的總DNA濃濃度和兩種度和兩種DNA分子的克分子比率。分子的克分子比率。4.重組重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫(kù)的擴(kuò)增分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫(kù)的擴(kuò)增利用轉(zhuǎn)化或感染方法將連接利用轉(zhuǎn)化或感染方法將連接DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，讓其自主復(fù)制，重組讓其自主復(fù)制，重組DNA分子被擴(kuò)增（重組子比率可能分子被擴(kuò)增（重組子比率可能發(fā)生變化）發(fā)生變化）5.基因組文庫(kù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)基因組文庫(kù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)1）文庫(kù)規(guī)模）文庫(kù)規(guī)模-隨機(jī)挑取一些轉(zhuǎn)化子或重組子，提取質(zhì)隨機(jī)挑取一些轉(zhuǎn)化子或重組子，提取質(zhì)粒粒

3、DNA，電泳測(cè)定插入片段大小，然后根據(jù)上述公式計(jì)，電泳測(cè)定插入片段大小，然后根據(jù)上述公式計(jì)算文庫(kù)大小。算文庫(kù)大小。2）重組頻率）重組頻率-頻率越高，質(zhì)量越高，可大大減輕后續(xù)頻率越高，質(zhì)量越高，可大大減輕后續(xù)篩選基因工作量。篩選基因工作量。三三.利用質(zhì)粒載體利用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)BamHIMboIOHPOHHO脫磷酸化重組DNAT4 連接酶轉(zhuǎn)化E.coli基因組文庫(kù)總DNAHindIIIBamHISalIEcoRIPstIScaITcAmpRRpBR322(4.36 kb)OriHindIIIEcoRIPstIScaIAmpROriSalI該法簡(jiǎn)單、快速、易于該法簡(jiǎn)單、快速、易

4、于操作，但僅適合一些低操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。等真核生物和原核生物。四. 利用載體構(gòu)建基因組文庫(kù) 1. 載體DNA片段的制備方法: 左右臂DNA片段的獲得 2. 供體DNA片段的制備:限制酶部分酶切，機(jī)械剪切法 3. 重組DNA分子的形成： 控制克分子比率，使其形成串狀DNA分子 4. 重組DNA分子的包裝 1） DNA的包裝物的制備 使用的大腸桿菌菌株： E.coli BHB2688(N205 recAimm434 cItsb2 red Eam Sam/)-包裝蛋白 E.coli BHB2690(N205 recAimm434 cItsb2 red Dam Sam/)-頭部

5、蛋白 i. 兩菌株分別培養(yǎng)，分別收集和制備，包裝前混合-本底低（對(duì)DNA分子大小有嚴(yán)格限制），高效。 ii. 兩菌株分別培養(yǎng)，混合收集和制備-操作簡(jiǎn)單，本底高，可包裝不同大小的DNA分子。 2） 重組DNA分子的包裝過(guò)程 包裝制備物（-70）于冰上緩慢融化 加入重組DNA分子 邊融化邊混合邊包裝 離心除去細(xì)胞碎片 顆粒于-70保存待用5. 基因組文庫(kù)的擴(kuò)增 包裝的顆粒 感染E.coli 培養(yǎng) 分離顆粒 -70保存五五.利用利用COS質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程與構(gòu)建過(guò)程與載體構(gòu)建過(guò)程相似載體構(gòu)建過(guò)程相似:兩臂兩臂DNA片段的制備，片段的制備，供體供體DNA片段的制備，兩

6、片段的制備，兩DNA的連接和重組的連接和重組DAN分子的包分子的包裝。裝。單單COS質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體和和雙雙COS質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)。構(gòu)建基因組文庫(kù)。為提高文庫(kù)質(zhì)量，可采取以下措施：為提高文庫(kù)質(zhì)量，可采取以下措施：1.雙酶切載體產(chǎn)生不同末端以避免其自身形成串狀體雙酶切載體產(chǎn)生不同末端以避免其自身形成串狀體2.供體供體DNA脫磷酸化以避免供體脫磷酸化以避免供體DNA間的連接導(dǎo)致重排間的連接導(dǎo)致重排3.載體和供體載體和供體DNA末端修飾以避免上述兩種情形發(fā)生末端修飾以避免上述兩種情形發(fā)生載體載體DNAXhoIorSalI酶切酶切補(bǔ)補(bǔ)CT連接連接重組重組DNA供體供體DNASau3AI部

