基因工程一基因工程概況

1、第一章 基因工程概況一.基因工程含義按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)在較短時(shí)間內(nèi)有目的地改造生物種性或生產(chǎn)生物產(chǎn)品，創(chuàng)造出更符合人們需求的新的生物類型。1.1 引言v例如：v黑曲霉的纖維素酶基因轉(zhuǎn)入酵母，使酵母可降解纖維素，利用秸桿發(fā)酵生產(chǎn)酒精。 優(yōu)點(diǎn) 打破物種界限，使遺傳信息在不同物種間進(jìn)行重組和轉(zhuǎn)移。 v例如：v黑曲霉的纖維素酶基因轉(zhuǎn)入酵母，使酵母可降解纖維素，利用秸桿發(fā)酵生產(chǎn)酒精。再例如 第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是 1982出生的小鼠。 它被轉(zhuǎn)入了大鼠的生長(zhǎng)激素基因，結(jié)果長(zhǎng)的與大鼠一樣大。轉(zhuǎn)基因小鼠正常小鼠轉(zhuǎn)入綠色熒光蛋白基因的小鼠在暗背景下可發(fā)出綠色熒光。中國科

2、學(xué)家將人的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入奶牛，獲得的轉(zhuǎn)基因牛于2003出生, 其牛奶中含有巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，可用于治療胃病。二、基因工程的理論基礎(chǔ)1、不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)幾乎所有的生物的各種各樣的基因都是由具有一定功能和核苷酸序列的DNA片段組成。DNA都是由四種核苷酸組成核苷酸是由磷酸、五碳糖和四種咸基組成DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)都是雙螺旋結(jié)構(gòu).2、基因是可切割的基因可被限制性核苷酸內(nèi)切酶切開。 5 ATCGCGATGGATCCGCGAT 3 3 TAGCGCTACCTAGGCGCTA 5 3、基因是可以轉(zhuǎn)移的.基因可在不同染色體、細(xì)胞和物種間轉(zhuǎn)移。4、多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。有一條多肽就有一種相對(duì)應(yīng)的

3、基因，基因序列決定多肽的序列，通過多肽鏈可推導(dǎo)基因的有無。5、遺傳密碼的通用性允許其在不同生物中表達(dá)。可以人工合成。6、基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代。三、基因工程的基本技術(shù)路線克隆載體受體細(xì)胞重組DNA克隆 轉(zhuǎn)基因生物生物材料mRNADNARNA文庫基因組文庫人工合成 目的基因 病毒黑曲霉基因組DNA 纖維素酶基因 Cycle Plasmid DNA of bacteria限制性內(nèi)切酶DNA連接酶纖維素酶基因 纖維素酶基因DNA重組技術(shù)PCR DNA聚合酶質(zhì)粒DNA載體限制性內(nèi)切酶Cycle Plasmid DNA vector 線性化后，轉(zhuǎn)入酵母酵母可產(chǎn)生纖維素酶，遺傳性狀發(fā)生改變

4、。1 準(zhǔn)備階段1944，Avery 證明DNA是遺傳物質(zhì)，是基因的載體.1953, Watson and Crick: 證明 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu).1958-1971, 提出中心法則，破譯遺傳密碼 60s-70s, 發(fā)現(xiàn)核苷酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，質(zhì)粒被用做載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。四、基因工程簡(jiǎn)史2 基因工程的問世 1973年，Cohen將非洲爪蟾核糖體基因與質(zhì)粒pSC101 重組轉(zhuǎn)入 E. coli., 并證明該基因可轉(zhuǎn)錄。3 基因工程的發(fā)展 在近40 的時(shí)間里，基因工程飛速發(fā)展.3.1建立了一整套相關(guān)技術(shù): 例如：體外擴(kuò)增基因片段：Polymerase Chain Reaction (PCR)D

5、NA的體外重組技術(shù)細(xì)菌、動(dòng)植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)等3.2 獲得了一系列的基因轉(zhuǎn)化載體 : 例如：各種質(zhì)粒，病毒載體等3.3 獲得了大量轉(zhuǎn)基因生物. 轉(zhuǎn)基因細(xì)菌 (E.coli. )轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 (mouse, cow, sheep, pig)轉(zhuǎn)基因植物( tobacco, potato, tomato, cotton,rice) 1.2 基因工程的研究?jī)?nèi)容一、基礎(chǔ)研究 1、克隆載體的研究 構(gòu)建克隆載體是基因工程技術(shù)路線中的核心環(huán)節(jié)。 bacteria ：plasmid vector(質(zhì)粒) plant ：Ti plasmid vector（Ti質(zhì)粒) animal ：animal virus vect