7、分酶切部分酶切補(bǔ)補(bǔ)AG4.采用文庫(kù)快速構(gòu)建法以避免擴(kuò)增文庫(kù)時(shí)采用文庫(kù)快速構(gòu)建法以避免擴(kuò)增文庫(kù)時(shí)DNA丟失丟失AprOricosBHHind AprOricosBHCosHind AprOriBHAprOricosBHCosSalISHHSCosSCosS1BamH ISHHSCosSCosS1BamH ICosS1BamH IHCosS1BamH ICosHCosCosHSSHSSH大片段小片段35-45kb DNA 片段T4 DNA ligaseCosHCosSoriAp r利用單利用單COS質(zhì)粒載體文庫(kù)質(zhì)粒載體文庫(kù)SS離體包裝感染E.coli利用雙利用雙COS質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)

8、構(gòu)建基因組文庫(kù) 六六.利用利用P1載體構(gòu)建基因組文庫(kù)載體構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程也與構(gòu)建過(guò)程也與載體構(gòu)建過(guò)程十分相似載體構(gòu)建過(guò)程十分相似:1.兩臂兩臂DNA片段的制備片段的制備:pAD10sacBBamHI/ScaI2.供體供體DNA片段的制備片段的制備:部分酶切部分酶切蔗糖梯度離心蔗糖梯度離心3.兩兩DNA的連接和重組的連接和重組DAN分子的包裝分子的包裝1)包裝物制備用菌株包裝物制備用菌株:E.coli NS3208=MC1061,suporecD1014hsdR-hsdM+mcrA-mcrB-(P1r-m-cm-2c1.100am10.1):制備制備pacaseE.coli NS3210=

9、MC1061,suporecD1014hsdR-hsdM+mcrA-mcrB-(P1r-m-cmc1.100am131):制備頭部蛋白制備頭部蛋白2)重組重組DNA分子的包裝與感染分子的包裝與感染與與重組子包裝相似重組子包裝相似,然后感染然后感染E.coliNS3529=E.coliK12recAmcrA(hsdRhsdMmcrBmcrCmrr)(imm434nin5X1-cre)(immLP1),每微克每微克DNA可在可在Kanr平板上平板上4X105-2X106Kanr。sacBBamHI+95kbDNAfragmentpacloxPsacBKanDNAheadful+CreRecombi

10、-lationDNAAmplifi-cationpaccleavageproteinloxPAmpAd10pAD10sacBII(29.3kb)XbaIScaIpacloxPlytRepplasmidRepkanrr利用利用P1載體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)七七.利用利用YAC載體構(gòu)建基因組文庫(kù)載體構(gòu)建基因組文庫(kù)1.兩臂兩臂DNA片段的制備片段的制備:pYAC4BamHI/EcoRI脫磷酸化脫磷酸化2.供體供體DNA片段的制備片段的制備:瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠-DNA樣品的制備樣品的制備EcoRI部分酶切部分酶切脈沖場(chǎng)脈沖場(chǎng)凝膠電泳凝膠電泳片段回收和純化片段回收和純化3.DNA的連接的連接

11、4.重組重組DAN分子的轉(zhuǎn)化分子的轉(zhuǎn)化:原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法5.轉(zhuǎn)化子的保存轉(zhuǎn)化子的保存:單菌落保存于單菌落保存于96孔平板中孔平板中Sup4CEN4ARS1TRP1OripYAC4ESmSXBXB紅色Ura+,Try+轉(zhuǎn)化子菌落脈沖場(chǎng)凝膠電泳酵母人工染色體構(gòu)建酵母人工染色體構(gòu)建第二節(jié)第二節(jié)cDNA文庫(kù)的建立文庫(kù)的建立定義：從一定生長(zhǎng)階段或條件的某種細(xì)胞分離到的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA后再重組和增殖所產(chǎn)生的無(wú)性繁殖系的總和。一cDNA文庫(kù)的特點(diǎn) 1. 基因特異性 常來(lái)自結(jié)構(gòu)基因，因此僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表那些正在表達(dá)的基因的遺傳信息：15% mRNA，808

12、5% rRNA，1015% tRNA 2. 器官特異性 不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)就具有器官特異性，故由不同器官提取的mRNA所組建的cDNA文庫(kù)也就不同4. 不均勻性 在同一個(gè)cDNA文庫(kù)中，不同類(lèi)型的cDNA分子的數(shù)目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的。這與基因組文庫(kù)中的單拷貝基因均具有相同的克隆數(shù)相較，這是兩種文庫(kù)的另一差別。 5. 各cDNA均可獲得表達(dá)（一般選用的載體都是表達(dá)型的）3. 代謝或發(fā)育特異性 處于不同代謝階段（或發(fā)育階段）的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)亦不相同 二二.cDNA文庫(kù)的規(guī)模文庫(kù)的規(guī)模N=f為某一特定為某一特定cDNA（mRNA）的分子數(shù)目

13、與全部）的分子數(shù)目與全部cDNA（mRNA）分子數(shù)目之比）分子數(shù)目之比三三.建立建立cDNA文庫(kù)的一般程序文庫(kù)的一般程序1.載體載體DNA片段的制備片段的制備2.多聚（多聚（A）RNA的分離與純化的分離與純化3.雙鏈雙鏈cDNA的合成的合成1）單鏈）單鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法的合成：反轉(zhuǎn)錄法2）第二條）第二條cDNA的合成：堿解或酶解（的合成：堿解或酶解（RNaseH）法除）法除去去RNA分子分子ln(1p)ln(1f) 2）同聚物加尾：可大大減少載體DNA自身連接 3） cDNA的定向插入5. 重組cDNA分子的轉(zhuǎn)移和文庫(kù)的建立 選用載體為質(zhì)粒，可直接轉(zhuǎn)化E.coli；若為載體，則需進(jìn)行體

14、外包裝、感染等。4. ds- cDNA與載體DNA 相連 1）人工接頭：要求具平端ds- cDNA，酶切時(shí)可能導(dǎo)致某些cDNA鏈斷裂與載體相連12人工接頭II人工接頭IREIREII與載體相連3重組cDNA 甲基化酶TdT dCTPREcDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建 ds-DNA合成 與SalI匹配接頭相連NotI酶切1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase NotI primer/adaptorcDNA重組子載體SalI adaptorcDNA的定向插入的定向插入 四四.建立建立cDNA文庫(kù)的特殊方法文庫(kù)的特殊方法1.OkayamaBerg法法1）T引物的合成：在質(zhì)粒上進(jìn)行，用于

15、合成第一條引物的合成：在質(zhì)粒上進(jìn)行，用于合成第一條cDNA鏈鏈2）G引物的合成：在質(zhì)粒上進(jìn)行，用于合成第二條引物的合成：在質(zhì)粒上進(jìn)行，用于合成第二條cDNA鏈鏈3）第一條）第一條cDNA鏈合成：鏈合成：T引物與引物與mRNA退火退火反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)4）第二條）第二條cDNA鏈的合成：鏈的合成：a.第一條第一條cDNA鏈鏈3-末端加尾（末端加尾（dCTP）b.限制酶切除去載體上所加的多聚限制酶切除去載體上所加的多聚C尾巴尾巴c.與與G引物退火引物退火d.除去除去RNAe.合成第二條合成第二條cDNA鏈鏈5）cDNA文庫(kù)的形成文庫(kù)的形成轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化該法的優(yōu)點(diǎn)：獲全長(zhǎng)該法的優(yōu)點(diǎn)：獲全長(zhǎng)cDNA，并使

16、，并使cDNA表達(dá)的可能性提表達(dá)的可能性提高一倍，因?yàn)楦咭槐叮驗(yàn)閏DNA插入方向與載體上啟動(dòng)子方向一致。插入方向與載體上啟動(dòng)子方向一致。pUC19SISmPH1)SacI2)TdT+dTTP1)PstI2)TdT+dGTPEESmPH1)SmaI2)分離大片段1)HindIII2)分離小片段退火堿解 退火 連接TdT+dCTP2)分離大片段1)HindIIIKlenow片段+ dNTPT4 ligaseAMV-RT+dNTPEPHTTTTGGGGCCCCTTTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAAAAATTTTAAAATTTTAAAATTTTAAAATTTTAAAATTTTAAAATT