6、or（動(dòng)物病毒）2、基因工程受體的研究 受體 (receptor)：基因轉(zhuǎn)化的對(duì)象Bacteria : 大腸桿菌（E.coli）、藍(lán)細(xì)菌 (cyanobacteria )Fungi :酵母菌 (yeast)單細(xì)胞的 Plant:愈傷組織(callus), partial tissue or organAnimal :生殖細(xì)胞(reproductive cell),胚細(xì)胞(embryoblast)、體細(xì)胞( body cell）3、目的基因目的基因：基因工程研究開發(fā)的可滿足人們特殊需要的基因產(chǎn)物。（1）目的基因主要三種：藥物相關(guān)基因（胰島素）植物抗逆基因：抗蟲、抗病、抗逆境，Bt gene 抗蟲

7、基因）具有特殊營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的基因（2）獲得目的基因的方法:構(gòu)建和篩選基因組文庫(Genome library)構(gòu)建和篩選cDNA文庫(cDNA library)人工合成：例如采用 PCR技術(shù)4、工具酶 用于合成、切割、連接、修飾DNA片段的酶 。 種類 DNA聚合酶 DNA polymerase, 限制性內(nèi)切酶 Restriction endonuclease,連接酶 DNA ligase,修飾酶 Modification enzyme,(1) DNA 聚合酶：合成 DNA 片段 Such as : Taq DNA polymerase(2) 限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction Endonu

8、clease） ：基因工程中的關(guān)鍵酶， 可有規(guī)律的切割DNA片段 EcoR I 5ATCGCGAT GAATTCGCGAT 3 3 TAGCGCTACTTAAGCGCTA 5 BamH I 5ATCGCGAT GGATCCGCGAT 3 3 TAGCGCTACCTAGGCGCTA 5(3) DNA連接酶 用于連接各種DNA片段，使不同基因重組.例如：T4 DNA 連接酶(4) 修飾酶：用于DNA的修飾。例如： 堿性磷酸酯酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 核酸外切酶。5、基因工程新技術(shù)研究(1) 轉(zhuǎn)基因方法: 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)基因槍電穿孔儀種質(zhì)介導(dǎo)法(2) 檢測(cè)方法分子雜交PCR基因芯片技術(shù)(3) DN

9、A合成方法v PCR技術(shù)的改進(jìn)（長(zhǎng)片段PCR、RT-PCR等）(4) 基因片段的分離v凝膠電泳技術(shù)（脈沖電泳技術(shù)）二 、應(yīng)用研究 （一） 藥物相關(guān)基因 最活躍發(fā)展最快的領(lǐng)域 主要種類有：1.活性多肽2.疫苗3.DNA藥物1、活性多肽 種類：干擾素、胰島素、白介素，生長(zhǎng)因子等。用途診斷、預(yù)防和治療疾病干擾素：干擾病毒復(fù)制，廣譜抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能胰島素：治療糖尿病，白介素：治療多種實(shí)質(zhì)性惡性腫瘤。生產(chǎn)方法： 傳統(tǒng)方法：培養(yǎng)動(dòng)物，從中分離 基因工程方法：克隆基因轉(zhuǎn)入細(xì)菌基因表達(dá) -純化蛋白 2、 疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng).傳統(tǒng)生產(chǎn)方法 ：滅活或減毒的病原物。缺點(diǎn)：有不良反應(yīng)?；蚬こ谭椒?：去除有毒基