17、TTGGGGCCCC5GGGGCCCCGGGGOkayama-BergcDNA文庫(kù)構(gòu)建文庫(kù)構(gòu)建1)PstI 2)TdT+dGTPSmaI退火GGGGGGGGGGGGPolIK+dNTPT4 DNAligaseTTTTAAAACCCCGGGGCCCCGGGGCCCCGGGGCCCCGGGGCCCCGGGGTTTTAAAATTTTAAAATTTTAAAAAAAAAAAACCCC堿解(dT)12-18AMV-RT dNTPUC192. OkayamaBerg改進(jìn)法 該法集中了常規(guī)方法和OkayamaBerg法的優(yōu)點(diǎn)，第一條cDNA鏈合成用常規(guī)法，但在3-端加尾后，其余步驟與OkayamaBerg法相

18、同3.SMART(SwitchMechanismAtthe5endofRNATemplates)方法方法1)當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶合成到當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶合成到mRNA模板模板5端后，它會(huì)在第端后，它會(huì)在第一鏈的一鏈的3端加上幾個(gè)端加上幾個(gè)C；2)合成的寡核苷酸合成的寡核苷酸G與與C配對(duì)；配對(duì)；3）反轉(zhuǎn)錄酶以新合成的）反轉(zhuǎn)錄酶以新合成的cDNA為模板，繼續(xù)合成第為模板，繼續(xù)合成第二條二條cDNA鏈；鏈；4）LDPCRLongDistancePCRcDNA Library Construction KitGGGCCCpolyA LD PCR( 50 ng of total RNA)PCR-SelectcDNAsub

19、tractionEnriched full-length ds cDNASfi I digestionSfi IASfi IBleft armright armSfi IASfi IBPackagingprimer extension(1g of poly A RNA)+Fractionation &ligation intoTrip Iex2armsTM51SMARTMethodGGGPoly A+RNAPolyA Modified oligo(dT)PrimerFirst-strand synthesiscoupled with(dC)tailing by RTGGGpolyATe

20、mplate switchingand extension by RTGGGCCCpolyAAmplify cDNA by LD PCRHigh-quality ds cDNAcDNAlibraryconstruction VirtualNorthernbolts5131CDNAlibraryInTripIEx25151CCC4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR法）法）1)引物的合成：引物的合成：T引物引物5-端富含端富含GC，可提高退火溫度，避免非特異性變，可提高退火溫度，避免非特異性變性發(fā)生，因?yàn)樾园l(fā)生，因?yàn)?-端含低聚端含低聚dTG引物引物5-端富含端富含AT，便于與載體相連，便

21、于與載體相連，3-端含低聚端含低聚dG2)cDNA的的PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增：采用采用TaqDNA聚合酶，方法是：變性聚合酶，方法是：變性與引物復(fù)性與引物復(fù)性鏈鏈延伸延伸下一個(gè)循環(huán)下一個(gè)循環(huán)3)cDNA連接方式：連接方式：用匹配接頭用匹配接頭3PCR法構(gòu)建法構(gòu)建cDNA文庫(kù)文庫(kù)3.供體與載體供體與載體DNA連接連接要提高重組頻率，應(yīng)注意連接反應(yīng)體系中的總要提高重組頻率，應(yīng)注意連接反應(yīng)體系中的總DNA濃濃度和兩種度和兩種DNA分子的克分子比率。分子的克分子比率。4.重組重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫(kù)的擴(kuò)增分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫(kù)的擴(kuò)增利用轉(zhuǎn)化或感染方法將連接利用轉(zhuǎn)化或感染方法將連接DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)

22、胞，分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，讓其自主復(fù)制，重組讓其自主復(fù)制，重組DNA分子被擴(kuò)增（重組子比率可能分子被擴(kuò)增（重組子比率可能發(fā)生變化）發(fā)生變化）5.基因組文庫(kù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)基因組文庫(kù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)1）文庫(kù)規(guī)模）文庫(kù)規(guī)模-隨機(jī)挑取一些轉(zhuǎn)化子或重組子，提取質(zhì)隨機(jī)挑取一些轉(zhuǎn)化子或重組子，提取質(zhì)粒粒DNA，電泳測(cè)定插入片段大小，然后根據(jù)上述公式計(jì)，電泳測(cè)定插入片段大小，然后根據(jù)上述公式計(jì)算文庫(kù)大小。算文庫(kù)大小。2）重組頻率）重組頻率-頻率越高，質(zhì)量越高，可大大減輕后續(xù)頻率越高，質(zhì)量越高，可大大減輕后續(xù)篩選基因工作量。篩選基因工作量。 i. 兩菌株分別培養(yǎng)，分別收集和制備，包裝前混合-本底低（對(duì)DNA分子大小有嚴(yán)格限制

23、），高效。 ii. 兩菌株分別培養(yǎng)，混合收集和制備-操作簡(jiǎn)單，本底高，可包裝不同大小的DNA分子。 2） 重組DNA分子的包裝過(guò)程 包裝制備物（-70）于冰上緩慢融化 加入重組DNA分子 邊融化邊混合邊包裝 離心除去細(xì)胞碎片 顆粒于-70保存待用5. 基因組文庫(kù)的擴(kuò)增 包裝的顆粒 感染E.coli 培養(yǎng) 分離顆粒 -70保存sacBBamHI+95kbDNAfragmentpacloxPsacBKanDNAheadful+CreRecombi-lationDNAAmplifi-cationpaccleavageproteinloxPAmpAd10pAD10sacBII(29.3kb)XbaIS

24、caIpacloxPlytRepplasmidRepkanrr利用利用P1載體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)Sup4CEN4ARS1TRP1OripYAC4ESmSXBXB紅色Ura+,Try+轉(zhuǎn)化子菌落脈沖場(chǎng)凝膠電泳酵母人工染色體構(gòu)建酵母人工染色體構(gòu)建與載體相連12人工接頭II人工接頭IREIREII與載體相連3重組cDNA 甲基化酶TdT dCTPREcDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建 cDNA Library Construction KitGGGCCCpolyA LD PCR( 50 ng of total RNA)PCR-SelectcDNAsubtractionEnriched ful

25、l-length ds cDNASfi I digestionSfi IASfi IBleft armright armSfi IASfi IBPackagingprimer extension(1g of poly A RNA)+Fractionation &ligation intoTrip Iex2armsTM51SMARTMethodGGGPoly A+RNAPolyA Modified oligo(dT)PrimerFirst-strand synthesiscoupled with(dC)tailing by RTGGGpolyATemplate switchingand

26、extension by RTGGGCCCpolyAAmplify cDNA by LD PCRHigh-quality ds cDNAcDNAlibraryconstruction VirtualNorthernbolts5131CDNAlibraryInTripIEx25151CCC三三.利用質(zhì)粒載體利用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)BamHIMboIOHPOHHO脫磷酸化重組DNAT4 連接酶轉(zhuǎn)化E.coli基因組文庫(kù)總DNAHindIIIBamHISalIEcoRIPstIScaITcAmpRRpBR322(4.36 kb)OriHindIIIEcoRIPstIScaIAmpRO

27、riSalI該法簡(jiǎn)單、快速、易于該法簡(jiǎn)單、快速、易于操作，但僅適合一些低操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。等真核生物和原核生物。 i. 兩菌株分別培養(yǎng)，分別收集和制備，包裝前混合-本底低（對(duì)DNA分子大小有嚴(yán)格限制），高效。 ii. 兩菌株分別培養(yǎng)，混合收集和制備-操作簡(jiǎn)單，本底高，可包裝不同大小的DNA分子。 2） 重組DNA分子的包裝過(guò)程 包裝制備物（-70）于冰上緩慢融化 加入重組DNA分子 邊融化邊混合邊包裝 離心除去細(xì)胞碎片 顆粒于-70保存待用5. 基因組文庫(kù)的擴(kuò)增 包裝的顆粒 感染E.coli 培養(yǎng) 分離顆粒 -70保存AprOricosBHHind AprOricosBHCosHind