10、因，根本解決致病性可食疫苗。3、 DNA藥物作用方式： 重組DNA藥物并轉(zhuǎn)入病變組織、細(xì)胞，發(fā)揮作用治療基因缺陷。 藥物蛋白基因轉(zhuǎn)入病人體內(nèi)表達(dá)后發(fā)揮作用。 DNA插入異常表達(dá)基因使其失活。DNA藥物的生產(chǎn)方法： 轉(zhuǎn)基因微生物發(fā)酵培養(yǎng) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺生產(chǎn)（二）轉(zhuǎn)基因植物1、轉(zhuǎn)化方法： 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 枝接轉(zhuǎn)化法：基因槍、電穿孔、聚乙二醇法2、受體細(xì)胞 愈傷組織(Callus) ,葉片, Protoplast(原生質(zhì)體) 種質(zhì)系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移：子房注射、花粉管通導(dǎo)等。3、轉(zhuǎn)入的基因抗病基因 抗病毒（病毒的外殼蛋白基因，煙草、馬鈴薯、大豆等） 抗細(xì)菌、抗真菌（從抗病品種中克隆

11、抗病基因轉(zhuǎn)入感病品種，抗白粉病、赤霉病的小麥）抗蟲基因 蘇云金桿菌的Bt殺蟲晶體蛋白基因。抗蟲棉花、煙草、馬鈴薯水稻等?？钩輨┓矫?如抗草甘磷的大豆。 抗除草劑機(jī)理：改變除草劑靶物的敏感性；轉(zhuǎn)入解毒基因。 抗逆境基因 抗旱、抗?jié)?、抗寒、抗熱和耐鹽等 改善作物品質(zhì) 如改善作物蛋白質(zhì)、克隆與淀粉、脂類合成相關(guān)的基因。 生物藥物 如疫苗、活性多肽的香蕉、番茄等。（三） 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物目的：改進(jìn)生產(chǎn)性狀例如：使家畜長(zhǎng)的更大、 奶牛產(chǎn)奶更多。 （四）其它方面 酶制劑工業(yè) 目前蛋白酶、淀粉酶基因已轉(zhuǎn)入E.coli. 并可E.coli.中生產(chǎn)。 保護(hù)環(huán)境： 制造可降解污染物的微生物。 “超級(jí)菌”、 “超級(jí)質(zhì)粒

12、”：辛烷、已烷和癸烷、二甲苯和甲苯、樟腦、萘，石油中的烴類化合物、重金屬、致癌物、農(nóng)藥和殺蟲劑食品工業(yè)：食品酶的生產(chǎn)化學(xué)工業(yè)：轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)化工產(chǎn)品：乙醇、丙酮、甘油.能源工業(yè): 生物柴油、燃料乙醇的生產(chǎn)。 1.3 基因工程的安全性問題v不同地區(qū)態(tài)度不同：v美國: 不能證明它危險(xiǎn)，就不應(yīng)該限制 .大力發(fā)展、始終處于領(lǐng)先地位v歐洲：不能證明它不危險(xiǎn)，就應(yīng)該限制 ；v多年的追求；一旦實(shí)現(xiàn)又無法消受v轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品是否對(duì)人有害?v尚無明確答案.v目前尚無轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)人造成危害的實(shí)例.v 1993年基因工程安全管理辦法，1996年農(nóng)業(yè)生物基因工程安全管理實(shí)施辦法，2001年農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例對(duì)基

13、因工程操作的各個(gè)環(huán)節(jié)做出嚴(yán)格規(guī)定。1.4 基因工程研究發(fā)展前景前景： 具有巨大的活力，前景不可限量。各國決策者均從戰(zhàn)略上擬定宏偉的基因工程相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展計(jì)劃。研究方向 基因組學(xué)、基因工程藥物、動(dòng)植物生物反應(yīng)器和環(huán)保等方面。2、基因是可切割的基因可被限制性核苷酸內(nèi)切酶切開。 5 ATCGCGATGGATCCGCGAT 3 3 TAGCGCTACCTAGGCGCTA 5 Cycle Plasmid DNA vector 線性化后，轉(zhuǎn)入酵母酵母可產(chǎn)生纖維素酶，遺傳性狀發(fā)生改變。(3) DNA連接酶 用于連接各種DNA片段，使不同基因重組.例如：T4 DNA 連接酶二 、應(yīng)用研究 （一） 藥物相關(guān)基因 最活躍發(fā)展最快的領(lǐng)域 主要種類有：1.活性多肽2.疫苗3.DNA藥物二 、應(yīng)用研究 （一） 藥物相關(guān)基因 最活躍發(fā)展最快的領(lǐng)域 主要種類有：1.活性多肽2.疫苗3.DNA藥物二 、應(yīng)用研究 （一） 藥物相關(guān)基因 最活躍發(fā)展最快的領(lǐng)域